Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese

Neuroscience

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Summary

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

Angiogenese ist der komplexe Prozess der Bildung neuer Blutgefäße durch die Sprossen neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der normalen Entwicklung von Organen und Geweben, sondern auch in vielen Krankheiten, bei denen die Bildung von Blutgefäßen ist dysregulated, wie Krebs, Blindheit und ischämischen Erkrankungen. Im Erwachsenenalter sind die Blutgefäße in der Regel Ruhestrom so Angiogenese ist ein wichtiges Ziel für neuartige Medikamentenentwicklung zu versuchen und zu regulieren Gefäßneubildung gezielt in Krankheit. Um besser zu verstehen, Angiogenese und geeignete Strategien zu regulieren entwickeln werden Modelle benötigt, die genau die verschiedenen biologischen Schritte, die beteiligt sind. Die Maus Neugeborenen Netzhaut bietet ein hervorragendes Modell der Angiogenese, weil Arterien, Venen und Kapillaren zu entwickeln, um eine Gefäßplexus während der ersten Woche nach der Geburt bilden. Dieses Modell hat auch den Vorteil, dass ein zwei-didimensionale (2D)-Struktur-Analyse machen einfach im Vergleich mit der komplexen 3D-Anatomie der anderen vaskulären Netzwerken. Durch die Analyse der retinalen Gefäßplexus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt, ist es möglich, die verschiedenen Phasen der Angiogenese unter dem Mikroskop zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt eine einfaches Verfahren zur Analyse des Gefäßsystems einer Maus Netzhaut unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit isolectin und vaskuläre spezifische Antikörper.

Introduction

Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine "Spitze" Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende "Stiel" Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße 1 umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum.

Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben 2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt4 Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden.

In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa 5 P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen 5 untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde 6 gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung.

Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch 7) durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.

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Protocol

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.

1. Enukleation und Fixierung der Augen Postnatale

  1. Zeigen human getötet Maus Welpe auf seiner Seite, entfernen Sie die Haut über dem Auge mit einer Schere.
  2. Mit einer Schere und Pinzette, um das Auge entkernen.
  3. Platz Schere unter dem entkernten Auge, schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe und heben Sie die Augen. In einen 24-Well-Platte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 2x PBS bei Raumtemperatur durchgeführt.
  4. Lassen Sie jedes Auge für 10 fix - 15 min, dann kalt 2x PBS auf Eis übertragen für 5 - 10 min. Am besten ist es Enukleationen und anschließende Fixierung staffeln, um sicherzustellen, der Grad der Fixierung ist gleich für jedes Auge.

2. Dissektion Postnatale Murine Retinas

  1. Transfer-Augen in eine Petrischale mit 2x PBS mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung und unter einer disse erweiternfesselndes Mikroskop.
  2. Entfernen Sie das Fett um die Augen mit einer Pinzette und Schere.
  3. Pierce der Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere und schneiden rund um die Hornhaut und Iris und entsorgen.
  4. Legen Zange zwischen Netzhaut und Lederhaut und entfernen Sie die Lederhaut kümmert sich nicht um die Netzhaut zu reißen. Die Aderhaut Schicht kann auch entfernt werden, aber, wenn es die Gefahr einer Schädigung der Netzhaut, die während dieser Stufe wird die Aderhaut kann wie es sich nicht signifikant auf die Qualität der Immunfärbung gelassen werden.
  5. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette.
  6. Entfernen Sie die hyaloids Schiffe durch das Sammeln von ihnen zusammen in der Mitte des Auges mit feinen Pinzette dann schnell ziehen weg von der Mitte der Netzhaut (alternativ snip an der Basis der hyaloid Schiffe mit einer feinen Schere).
  7. Spülen Sie die schalenförmigen Netzhaut mit PBS in einer sauberen Petrischale.
  8. Stellen 4 bis 5 radiale Einschnitte erreicht etwa 2/3 des Radius der Netzhaut durch Federkraft scissors zur Schaffung eines "Blütenblatt" Form.
  9. Abziehen PBS mit einer Pasteurpipette auf die Netzhaut zu glätten, und dann entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück Löschpapier.
  10. Langsam Pipette Kälte (-20 ° C) Methanol tropfenweise auf die Oberfläche der Netzhaut bis völlig bedeckt und dann mit zusätzlichen Flut Methanol. Dies wird dazu beitragen, um die Netzhaut zu fixieren und Permeabilisierung erleichtern. Die Netzhaut wird weiß.
  11. Transfer zu einem 2-ml-Röhrchen mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung zu erweitern.
  12. Lassen Netzhaut in kaltem Methanol für mindestens 20 min, bevor Sie mit Immunfärbung. Von den Antikörpern verwendet hier nur VE-Cadherin nicht erfolgreich auf Methanol festen Netzhaut verwendet werden. In diesem Fall Netzhaut müssen gerade gehen Immunfärbung nach Schritt 9.
  13. Falls erforderlich, kann Netzhaut in Methanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu mehrere Monate vor dem Färben.

3. Immuno / isolectin Färbung des Retinal Vascuschaftsgesetzgeber

  1. Entfernen Sie vorsichtig / Methanol abgießen und vorsichtig abspülen Netzhaut kurz in PBS (in diesem Stadium die Netzhaut ist immer noch in der gleichen 2-ml-Röhrchen aus Schritt 11 oben).
  2. PBS entfernen und Deckel Netzhaut mit 100 ul Perm / Blocks-Lösung (PBS + 0,3% + 0,2% Triton BSA) + 5% des entsprechenden Serums (siehe Tabelle 1) und leicht schütteln für 1 Stunde.
  3. Entfernen Perm / Sperren und Inkubation Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 ° C mit 100 ul ausgewählten Primärantikörper (siehe Tabelle 1) und / oder IsolectinB4, alle durch Verdünnen in Perm / Blocks vorbereitet.
  4. Entfernen Antikörper / isolectin und waschen Netzhaut 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
  5. In einigen Fällen, z. B. nach einer Färbung mit IsolectinB4-Alexa488 oder einem direkt konjugierten primären Antikörper, einen sekundären Antikörper, nicht erforderlich, und Netzhaut kann direkt angebracht werden (Schritt 7). Bei einem nicht konjugierten primären Antikörper in Schritt 3 verwendet wurde, dann wurden 100 ul der entsprechenden fluorescent sekundären Antikörper (verdünnt 1/200 in PBSTX) zugegeben und links nach Inkubation bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur über Nacht.
  6. Entfernen sekundären Antikörper und waschen Netzhaut 4 x 15 min in 2 ml PBSTX.
  7. Übertragen Netzhaut auf Objektträger mit einem breiten Bohrung Kunststoff Pasteurpipette und entfernen Sie überschüssiges PBSTX mit saugfähigen Gewebe. Berg Netzhaut durch Zugabe von 50 ul verlängern Deckfluessigkeit auf einem Deckglas und sanft Position über die Netzhaut.
  8. Die Objektträger zu Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C, so dass sie flach und vor Licht geschützt sind, damit das Verlängern Deckfluessigkeit eingestellt.
  9. Bild Netzhaut mit einem konfokalen Mikroskop oder eine Epifluoreszenzmikroskop.

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Representative Results

Nach Präparation der Netzhaut sollte wie eine flache Blume (Abbildung 1) zu suchen. Durch die Verwendung des Protokolls skizzierten können Endothelzellen gesehen mit isolectin B4-Alexa488 Färbung und Unterstützung vaskulären Muskelzellen visualisiert mit anti-alpha Glattmuskelaktin (Abbildung 2). Die Low-Power-Ansicht mit einem 5X Ziel in 2 ermöglicht einen Überblick über das vaskuläre Organisation der Netzhaut. Auch indem Sie eine andere Kombination von Antikörpern in der oben angegebenen Protokoll können Endothelzellen gesehen mit anti-CD31 Immunfärbung und Unterstützung pericytes sehen sind unter Verwendung von Antikörpern gegen NG2 (Abbildung 3) oder Desmin (Abbildung 4). Anti-Desmin-Färbung gut zur Visualisierung Finger Fortsätze der Perizyten und Bestimmen, ob sie eng mit den Endothelzellen verbunden. Im Gegensatz dazu beschreibt anti-NG2 Färbung der Kerne jedes pericyte, was nützlich ist, wennQuantifizieren der Anzahl von Zellen pericyte auf das Gefäßsystem. Dies würde durch Zählen Anzahl der Zellen pro Gesichtsfeld mit hoher Leistung (z. B. 60X) Ziel durchgeführt werden. Bei Bedarf können alternative Kombinationen von Antikörpern verwendet werden (siehe Tabelle 1) werden, zum Beispiel, ist ein Anti-Kollagen IV gut zur Visualisierung vaskulären Basalmembran. Retina, die für Endothelzellen gefärbt wurden für die Funktionen von Angiogenese, wie den Verlauf der Blutgefäße von der Mitte zum Rand der Netzhaut, die vaskuläre Dichte und Behälter Verzweigung Frequenz analysiert werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Aussehen eines Neugeborenen Netzhaut unmittelbar nach Dissektion und Zugabe von Methanol. Dieses Bild ist aufgenommen mit einem Zeiss Stemi SV6 und Axiocam HR c Kamera.

Abbildung 2
Abbildung 2. Immunfärbung von whole mount Netzhaut (Alter P7) mit Isolectin B4-Alexa488 (grün) (A), sind anti-alpha Glattmuskelaktin-Cy3 (rot) (B) oder fusionierten (C). Diese Bilder mit einer Zeiss AxioImager genommen und Axiocam HRm Kamera über ein 5fach Ziel. Beachten Sie die wechselnden Muster von Arterien und Venen. Arterien sind durch die Kapillarwirkung Freizone, die unmittelbar umgibt sie erkannt und sind mit glatten Muskelzellen, die positive Färbung (rot) für alpha Glattmuskelaktin beschichtet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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3 Doppel Immunfärbung whole mount Netzhaut (Alter P6) mit Anti-CD31 primären Antikörper (detektiert mit Anti-Ratten-IgG, konjugiert mit Alexa488, grün, A);. Und anti-NG2 primären Antikörper nachgewiesen mit Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa 594 (rot, B). Diese konfokalen Bilder wurden mit einem 60x Objektiv kombiniert Laser-Scanning-Bilder von 13 z Scheiben, die jeweils 0,47 um Dicke. Eine Überlagerung von Bildern in C zeigt CD31-positive Endothelzellen (grün) und NG2-positive Perizyten (rot). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 4
Figur 4 Doppel-Immunfärbung whole mount Netzhaut (Alter P6) mit Anti-CD31 primären Antikörper (detektiert mit Anti-Ratten-IgG, konjugiert mit Alexa488, grün, A);. Und Anti-Desmin primären Antikörper nachgewiesen mit Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Alexa 594 (rot, B). Diese konfokalen Bilder wurden mit einem 60x Objektiv kombiniert Laser-Scanning-Bilder von 21 z Scheiben, die jeweils 0,24 um Dicke. Eine Überlagerung von Bildern in C zeigt CD31-positive Endothelzellen (grün) und Desmin-positiven Perizyten (rot). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

<td> Perm-Block nur
Primärer Antikörper Gebrauchsverdünnung Blocking-Lösung (Serum + Perm / Block) Sekundäre Antikörper
Anti-NG2 (Chondroitinsulfat Proteoglycan) 1:250 5% Ziegen-Serum Ziege anti-Kaninchen Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% Ziegen-Serum Ziege anti-Maus Alexa 488
Anti-Desmin 1:500 5% Ziegen-Serum Ziege anti-Kaninchen Alexa 594
Anti-Collagen IV 1:200 5% Ziegen-Serum Ziege anti-Kaninchen Alexa 594
Anti-Endoglin 1:100 5% Ziegen-Serum Ziege anti Ratte Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% Ziegen-Serum Ziege anti Ratte Alexa 488
Anti-VE-Cadherin 01.10 5% Ziegen-Serum Ziege anti Ratte Alexa 594
Anti-ALK1 01.25 5% Esel-Serum Esel anti Ziege Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tabelle 1. Beispiele für primäre Antikörper für Immunfluoreszenzfärbung der ganze Berg Netzhaut.

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Discussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, Bilder von gefärbten whole mount Präparaten von Neugeborenen Maus Netzhaut zu erhalten, so dass es eine leicht quantifizierbar und physiologisch relevanten Modell der Angiogenese. Zunächst wird die Maus Auge kann es ziemlich schwierig zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe und Kugelform, so dass einige der Praxis und gute Dissektion Werkzeuge für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind. Präparation der Augen in 2x Konzentration PBS hergestellt ist wichtig, weil dies verursacht eine kleine Menge des Wasserverlustes aus dem Auge und reduziert die intra-Orbital-Druck, der Dissektion erleichtert. Eine gute Vorbereitung der Netzhaut ist aus mehreren Gründen wichtig. Zuerst wird die Integrität des Gefäßsystems. Zweitens, wenn die hyaloid Gefäßsystem nicht gut entfernt es reduziert die Effizienz der Antikörper-Färbung, was zu hohen Hintergrund und verringerte Auflösung. Dieses Problem kann auch auftreten, wenn die PFA Fixierzeit der Netzhaut ist zu lang. Allerdingsvor der Färbung, ist die langfristige Lagerung bis zu mehreren Monaten in Methanol in der -20 ° C Gefrierschrank geeignet vor isolectin Färbung und für die meisten der Antikörper in Tabelle 1. Obwohl isolectin Färbung ist selten problematisch, es Fleck Makrophagen neben Endothelzellen. Für eine gute Immunfärbung whole mount Netzhaut, ist die Wahl der Antikörper kritisch und die Färbeprotokoll müssen entsprechend der Antikörper Spezifität und Konzentration, die von Charge zu Charge variieren kann, wenn polyklonale Antikörper verwendet werden, angepasst werden. Hohe Hintergrund kann in der Regel durch eine Senkung Antikörper-Konzentration, die Erhöhung Waschzeit oder das Hinzufügen von mehr Waschmittel zu den Waschschritten reduziert werden. Antikörper werden bei der Ankunft aliquotiert und wie vom Hersteller angegeben. Für diejenigen, die bei -20 ° C gelagert werden, wird eine Arbeitsgruppe Aliquot in den Kühlschrank, um wiederholte Zyklen von Einfrieren Auftauen vermeiden gehalten. Wenn hellem fluoreszierenden Flecken auf der gefärbten Probe erscheinen, vor allem, wenn dies auch vorhandenin der Region um das Gewebe legt diese ausgefällte Aggregate Antikörper vorhanden sind, sollte in allen nachfolgenden Experimenten durch Zentrifugieren des Antikörpers für 10.000 rpm für 5 min vor der Verwendung entfernt werden. Einige der Antikörper derzeit von unseren Laboratorien verwendet werden, sind in der Materialliste mit der entsprechenden Verdünnung (Tabelle 1). Die Wahl eines kompatiblen Kombination von Antikörpern ist sehr wichtig, um unerwünschte Kreuzreaktion zwischen primären und sekundären Antikörper zu vermeiden. Die Zellproliferation kann durch Injektion von Mäusen mit einer Lösung von BrdU etwa zwei Stunden vor dem Ernten des Gewebes überwacht. Das Thymin-Analogon proliferierenden DNA eingebaut und kann unter Verwendung eines spezifischen anti-BrdU-Antikörper, wie dies zuvor 8 beschrieben.

Jeder Netzhaut ist sehr zerbrechlich, kann aber für verschiedene vaskuläre Marker durch Behandlung des Gewebes während der Arbeit sanft durch das Protokoll gefärbt werden. Eine Reihe von Kontrollen sind enthaltenjedes Experiment zu zeigen Spezifität der Färbung. Unbehandelte Netzhaut wird zeigen den Grad der Autofluoreszenz im Gewebe, die minimal sein sollte. A kein primärer Antikörper-Kontrolle ermöglicht Bestimmung der unspezifischen Bindung des sekundären Antikörpers an das Gewebe. Netzhaut, die versehentlich beim Präparieren zerrissen nützliche Gewebe, Kontrollen durchzuführen. Nach der Montage wird Fluoreszenzfärbung für mehrere Tage erhalten, solange die Objektträger bei 4 ° C im Dunkeln gelagert werden. Imaging durch Epifluoreszenzmikroskopie wird durch die Verwendung eines apotome, die sich entfernt von Fokuslicht verbessert. Alternativ stellt der konfokalen Mikroskopie genaue zellspezifischen Bildgebung (3 und 4).

Diese Methode hat viele mögliche Anwendungen. Es kann an Mäusen, in denen wichtige Gene, die Angiogenese regulieren erschöpft sind, einschließlich Arbeit, die induzierbare verwendet Cre-loxP Genetik 8-10 angewendet werden. Alternativ retinalen Angiogenese kannverhört folgende medikamentöse Behandlungen geliefert entweder systemisch oder intra-okular ihre pro-oder anti-angiogenen Effekte 11 zu untersuchen. Es ist auch möglich, die Vorteile der transgenen Werkzeuge zur Verfügung zu nehmen und GFP oder RFP transgenen Mäusen zu den wichtigsten Elementen des retinalen Gefäßsystems 11,12 visualisieren. (Beachten Sie, dass Fixation mit 4% PFA in PBS für 1 Stunde bei Raumtemperatur anstelle von Methanol für Schritt 2.12 des Protokolls vor der Bildgebung endogene GFP oder RFP in Netzhaut aus transgenen Mäusen verwendet.) Darüber hinaus, um die molekulare Signalisierung studieren Mechanismen, ist es sinnvoll, die mRNA-Expression spezifischer Gene in der Netzhaut Plexus mit in-situ-Hybridisierung 13 sichtbar zu machen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Wellcome Trust und der British Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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