एंजियोजिनेसिस जांच नवजात माउस रेटिना का पूरा पर्वत immunofluorescent धुंधला

Neuroscience

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Summary

नवजात murine रेटिना एक में angiogenesis मिलाना कि विभिन्न जीनों या दवाओं की भूमिका की जांच की अनुमति देता है angiogenesis की एक अच्छी तरह से विशेषता शारीरिक मॉडल, प्रदान करता है

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

Angiogenesis एक पूर्व मौजूदा पोत नेटवर्क से नए रक्त वाहिकाओं के अंकुरण से परिभाषित नए रक्त वाहिनियों के गठन की जटिल प्रक्रिया है. Angiogenesis जैसे कैंसर, अंधापन और इस्कीमिक रोगों के रूप में रक्त वाहिनियों के गठन dysregulated है जिसमें कई बीमारियों में भी न केवल अंगों और ऊतकों के सामान्य विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन. Angiogenesis के रोग में विशेष रूप से नई वाहिनियों के गठन के लिए प्रयास करें और विनियमित करने के लिए उपन्यास दवा के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है ताकि वयस्क जीवन में, रक्त वाहिकाओं आम तौर पर मौन हैं. बेहतर angiogenesis को समझने के लिए और इसे विनियमित करने के लिए उचित रणनीति विकसित करने के लिए, मॉडल सही शामिल हैं जो विभिन्न जैविक कदम दर्शाते हैं कि आवश्यक हैं. धमनियों, नसों और capillaries के जन्म के बाद पहले सप्ताह के दौरान एक नाड़ी जाल के लिए फार्म विकसित क्योंकि माउस नवजात रेटिना angiogenesis का एक उत्कृष्ट मॉडल उपलब्ध कराता है. यह मॉडल भी एक दो डि होने का लाभ दिया हैmensional (2 डी) संरचना अन्य संवहनी नेटवर्क की जटिल 3 डी शारीरिक रचना के साथ तुलना में सरल विश्लेषण कर रही है. जन्म के बाद अलग अलग समय पर रेटिना संवहनी जाल का विश्लेषण करके, यह खुर्दबीन के नीचे angiogenesis के विभिन्न चरणों का पालन करने के लिए संभव है. यह लेख isolectin और नाड़ी विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग एक माउस रेटिना की वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक सरल प्रक्रिया को दर्शाता है.

Introduction

Angiogenesis एक पूर्व मौजूदा पोत नेटवर्क से नए रक्त वाहिकाओं के गठन से परिभाषित किया गया है और कई संकेत दे रास्ते के द्वारा नियंत्रित किया जाता है एक जटिल विकास की प्रक्रिया है. इनमें से सबसे प्रमुख VEGF के मार्ग है. VEGF के पड़ोसी रक्त वाहिकाओं में अंकुरण वाहिकाजनक की दीक्षा से इस्कीमिक कोशिकाओं और सुराग द्वारा जारी की है. अंकुर एक नई नाड़ी से अग्रणी endothelial सेल VEGF के स्रोत की ओर बाहर तक पहुँचने कि filopodia पैदा करता है जो एक 'टिप' सेल, है, और 'डंठल' endothelial कोशिकाओं proliferating के बाद है. इस तरह, सक्रिय endothelial कोशिकाओं विस्थापित और वे नए संवहनी ट्यूबों फार्म जहां एक avascular क्षेत्र के प्रति पैदा करना. रक्त प्रवाह का समर्थन करने के लिए इन ट्यूबों को स्थिर करने के लिए, endothelial कोशिकाओं pericytes और नए रक्त वाहिकाओं 1 चारों ओर जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ बातचीत. Angiogenesis भ्रूण और बढ़ ऊतकों के vascularization के लिए आवश्यक है. हालांकि, यह भी कई pathologi के लिए योगदानइस तरह के कैंसर के रूप में कैलोरी विकार, angiogenesis में दोष इस्कीमिक रोगों के साथ जुड़े रहे हैं. रोग के उपचार के एक साधन के रूप में angiogenesis को विनियमित करने के लिए प्रभावी दवा उपचार के विकास के बहुत रुचि है इसलिए. उदाहरण के लिए, प्रभावी विरोधी angiogenic कारकों, कैंसर के विकास को कम समर्थक angiogenic रणनीतियों इस्कीमिक रोग के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है whilst जाएगा. इस प्रकार, angiogenesis के मॉडल बेहतर नई वाहिनियों के गठन की और संवहनी विकास को बढ़ाने या कम करने के लिए नए उपचार रणनीति विकसित करने के लिए नियमन को समझने के लिए आवश्यक हैं.

Angiogenesis अनुसंधान का एक मौलिक तत्व एक उपयुक्त संवहनी मॉडल का विकल्प है. इन विट्रो मॉडल में कई ऐसे endothelial सेल प्रवास, प्रसार और अस्तित्व 2,3 के रूप में angiogenesis की बुनियादी कदम पुन: पेश करने के लिए डिजाइन किया गया है. अक्सर इन विट्रो परख में इस्तेमाल किया, हालांकि टी, एक Matrigel मैट्रिक्स पर endothelial कोशिकाओं की एक branched नेटवर्क के गठन हैउसकी endothelial कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है, न ही यह आमतौर पर pericytes या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के समर्थन को शामिल करता है. ऐसे embryoid शरीर परख, महाधमनी रिंग परख और भ्रूण प्रपदिकीय परख के रूप में माउस अंग संस्कृति का उपयोग कर पूर्व vivo अंकुरण angiogenesis के आकलन अतिरिक्त समर्थन कोशिकाओं के संदर्भ में endothelial कोशिकाओं की angiogenesis के विश्लेषण की अनुमति देता है. हालांकि, इन assays के मुख्य सीमाओं के विश्लेषण के लिए एक सीमित खिड़की दे रही है, रक्त प्रवाह की कमी और समय पर जहाजों की प्रतिगमन शामिल हैं. इसलिए, अधिक सही angiogenesis के विनियमन को समझने के लिए, vivo मॉडल में के रूप में अच्छी तरह से पिछले अंग ischemia के मॉडल के रूप में, इस तरह के subcutaneously प्रत्यारोपित स्पंज या Matrigel प्लग का उपयोग कर माउस में विकसित उन के रूप में आवश्यक हैं. हालांकि, इन मॉडलों neovessels की जटिल 3 डी वास्तुकला के कारण का विश्लेषण करने की चुनौती दे रहे हैं. इसके विपरीत, zebrafish भ्रूण पूरे visualizing angiogenesis के लिए एक शानदार मॉडल साबित कर दिया हैजीव 4. हालांकि, माउस माउस कई मामलों में एक पसंदीदा मॉडल बनाने, evolutionarily को और अधिक बारीकी से zebrafish से मानव से संबंधित है. नतीजतन प्रसव के बाद माउस रेटिना के angiogenesis को angiogenesis अनुसंधान के लिए पसंद की एक अच्छी तरह से विशेषता विधि का प्रतिनिधित्व करता है. यह एक मनोवैज्ञानिक की स्थापना, लेकिन यह भी आसानी से उपयुक्त फ्लोरोसेंट दाग का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि एक 2 डी संवहनी जाल प्रदान करता है न केवल. पोत नेटवर्क, endothelial प्रसार, अंकुरण, परिवाहकीय सेल भर्ती और पोत remodeling के वास्तुकला सब इस तकनीक का उपयोग कर जांच की जा सकती है.

नवजात माउस रेटिना में, रेटिना की रक्त वाहिकाओं के विकास को प्रसव के बाद जीवन के पहले सप्ताह में होता है. चूहे, मनुष्यों के विपरीत, अंधा पैदा होते हैं और retinas के जन्म के बाद ही vascularized हो जाते हैं. रेटिना वाहिकाओं प्रसव के बाद दिन 0 (P0) में ऑप्टिक तंत्रिका रेटिना करीब के केंद्र से उत्पन्न होती हैं, और एक अत्यधिक व्यवस्थित करने के लिए फार्म angiogenesis के द्वारा विकसितलगभग P8 5 से रेटिना की परिधि तक पहुँच जाता है कि घ संवहनी जाल. रक्त वाहिकाओं केशिका जाल धीरे - धीरे एक बीच केशिका नेटवर्क के साथ धमनियों और नसों की एक नियमित रूप से बारी पैटर्न उत्पन्न करने के लिए परिधि की ओर ऑप्टिक डिस्क से बाहर की ओर बढ़ के साथ एक विशेषता तरीके से विकसित करना. रेटिना वाहिका संरचना इस प्रकार यह अपेक्षाकृत आसान फ्लैट माउंट तैयारी 5 में रेटिना वाहिका संरचना की जांच के लिए बना रही है, वे अनिवार्य रूप से एक 2 डी विमान है क्या में बढ़ने के रूप में जहाजों को आसानी से पहचाना जा सकता है के रूप में angiogenesis को अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल उपलब्ध कराता है. कई घंटे पूर्व vivo अधिक एन्दोथेलिअल टिप सेल प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए माउस नवजात रेटिना अलग करने के लिए एक विधि 6 सूचित किया गया है. वैकल्पिक रूप से, पूरे रेटिना वाहिका संरचना और संबद्ध संवहनी मार्कर के एक अधिक विस्तृत जांच के विकास के विभिन्न चरणों में तय रेटिना नमूनों की immunostaining की आवश्यकता है.

यहाँ हम प्रदान करते हैंहम खुर्दबीन के नीचे अंतिम इमेजिंग को धुंधला प्रोटोकॉल के माध्यम से (भी 7 देखें) प्रसव के बाद आंख की प्रारंभिक स्पष्टीकरण से murine रेटिना संवहनी जाल, के पूरे माउंट धुंधला के लिए उपयोग करें कि एक विश्वसनीय और तकनीकी रूप से सीधे आगे विधि का विस्तृत वर्णन.

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Protocol

जब तक अन्यथा इंगित सभी कदम, कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं.

1. प्रसव के बाद आंखें के स्पष्टीकरण और फिक्सेशन

  1. उसकी तरफ से पिल्ला नम्रता मारे माउस प्लेस, कैंची से आंख को कवर त्वचा को हटा दें.
  2. आँख पता लगाना करने के लिए कैंची और संदंश का प्रयोग करें.
  3. Enucleated आंख के नीचे जगह कैंची, ऑप्टिक तंत्रिका और आसपास के ऊतकों में कटौती और आंख बाहर उठा. कमरे के तापमान पर 2x पीबीएस में बना 4% paraformaldehyde (पीएफए) युक्त एक 24 अच्छी तरह से थाली पर स्थानांतरण.
  4. हर आंख 10 के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं - 10 मिनट - 15 मिनट, फिर 5 के लिए बर्फ पर ठंड 2x पीबीएस को हस्तांतरण. यह निर्धारण की डिग्री प्रत्येक आंख के लिए बराबर है सुनिश्चित करने के लिए enucleations और बाद के निर्धारण लड़खड़ाहट के लिए सबसे अच्छा है.

2. प्रसव के बाद Murine retinas के विच्छेदन

  1. 2x पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में ट्रांसफर आँखें एक disse तहत बोर और जगह को चौड़ा करने के लिए काट दिया गया है कि एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोगमाइक्रोस्कोप cting.
  2. संदंश और कैंची का उपयोग आंख के आसपास किसी भी वसा निकालें.
  3. पियर्स तेज कैंची से कॉर्निया के किनारे और कॉर्निया और परितारिका और त्यागने के आसपास कटौती.
  4. रेटिना और श्वेतपटल के बीच संदंश डालें और रेटिना के लिए आंसू नहीं ख्याल रख रही श्वेतपटल हटा दें. रंजित परत भी हटाया जा सकता है, लेकिन इस चरण के दौरान होने वाली रेटिना को नुकसान का खतरा है, रंजित परत यह काफी immunostaining की गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करना चाहिए पर छोड़ा जा सकता है.
  5. लेंस और संदंश का उपयोग कर शीशे हास्य निकालें.
  6. ठीक संदंश के साथ आंख के बीच में उन्हें एक साथ एकत्र करके hyaloids जहाजों को हटा दें तो जल्दी से रेटिना के केंद्र (वैकल्पिक रूप से ठीक कैंची के साथ काँचाभ वाहिकाओं के आधार पर कटाव) से दूर खींच.
  7. एक साफ पेट्री डिश में पीबीएस के साथ कप के आकार का रेटिना कुल्ला.
  8. वसंत scisso उपयोग कर रेटिना की त्रिज्या का लगभग 2/3 तक पहुँचने के 4 से 5 रेडियल चीरों बनाओरुपये के एक 'पत्ती' आकार बनाने के लिए.
  9. पीबीएस रेटिना समतल करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर, और फिर शोषक कागज का एक छोटा सा टुकड़ा के साथ किसी भी अतिरिक्त पीबीएस हटाने बंद ड्रा.
  10. धीरे धीरे पिपेट ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) रेटिना की सतह पर ड्रॉप द्वारा मेथनॉल ड्रॉप पूरी तरह से अतिरिक्त मेथनॉल के साथ फिर बाढ़ कवर और जब तक. यह रेटिना को ठीक करने और permeabilization सुविधा होगी मदद मिलेगी. रेटिना सफेद बंद हो जाएगा.
  11. बोर को चौड़ा करने के लिए काट दिया गया है कि एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक 2 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरण.
  12. Immunostaining के साथ आगे बढ़ने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए ठंडे मेथनॉल में रेटिना छोड़ दें. यहां इस्तेमाल किया एंटीबॉडी में से केवल VE-cadherin मेथनॉल निश्चित रेटिना पर सफलतापूर्वक इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. इस मामले में रेटिना चरण 9 के बाद immunostaining के लिए सीधे आगे बढ़ना की जरूरत है.
  13. यदि आवश्यक हो तो ऊपर पहले धुंधला करने के लिए कई महीनों के लिए, रेटिना -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में संग्रहित किया जा सकता है.

3. इम्यूनो / रेटिना Vascu की isolectin धुंधलाविधायिका

  1. ध्यान हटाने / मेथनॉल टपकना और धीरे (इस स्तर पर रेटिना कदम ऊपर 11 से ही 2 मिलीलीटर ट्यूब में अब भी है) पीबीएस में संक्षेप में रेटिना कुल्ला.
  2. पेर्म / ब्लॉक समाधान के 100 μl के साथ पीबीएस और कवर रेटिना निकालें (पीबीएस + 0.3% ट्राइटन + 0.2% बीएसए) + 5 उपयुक्त सीरम का% (1 टेबल देखें) और 1 घंटे के लिए धीरे से हिला.
  3. कोमल 4 में रात मिलाते डिग्री सेल्सियस 100 चयनित प्राथमिक एंटीबॉडी के μl (1 टेबल देखें) और / या IsolectinB4, पेर्म / ब्लॉक में गिराए द्वारा तैयार सब साथ साथ retinas के ब्लॉक और सेते / पेर्म निकालें.
  4. एंटीबॉडी / isolectin निकालें और रेटिना 4 धो पीबीएस में एक्स 10 मिनट + 0.3% ट्राइटन (PBSTX).
  5. कुछ मामलों में, IsolectinB4-Alexa488 या एक सीधे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ जैसे निम्नलिखित धुंधला हो जाना, एक माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है और रेटिना (चरण 7) सीधे रखा जा सकता है. एक unconjugated प्राथमिक एंटीबॉडी उपयुक्त स्त्राव के 100 μl तो चरण 3 में इस्तेमाल किया गया है जबयह विशेषण बनाने के लिए प्रयुक्त होता है माध्यमिक एंटीबॉडी (PBSTX में 1/200 पतला) जोड़ा और 4 ° C पर या कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए रात भर सेते के लिए छोड़ दिया जाता है.
  6. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और 2 मिलीलीटर PBSTX में retinas 4 एक्स 15 मिनट धो लो.
  7. एक विस्तृत बोर प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग स्लाइड पर retinas के स्थानांतरण और absorbant ऊतक के साथ अतिरिक्त PBSTX हटा दें. के 50 μl जोड़कर माउंट रेटिना रेटिना पर एक coverslip और धीरे स्थिति पर mountant लम्बा.
  8. स्थानांतरण वे लम्बा mountant स्थापित करने के लिए अनुमति देने के लिए, फ्लैट और प्रकाश से सुरक्षित हैं सुनिश्चित करना है कि 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात फ्रिज के लिए स्लाइड.
  9. छवि रेटिना एक confocal खुर्दबीन या एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर.

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Representative Results

विच्छेदन के बाद रेटिना एक फ्लैट फूल (चित्रा 1) की तरह दिखना चाहिए. ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, endothelial कोशिकाओं विरोधी अल्फा चिकनी पेशी actin (चित्रा 2) का उपयोग करते हुए देखे जाते हैं isolectin बी 4-Alexa488 धुंधला का उपयोग और नाड़ी की मांसपेशी कोशिकाओं का समर्थन देखा जा सकता है. चित्रा 2 में एक 5X उद्देश्य का उपयोग कम बिजली दृश्य रेटिना की नाड़ी संगठन के एक सिंहावलोकन देता है. इसके अलावा, ऊपर प्रोटोकॉल में दी गई एंटीबॉडी का एक अलग संयोजन का उपयोग करके, endothelial कोशिकाओं विरोधी CD31 immunostaining और समर्थन pericytes NG2 (चित्रा 3) या desmin (चित्रा 4) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए देखा जाता है का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है. विरोधी desmin धुंधला pericytes की प्रक्रियाओं की तरह उंगली visualizing और वे बारीकी से endothelial कोशिकाओं के साथ जुड़े रहे हैं निर्धारित करने के लिए उपयोगी है. इसके विपरीत, विरोधी NG2 धुंधला जो उपयोगी है जब प्रत्येक pericyte के नाभिक की रूपरेखावाहिका संरचना पर pericyte कोशिकाओं की संख्या बढ़ाता है. यह एक उच्च शक्ति (जैसे 60X) उद्देश्य का उपयोग देखने के क्षेत्र के प्रति कोशिकाओं की संख्या की गणना के द्वारा किया जाएगा. आवश्यक हो तो, एंटीबॉडी के वैकल्पिक संयोजन भी (1 टेबल देखें) का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, विरोधी कोलेजन चतुर्थ संवहनी तहखाने झिल्ली दृश्यमान करने के लिए उपयोगी है. Endothelial कोशिकाओं के लिए दाग दिया गया है कि retinas ऐसे रेटिना के किनारे की ओर केंद्र, संवहनी घनत्व और पोत शाखाओं आवृत्ति से vasculature की प्रगति के रूप में angiogenesis की प्रमुख विशेषताओं के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. तुरंत विच्छेदन और मेथनॉल के अलावा के बाद एक नवजात रेटिना का प्रस्तुतिकरण. यह छवि एक Zeiss STEMI SV6 और AxioCam मानव संसाधन का उपयोग कर लिया जाता है ग कैमरा.

चित्रा 2
चित्रा 2. Isolectin बी 4-Alexa488 (हरा) (ए) के साथ पूरे माउंट रेटिना (उम्र P7) के immunostaining, विरोधी अल्फा चिकनी पेशी actin-Cy3 (लाल) (बी) या विलय (सी). इन छवियों को एक Zeiss axioimager के साथ लिया जाता है और कर रहे हैं एक 5X उद्देश्य का उपयोग AxioCam मानव संसाधन विकास मंत्री कैमरा. धमनियों और नसों की बारी पैटर्न ध्यान दें. धमनियों तुरंत उन्हें चारों ओर से घेरे है कि केशिका मुक्त क्षेत्र द्वारा मान्यता प्राप्त हैं, और अल्फा चिकनी पेशी actin के लिए (लाल) सकारात्मक दाग जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ लेपित हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 3 विरोधी CD31 प्राथमिक एंटीबॉडी (Alexa488 संयुग्मित विरोधी चूहा आईजीजी, हरे, एक साथ पाया) के साथ पूरे माउंट रेटिना (पी 6 साल की उम्र) की डबल immunostaining के;. को विरोधी खरगोश आईजीजी संयुग्मित के साथ पकड़ा, और विरोधी NG2 प्राथमिक एंटीबॉडी एलेक्सा 594 (लाल, बी). ये confocal छवियों 13 जेड स्लाइस, 0.47 माइक्रोन मोटाई से प्रत्येक से लेजर स्कैनिंग छवियों के संयोजन एक 60X उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया. सी में छवियों का आच्छादन CD31 पॉजिटिव endothelial कोशिकाओं (हरा) और NG2 पॉजिटिव pericytes (लाल) से पता चलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4 विरोधी CD31 प्राथमिक एंटीबॉडी (Alexa488 संयुग्मित विरोधी चूहा आईजीजी, हरे, एक साथ पाया) के साथ पूरे माउंट रेटिना (पी 6 साल की उम्र) की डबल immunostaining के;. को विरोधी खरगोश आईजीजी संयुग्मित के साथ पकड़ा, और विरोधी desmin प्राथमिक एंटीबॉडी एलेक्सा 594 (लाल, बी). ये confocal छवियों 21 जेड स्लाइस, 0.24 माइक्रोन मोटाई से प्रत्येक से लेजर स्कैनिंग छवियों के संयोजन एक 60X उद्देश्य का उपयोग कर लिया गया. सी में छवियों का आच्छादन CD31 पॉजिटिव endothelial कोशिकाओं (हरा) और desmin पॉजिटिव pericytes (लाल) से पता चलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

<p> पेर्म ब्लॉक केवल
प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने कार्य करना अवरुद्ध समाधान (सीरम + पेर्म / ब्लॉक) माध्यमिक एंटीबॉडी
विरोधी NG2 (Chondroitin सल्फेट proteoglycan) 1:250 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 594
विरोधी GFAP 1:500 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी माउस एलेक्सा 488
विरोधी Desmin 1:500 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 594
विरोधी कोलेजन चतुर्थ 1:200 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी खरगोश एलेक्सा 594
विरोधी endoglin 1:100 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा 594
विरोधी CD31 1:500 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा 488
विरोधी VE-cadherin 1:10 5% बकरी सीरम बकरी विरोधी चूहा एलेक्सा 594
विरोधी Alk1 1:25 5% गधा सीरम गधा विरोधी बकरी एलेक्सा 594
विरोधी ASMA-Cy5 1:100 एन / ए

तालिका 1. पूरे माउंट retinas के immunofluorescent धुंधला के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के उदाहरण हैं.

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Discussion

यहाँ प्रस्तुत विधि यह angiogenesis के एक आसानी से व्यावहारिक और physiologically प्रासंगिक मॉडल बनाने, नवजात माउस retinas का दाग पूरी माउंट तैयारी की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करता है. प्रारंभ में, माउस आंख अपने छोटे आकार और दुनिया आकार की वजह से टुकड़े करना काफी मुश्किल हो सकता है, कुछ अभ्यास और अच्छा विच्छेदन उपकरण विश्वसनीय परिणामों के लिए जरूरत है तो. इस आंख से पानी की कमी की एक छोटी राशि का कारण बनता है और विच्छेदन की सुविधा जो अंतर कक्षीय दबाव, कम कर देता है क्योंकि पीबीएस के 2x एकाग्रता में तैयार आंखों के विच्छेदन महत्वपूर्ण है. रेटिना की अच्छी तैयारी कई कारणों से महत्वपूर्ण है. पहले यह vasculature की अखंडता बनाए रखता है. शीशे जैसा वाहिका संरचना अच्छी तरह से नहीं हटाया जाता है तो दूसरा, यह पृष्ठभूमि के उच्च स्तर के लिए अग्रणी एंटीबॉडी धुंधला की क्षमता कम कर देता है और संकल्प की कमी हुई. रेटिना के पीएफए ​​निर्धारण समय बहुत लंबा है, तो यह समस्या भी हो सकती है. हालांकि,पहले धुंधला करने के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में मेथनॉल में कई महीनों के लिए लंबी अवधि के भंडारण के ऊपर पहले isolectin धुंधला करने के लिए और तालिका 1 में एंटीबॉडी के लिए सबसे अधिक उपयुक्त है. Isolectin धुंधला शायद ही समस्याग्रस्त है, यह endothelial कोशिकाओं के अलावा दाग मैक्रोफेज करता है. पूरे माउंट retinas के अच्छे immunostaining के लिए, एंटीबॉडी के चुनाव महत्वपूर्ण है और धुंधला प्रोटोकॉल पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं जब बैचों के बीच भिन्न हो सकते हैं जो एंटीबॉडी विशिष्टता और एकाग्रता के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए. उच्च पृष्ठभूमि आमतौर पर, एंटीबॉडी एकाग्रता को कम धोने के समय में वृद्धि या धोने के कदम के लिए अधिक डिटर्जेंट जोड़ने के द्वारा कम किया जा सकता है. निर्माता द्वारा संकेत के रूप में एंटीबॉडी आगमन पर aliquoted और जमा हो जाती है. -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है कि उन लोगों के लिए काम कर रहे एक विभाज्य विगलन फ्रीज के दोहराया चक्र से बचने के लिए फ्रिज में रखा जाता है. उज्ज्वल फ्लोरोसेंट धब्बे, दाग नमूना पर विशेष रूप से अगर आते हैं तो यह भी मौजूद हैऊतक के आसपास के क्षेत्र में, इस एंटीबॉडी से उपजी समुच्चय का उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए 10,000 rpm के लिए एंटीबॉडी centrifuging द्वारा बाद के सभी प्रयोगों में हटा दिया जाना चाहिए जो मौजूद हैं का पता चलता है. वर्तमान में हमारी प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के कुछ उपयुक्त कमजोर पड़ने (1 टेबल) के साथ सामग्री की सूची में हैं. एंटीबॉडी के एक संगत संयोजन का चयन प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के बीच अवांछित पार प्रतिक्रिया से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. सेल प्रसार पहले ऊतक कटाई करने BrdU के लगभग दो घंटे के लिए एक समाधान के साथ चूहों इंजेक्शन द्वारा नजर रखी जा सकती है. इस थाइमिन अनुरूप डीएनए proliferating में शामिल किया है और पहले से 8 वर्णित के रूप में, एक विशिष्ट विरोधी BrdU एंटीबॉडी का उपयोग कर पाया जा सकता है.

प्रत्येक रेटिना बहुत नाजुक है, लेकिन प्रोटोकॉल के माध्यम से काम कर रहे धीरे ऊतक के इलाज से अलग संवहनी मार्कर के लिए कलंकित किया जा सकता है. नियंत्रण की एक संख्या में शामिल किए गए हैंप्रत्येक प्रयोग धुंधला की विशिष्टता दिखाने के लिए. इलाज retinas के कम से कम होना चाहिए जो ऊतकों में autofluorescence के डिग्री, खोलेगा. एक प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण नहीं ऊतकों को माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर विशिष्ट बंधन के निर्धारण की अनुमति देगा. गलती से विच्छेदन के दौरान फाड़ा गया है कि retinas नियंत्रण के लिए उपयोगी ऊतक प्रदान कर सकते हैं. स्लाइड्स अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है के रूप में बढ़ते के बाद, फ्लोरोसेंट धुंधला लंबे समय के रूप में कई दिनों के लिए बरकरार रखा है. Epifluorescent माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग ध्यान केंद्रित प्रकाश से बाहर निकाल देता है जो एक Apotome, के उपयोग से सुधार हुआ है. वैकल्पिक रूप से, confocal माइक्रोस्कोपी सही सेल विशेष इमेजिंग (आंकड़े 3 और 4) प्रदान करता है.

यह विधि कई संभावित आवेदन किया है. यह angiogenesis को विनियमित कि महत्वपूर्ण जीनों Cre पर loxP आनुवंशिकी 8-10 inducible का उपयोग करता है कि काम शामिल है, समाप्त हो रहे हैं, जिसमें चूहों को लागू किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से रेटिना angiogenesis को हो सकता हैपूछताछ निम्न दवा उपचार उनके समर्थक या विरोधी angiogenic प्रभाव 11 की जांच के लिए या तो प्रणालीबद्ध या अंतर प्रत्यक्ष प्रमाण द्वारा दिया जाता है. यह उपलब्ध ट्रांसजेनिक उपकरणों का लाभ लेने के लिए और रेटिना वाहिका 11,12 के प्रमुख तत्वों में कल्पना करने के लिए GFP या आरएफपी ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करने के लिए भी संभव है. (कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस में 4% पीएफए ​​का उपयोग कर निर्धारण से पहले ट्रांसजेनिक चूहों से इमेजिंग अंतर्जात GFP या रेटिना में आरएफपी के लिए प्रोटोकॉल के कदम 2.12 लिए मेथनॉल के स्थान पर प्रयोग किया जाता है कि ध्यान दें.) इसके अलावा, आणविक संकेत का अध्ययन करने के क्रम में तंत्र, यह स्वस्थानी संकरण 13 में उपयोग कर रेटिना जाल में विशिष्ट जीन की mRNA अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए उपयोगी है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम वेलकम ट्रस्ट और ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

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References

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Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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