Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Неонатальной мышиной сетчатки обеспечивает хорошо характеризуется физиологической модели ангиогенеза, который позволяет исследования роли различных генов или наркотиков, которые модулируют ангиогенеза в

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ангиогенез представляет собой сложный процесс образование новых кровеносных сосудов определяется прорастание новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети. Ангиогенез играет ключевую роль не только в нормальном развитии органов и тканей, но и во многих заболеваний, при которых образование кровеносных сосудов является нарушение регуляции, таких как рак, слепоту и ишемических заболеваний. Во взрослой жизни, кровеносные сосуды, как правило, так покоя ангиогенеза является важной мишенью для разработки лекарств романа, чтобы попытаться регулировать образование новых кровеносных частности, в болезни. Для того, чтобы лучше понять, ангиогенез и разработать соответствующие стратегии для регулирования его, требуются модели, которые точно отражают различные биологические шаги, которые участвуют. Сетчатки новорожденных мышей обеспечивает отличную модель ангиогенеза, поскольку артерии, вены и капилляры развиваются, чтобы сформировать сосудистого сплетения в течение первой недели после рождения. Эта модель также имеет то преимущество, что два-димерные (2D) структуры делает анализ простым по сравнению со сложными 3D анатомии других сосудистых сетей. Путем анализа сосудов сетчатки сплетения в различные моменты времени после рождения, можно наблюдать различные этапы ангиогенеза под микроскопом. В данной статье рассматривается простой процедуры анализа сосудистой сетчатки мыши с помощью флуоресцентного окрашивания isolectin и сосудистых специфических антител.

Introduction

Ангиогенез представляет собой сложный процесс развития определяется образование новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети и регулируется несколькими путями передачи сигналов. Наиболее известным из них является VEGF пути. VEGF высвобождается ишемических клеток и приводит к инициированию ангиогенеза в соседних кровеносных сосудов. Ведущим эндотелиальных клеток из нового сосудистого прорастают является клетка 'чаевые', которое производит филоподии, что протянуть руку по направлению к источнику VEGF, и сопровождается пролиферирующих эндотелиальных клеток стебля. Таким образом, активированные эндотелиальные клетки мигрируют и пролиферируют в направлении лишенной сосудов области, где они образуют новый сосудистых трубок. Для того чтобы стабилизировать эти трубы, чтобы поддерживать кровоток, эндотелиальные клетки взаимодействуют с перицитов и гладкомышечных клетках, которые окружают новых кровеносных сосудов 1. Ангиогенез является существенным для васкуляризации эмбриона и рост тканей. Однако, это также способствует развитию многих патологическихкал заболеваний, таких как рак, тогда как дефекты в ангиогенез, связанный с ишемической болезнью. Разработка эффективных лекарств для регулирования ангиогенеза в качестве средства лечения болезни поэтому представляет большой интерес. Например, эффективные анти-ангиогенных факторов приведет к снижению роста опухоли, в то время проангиогенные стратегии могут быть использованы для лечения ишемических заболеваний. Таким образом, модели ангиогенеза необходимы, чтобы лучше понять регулирование образование новых кровеносных и для разработки новых терапевтических стратегий для повышения или уменьшения роста сосудов.

Основополагающим элементом ангиогенеза исследования является выбор подходящего сосудистой модели. Многие в пробирке модели были разработаны для воспроизведения основные этапы ангиогенеза, таких как миграция эндотелиальных клеток, пролиферацию и выживание 2,3. Часто используемым в анализе пробирке является формирование разветвленной сети эндотелиальных клеток на матрицу Матригель, хотя тего не является специфичным для эндотелиальных клеток, а также не обычно включают поддержку перицитов и гладкомышечных клеток. Оценка исключая виво прорастание кровеносных сосудов использованием культуры мышь органов, таких как эмбриональные анализ тела, аортальный анализа кольцо и плода плюсневой анализ позволяет проводить анализ ангиогенеза эндотелиальные клетки в контексте дополнительных вспомогательных клеток. Однако основным ограничения этих анализов включают отсутствие кровотока и регрессии сосудов с течением времени, что дает ограниченное окно для анализа. Поэтому, чтобы понять регуляции ангиогенеза, точнее, в естественных условиях модели требуются например, разработанных в мыши с помощью подкожно имплантировали губки или Матригель зажигания, а также задние модели ишемии нижних конечностей. Тем не менее, эти модели являются сложными для анализа из-за сложных 3D архитектуру новых сосудов. В противоположность этому, данио эмбриона оказалось отличной моделью для визуализации ангиогенеза в целоморганизма 4. Тем не менее, мышь эволюционно гораздо более тесно связаны с человеческим, чем данио рерио, что делает мышь предпочтительной моделью во многих случаях. Следовательно ангиогенеза послеродовой сетчатки мыши представляет собой хорошо охарактеризованы методом выбора для исследования ангиогенеза. Это не только обеспечивает физиологический установки, но и 2D-сосудистом сплетении, которые можно легко визуализируют с использованием соответствующих флуоресцентных красителей. Архитектура сети судна, пролиферацию эндотелиальных, прорастание, периваскулярные набора клеток и сосудов реконструкции могут быть исследованы с помощью этой техники.

В неонатальный сетчатки мыши, развитие кровеносных сосудов сетчатки происходит в первые недели постнатальной жизни. Мыши, в отличие от людей, рождаются слепыми и сетчатка стала васкуляризированной только после рождения. Сосудов сетчатки возникают в центре сетчатки близко к зрительному нерву в постнатальный день 0 (Р0), а также разработать ангиогенезом с образованием сильно организоватьD сосудистого сплетения, которое достигает периферии сетчатки примерно на 5 P8. Кровеносные сосуды развивать характерным образом с капиллярной сплетение постепенно возрастает в направлении от диска зрительного нерва к периферии, чтобы генерировать регулярное чередование артерий и вен с промежуточным капиллярной сети. Сосудистой сети сетчатки обеспечивает идеальную модель для изучения ангиогенеза как сосуды могут быть легко идентифицированы, как они растут в том, что по существу является 2D плоскости, что делает его относительно легко изучить сосудистой сети сетчатки в плоской горы препаратов 5. Способ выделения мышью сетчатки новорожденных для анализа эндотелиальные клеточные ответы опрокинуться естественных условиях несколько часов бывший сообщалось 6. Кроме того, более детальное исследование всей сосудистой сети сетчатки и связанные с ними сосудистые маркеры требует иммуноокрашивания фиксированных экземпляров сетчатки на разных стадиях развития.

Здесь мы предлагаемПодробное описание надежный и технически прямой метод, который мы используем для целом окрашивания горе мышиных сетчатки сосудистого сплетения, от начального энуклеации послеродовой глаза (см. также 7) через протоколы окрашивания до конечного изображения под микроскопом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все стадии проводили при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Энуклеация и фиксации Послеродовая Глаза

  1. Наведите мышь умерщвлены гуманным щенка на бок, снимите кожу, покрывающую глаз с помощью ножниц.
  2. Используйте ножницы и щипцы, чтобы выяснять глаз.
  3. Место ножницами ниже энуклеированными глаза, вырезать зрительном нерве и окружающих тканей и вынуть глаз. Переход на 24-луночный планшет, содержащий 4% параформальдегида (PFA) состоит в 2х PBS при комнатной температуре.
  4. Позвольте каждому глазу, чтобы исправить в течение 10 - 15 мин, а затем перенести в холодное 2x PBS на льду в течение 5 - 10 мин. Лучше всего, чтобы поразить enucleations и последующей фиксации для обеспечения степень фиксации равна для каждого глаза.

2. Рассечение Послеродовая мышиной сетчатки

  1. Передача глаза в чашку Петри, содержащую 2x PBS с помощью пластиковой пипетки Пастера, который был сокращен, чтобы расширить отверстие и место под Dissecting микроскопом.
  2. Удалите жир вокруг глаз с помощью пинцета и ножниц.
  3. Пирс края роговицы с острыми ножницами и вырезать вокруг роговицы и радужной оболочки глаза и выбросить.
  4. Вставьте пинцет между сетчаткой и склерой и удалить склеры стараясь не оторвать сетчатки. Слой сосудистой оболочки глаза также могут быть удалены, но если есть риск повреждения сетчатки, происходящих во время этого этапа, сосудистой оболочки слой может быть оставлен, поскольку это не должно значительно влиять на качество иммунной окраски.
  5. Снимите объектив и стекловидного тела с помощью щипцов.
  6. Снимите hyaloids сосудов, собирая их вместе в центре глаза с тонким пинцетом Затем быстро подними от центра сетчатки (альтернативно СНиП у основания гиалоидная сосуды с тонкими ножницами).
  7. Промойте чашеобразных сетчатки с PBS в чистую чашку Петри.
  8. Сделать 4 до 5 радиальных надрезов достижении примерно 2/3 радиуса сетчатки с помощью пружинных scissoRS создать «лепесток» формы.
  9. Слить PBS помощью пипетки Пастера, чтобы сгладить сетчатки, а затем удалите остатки PBS с небольшой кусочек впитывающей бумаги.
  10. Медленно пипетки холодную (-20 ° С) метанола по капле на поверхности сетчатки, пока полностью не покрыты, а затем наводнения с дополнительным количеством метанола. Это поможет исправить сетчатки и будет способствовать проницаемости. Сетчатки станет белым.
  11. Трансфер в 2 мл трубки с помощью пластиковой пипетки Пастера, который был сокращен, чтобы расширить отверстие.
  12. Оставьте сетчатки холодным метанолом в течение по крайней мере 20 минут, прежде чем приступить иммунной окраски. Из антитела, используемые здесь, только VE-кадгерина не может быть успешно использован в метаноле фиксированной сетчатки. В этом случае нужно сетчатки перейти прямо к иммунным после шага 9.
  13. При необходимости сетчатки могут быть сохранены в метаноле при -20 ° C в течение нескольких месяцев до окрашивания.

3. Иммуно / isolectin окрашивания сетчатки Vasculature

  1. Осторожно снимите / слить метанола и осторожно промыть сетчатки кратко в PBS (на данном этапе сетчатка все еще находится в той же 2 мл трубку из п. 11 выше).
  2. Снимите крышку и PBS сетчатки со 100 мкл Пермь / Блок раствор (PBS + 0,3% Тритон + 0,2% BSA) + 5% от соответствующей сыворотки (см. таблицу 1) и слегка встряхнуть в течение 1 часа.
  3. Удалить Пермский край / Блок и инкубировать сетчатки при осторожном встряхивании в течение ночи при 4 ° С с 100 мкл выбранного основного антитела (см. таблицу 1) и / или IsolectinB4, приготовленные путем разведения в Перми / Block.
  4. Удалить антитело / isolectin и мыть сетчатки 4 х 10 мин в PBS + 0,3% Тритон (PBSTX).
  5. В некоторых случаях, например, следующим окрашиванием IsolectinB4-Alexa488 или непосредственно конъюгированное первичного антитела, вторичное антитело не требуется, и сетчатки может быть установлен непосредственно (стадия 7). Когда неконъюгированный первичных антител был использован на шаге 3, затем 100 мкл соответствующего фторescent вторичным антителом (разведенного 1/200 в PBSTX) добавляли и оставляли для инкубации в течение ночи при 4 ° С и в течение 4 ч при комнатной температуре.
  6. Удалить вторичными антителами и мыть сетчатки 4 х 15 мин в 2 мл PBSTX.
  7. Передача сетчатки на слайды, используя широкие пластиковые отверстие пастеровской пипетки и удалить избыток PBSTX с абсорбентом ткани. Горы сетчатки путем добавления 50 мкл Продли mountant на покровное и осторожно позицию по сетчатке.
  8. Передача слайды холодильнике в течение ночи при 4 ° С, гарантируя, что они плоские и защищенном от света месте, с тем чтобы продлить mountant установить.
  9. Изображение сетчатки помощью конфокальной микроскопии или эпифлуоресцентной микроскопом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После вскрытия сетчатки должна выглядеть плоской цветок (рис. 1). При использовании протоколов, описанных выше, эндотелиальные клетки можно увидеть, используя isolectin B4-Alexa488 окрашивания и поддержки сосудистых клеток мышц визуализировали с использованием анти-альфа-актин гладких мышц (рис. 2). Низкий вид энергии с использованием 5-кратным цель на рисунке 2 позволяет обзор сосудистых организации сетчатки. Кроме того, используя различные комбинации антител, приведенных в протоколе выше, эндотелиальные клетки можно увидеть, используя анти-CD31 иммунным и поддерживающих перицитов видны с использованием антител против NG2 (фиг. 3) или десмин (рис. 4). Анти-десмин окрашивания очень полезен для визуального палец как процессы перицитов и определения, являются ли они тесно связаны с эндотелиальными клетками. В противоположность этому, анти-NG2 окрашивания ядер описываются каждого перицитов, что полезно, когдаколичественной оценки количества перицитов клеток на сосудистой сети. Это будет сделано путем подсчета количества клеток в поле зрения использования большой мощности (например 60X) цели. Если необходимо, альтернативные комбинации антител также может быть использован (см. таблицу 1), например, против коллагена IV полезен для визуализации сосудистой базальной мембраны. Сетчатки, которые окрашивали на эндотелиальные клетки могут быть проанализированы для ключевых особенностей ангиогенеза, таких как прогрессирование сосудистой направлении от центра к краю сетчатки, сосудистой плотности и судно разветвление частоты.

Рисунок 1
Рисунок 1. Появление сетчатки новорожденных сразу после вскрытия и добавлением метанола. Этот кадр взят использованием Zeiss Stemi SV6 и AxioCam HR С камерой.

Рисунок 2
Рисунок 2. Иммуноокрашивание целые горы сетчатки (возраст Р7) с Isolectin B4-Alexa488 (зеленый) (A), анти-альфа-актин гладких мышц-Cy3 (красный) (B) или объединить (C). Эти изображения взяты с Zeiss и AxioImager AxioCam HRM камеры с помощью 5X цели. Обратите внимание на чередование артерий и вен. Артерии признаны капиллярной зоне, свободной, что непосредственно окружает их, и покрыты гладкомышечных клеток, которые окрашены положительный (красный) для альфа-актин гладких мышц. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

load/50546/50546fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Рисунок 3 Дважды иммуноокрашивание целые горы сетчатки (возраст P6) с анти-CD31 первичного антитела (обнаружены анти-IgG крысы конъюгированных с Alexa488, зеленый, A);. И анти-NG2 первичных антител, обнаружен с анти-IgG кролика конъюгированные с Alexa 594 (красный, B). Эти конфокальной изображения, сделанные с использованием 60X цель объединения лазерного сканирования изображений из 13 г ломтиков, каждый из 0,47 мкм толщины. Наложение изображения в C показывает CD31-положительных эндотелиальных клеток (зеленый) и NG2-положительных перицитах (красный). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4
Рисунок 4 Дважды иммуноокрашивание целые горы сетчатки (возраст P6) с анти-CD31 первичного антитела (обнаружены анти-IgG крысы конъюгированных с Alexa488, зеленый, A);. И анти-десмин первичных антител, обнаружен с анти-IgG кролика конъюгированные с Alexa 594 (красный, B). Эти конфокальной изображения, сделанные с использованием 60X цель объединения лазерного сканирования изображений из 21 г ломтиков, каждый из 0,24 мкм толщины. Наложение изображения в C показывает CD31-положительных эндотелиальных клеток (зеленый) и десмин-положительных перицитах (красный). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

<TD> Пермь Блокированные
Первичное антитело Рабочее разведение Блокирующий раствор (сыворотка + Пермь / квадратики) Вторичное антитело
Anti-NG2 (хондроитин сульфат Протеогликан) 1:250 5% сыворотки козьего Козы против кролика Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% сыворотки козьего Козы против мыши Alexa 488
Anti-Десмин 1:500 5% сыворотки козьего Козы против кролика Alexa 594
Против коллагена IV 1:200 5% сыворотки козьего Козы против кролика Alexa 594
Anti-Endoglin 1:100 5% сыворотки козьего Козы против крыс Alexa 594
Анти-CD31 1:500 5% сыворотки козьего Козы против крыс Alexa 488
Anti-VE-Cadherin 1:10 5% сыворотки козьего Козы против крыс Alexa 594
Anti-Alk1 1:25 5% сыворотки осла Donkey козьего анти Alexa 594
Anti-ОУРА-Cy5 1:100 N / A

Таблица 1. Примеры первичных антител для иммунофлуоресцентного окрашивания целом сетчатки горе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Изложенный здесь метод предлагает простой и эффективный способ получения изображения из цветного целом препараты горе сетчатки новорожденных мышей, что делает его легко поддаются количественной оценке и физиологически соответствующие модели ангиогенеза. Первоначально, мышь глаз может быть довольно трудно анализировать из-за его небольшого размера и формы мира, так что некоторые практики и хорошие инструменты вскрытия необходимы для надежных результатов. Препарирование глаза подготовлены в 2x концентрации PBS важно, потому что это вызывает небольшое количество воды, потери от глаз и уменьшает внутри орбитальной давление, что облегчает вскрытие. Хорошая подготовка сетчатки важно по нескольким причинам. Сначала он поддерживает целостность сосудов. Во-вторых, если сосудистой гиалоидная не очень хорошо удалена это снижает эффективность окрашивания антителами, что приводит к высокому уровню фона и снижение разрешающей способности. Эта проблема может возникнуть, если время PFA фиксации сетчатки слишком длинный. ОднакоПеред окрашиванием длительного хранения до нескольких месяцев в метаноле в морозильной камере -20 ° C подходит до isolectin окрашивания и для большинства из антител в таблице 1. Хотя isolectin окрашивание редко проблематична, она делает пятно макрофагов в дополнение к эндотелиальным клеткам. Для хорошего иммуноокрашивание тотальных сетчатки, выбор антител является критическим и окрашивание протокола должна быть адаптирована в соответствии с специфичность антител и концентрации, которые могут варьироваться от партии к партии, когда поликлональные антитела используют. Высокий фон обычно можно уменьшить за счет снижения концентрации антител, увеличивая время стирки или добавив больше моющего средства промывания. Антитела по прибытии аликвоты и хранили, как указано производителем. Для тех, которые хранили при -20 ° С, рабочий аликвоты хранится в холодильнике, чтобы избежать повторных циклов замораживания оттаивания. Если яркие флуоресцентные пятна появляются на окрашенных образцов, особенно если это также присутствуетв регионе вокруг ткани, это говорит о том осажденный агрегатов присутствуют антитела, которые должны быть удалены во всех последующих экспериментах путем центрифугирования антитела 10000 оборотов в минуту в течение 5 минут перед использованием. Некоторые антитела, используемые в настоящее время нашей лаборатории в список материалов с соответствующим разведением (табл. 1). Выбор совместимого комбинацию антител, очень важно, чтобы избежать нежелательных перекрестной реакции между первичными и вторичными антителами. Клеточная пролиферация может контролироваться путем инъекции мышей с раствором BrdU примерно за два часа до сбора ткани. Этот аналог тимин включена в пролиферирующих ДНК и могут быть обнаружены с помощью специального анти-BrdU антителами, как описано выше 8.

Каждый сетчатки очень хрупкая, но могут быть окрашены для различных сосудистых маркеров при обработке ткани мягко во время работы через протокол. Ряд элементов управления, включенные вкаждый эксперимент, чтобы показать специфику окрашивания. Необработанные сетчатки покажет степень флуоресценции в ткани, которая должна быть минимальной. Нет первичного контрольного антитела не позволит определения неспецифического связывания вторичного антитела к ткани. Сетчатки, которые были случайно разрывается во время вскрытия может предоставить полезную ткани для элементов управления. После монтажа флуоресцентного окрашивания сохраняется в течение нескольких дней до тех пор, слайды хранили при 4 ° C в темноте. Изображений по epifluorescent микроскопии улучшается за счет использования apotome, что снимает не в фокусе света. Кроме того, конфокальной микроскопии обеспечивает точное соты изображений (фиг. 3 и 4).

Этот способ имеет много возможных применений. Он может быть применен к мышей, у которых ключевые гены, которые регулируют ангиогенез истощаются, в том числе работы, которые использует индуцибельным CRE-LoxP генетики 8-10. Альтернативно ангиогенеза сетчатки может бытьопрошенных следующих лекарств поставляется либо системно, либо внутри-глазное исследовать их про-или антиангиогенную эффекты 11. Кроме того, можно воспользоваться трансгенных инструментов и использовать GFP или RFP трансгенных мышей, чтобы визуализировать ключевые элементы сосудистой сети сетчатки 11,12. (Обратите внимание, что фиксация с использованием 4% PFA в PBS в течение 1 часа при комнатной температуре используется вместо метанола для шага 2,12 протокола до визуализации эндогенный GFP или RFP в сетчатке от трансгенных мышей.) Кроме того, в целях изучения молекулярных сигналов Механизмы, это полезно для визуализации мРНК экспрессии специфических генов в сетчатке сплетение использованием в гибридизация 13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась Wellcome Trust и Британского фонда сердца.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics