Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een laat

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Angiogenese is het complexe proces van vorming van nieuwe bloedvaten die door het kiemen van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaand netwerk vat. Angiogenese speelt een belangrijke rol niet alleen in de normale ontwikkeling van organen en weefsels, maar ook in vele ziekten waarbij bloedvatvorming ontregeld is, zoals kanker, blindheid en ischemische ziekten. In het volwassen leven, bloedvaten zijn over het algemeen rustig dus angiogenese is een belangrijk doelwit voor nieuwe ontwikkeling van geneesmiddelen om te proberen en te reguleren vorming van nieuwe bloedvaten in het bijzonder in de ziekte. Om beter te begrijpen angiogenese en passende strategieën om deze te reguleren ontwikkelen, zijn modellen nodig die een goed beeld van de verschillende biologische stappen die betrokken zijn. De neonatale muis netvlies een uitstekend model van angiogenese omdat slagaders, aders en haarvaten ontwikkelen om een ​​vasculaire plexus vormen tijdens de eerste week na de geboorte. Dit model heeft ook het voordeel van twee-dionele (2D) structuur waardoor analyse eenvoudig vergeleken met de complexe 3D anatomie van andere vasculaire netwerken. Door het analyseren van de retinale vasculaire plexus op verschillende tijdstippen na de geboorte, is het mogelijk om de verschillende stadia van angiogenese waarnemen onder de microscoop. In dit artikel wordt een eenvoudige procedure voor het analyseren van het vaatstelsel van een muis netvlies met behulp van fluorescerende kleuring met isolectin en vasculaire specifieke antilichamen.

Introduction

Angiogenese is een complex ontwikkelingsproces gedefinieerd door de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaand netwerk vaartuig en wordt gereguleerd door verscheidene signaleringsroutes. De belangrijkste daarvan is de VEGF weg. VEGF is vrijgegeven door ischemische cellen en leidt tot de inleiding van angiogenese in naburige bloedvaten. De toonaangevende endotheelcellen van een nieuwe vasculaire spruit is een 'tip' cel, die filopodia dat uit te reiken naar de bron van VEGF produceert, en wordt gevolgd door proliferatie 'stalk' endotheelcellen. Zo geactiveerde endotheelcellen prolifereren en migreren naar een avasculaire regio waar zij deel nieuwe vasculaire buizen. Om deze buizen stabiliseren de bloedstroom, endotheelcellen interactie pericyten en gladde spiercellen, waarin de nieuwe bloedvaten 1 omringen. Angiogenese is essentieel voor vascularisatie van het embryo en groeiende weefsels. Maar het draagt ​​ook veel pathologische aandoeningen zoals kanker en dat defecten in angiogenese worden geassocieerd met ischemische ziekten. De ontwikkeling van effectieve behandelingen met geneesmiddelen om angiogenese te reguleren als middel voor het behandelen ziekte ook van groot belang. Bijvoorbeeld, effectieve anti-angiogene groeifactoren kanker, terwijl pro-angiogene strategieën kunnen worden gebruikt om ischemische ziekte te behandelen. Aldus modellen van angiogenese essentieel voor een beter begrip van de regulatie van de vorming van nieuwe bloedvaten en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën om vasculaire groei te verbeteren of te verlagen.

Een fundamenteel element van angiogenese onderzoek is de keuze van een geschikt vasculair model. Veel in vitro modellen zijn ontwikkeld om de basisstappen van angiogenese zoals endotheliale celmigratie, proliferatie en overleving 2,3 reproduceren. Een veel gebruikte in vitro assay is de vorming van een vertakt netwerk van endotheelcellen op Matrigel matrix, hoewel tzijn niet specifiek voor endotheelcellen, noch nemen gewoonlijk de steun van pericyten en gladde spiercellen. Beoordeling van ex vivo kiemen angiogenese middels muis orgelcultuur zoals embryoid body assay, de aorta-ring assay en de foetale middenvoet assay maakt de analyse van angiogenese van endotheelcellen in de context van extra ondersteunende cellen. De belangrijkste beperkingen van deze testen omvatten het gebrek aan bloedstroming en regressie van vaten in de tijd, die een weinig tijd voor analyse. Daarom, om de regulering van angiogenese beter te begrijpen, in vivo modellen nodig zoals ontwikkeld in muizen met subcutaan geïmplanteerde spons of Matrigel pluggen, evenals de achterpoot ischemie model. Echter, zijn deze modellen uitdagend te analyseren vanwege de complexe 3D-architectuur van de neovessels. Daarentegen heeft de zebravis embryo een uitstekend model voor het visualiseren angiogenese bleek in het geheelorganisme 4. Echter, de muis evolutionair veel identiek aan humaan dan zebravis, waardoor de muis een voorkeursmodel in veel gevallen. Bijgevolg angiogenese van de postnatale muis netvlies staat voor een goed gekarakteriseerd methode van keuze voor angiogenese onderzoek. Het biedt niet alleen een fysiologische omgeving, maar ook een 2D vasculaire plexus die gemakkelijk kan worden gevisualiseerd met behulp van geschikte fluorescerende vlekken. De architectuur van het schip netwerk, endotheelproliferatie, kiemen, perivasculaire cel werving en vat verbouwing kunnen allemaal worden onderzocht met behulp van deze techniek.

In de neonatale muis netvlies, ontwikkeling van retinale bloedvaten optreedt in de eerste week na de geboorte. Muizen, in tegenstelling tot mensen, worden blind geboren en de netvliezen pas vascularized geworden na de geboorte. Netvliesvaten voort uit het midden van de retina nabij de oogzenuw postnatale dag 0 (P0) en ontwikkelen door angiogenese te vormen een zeer organiserend vasculaire plexus dat de retinale periferie circa P8 5 bereikt. Bloedvaten ontwikkelen op een karakteristieke wijze met de capillaire plexus geleidelijk naar buiten groeien van de optische schijf in de richting van de periferie naar een regelmatig wisselend patroon van slagaders en aders met een tussenliggende capillair netwerk genereren. De retinale vaatstelsel biedt een ideaal model om angiogenese te bestuderen omdat de schepen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd als ze groeien in wat in wezen een 2D-vlak, waardoor het relatief eenvoudig om de retinale bloedvaten in flat-mount voorbereidingen 5 onderzoeken. Werkwijze voor het isoleren van de neonatale muis netvlies analyse van endotheliale tip celreacties meerdere uren ex vivo gerapporteerd 6. Alternatief, nader onderzoek van de gehele retinale vasculatuur en bijbehorende bloedvaten markers vereist immunokleuring van vaste monsters retina in verschillende stadia van ontwikkeling.

Hier bieden wijeen gedetailleerde beschrijving van een betrouwbare en technisch ongecompliceerd methode die wij voor whole-mount kleuring van het muizen retinale vasculaire plexus, de eerste enucleatie van de postnatale oog (zie 7) door de kleuring protocollen uiteindelijke beeldvorming onder de microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.

1. Enucleatie en Fixatie van Postnatale Eyes

  1. Plaats op humane wijze gedood muis pup op zijn kant, verwijder de huid die het oog met een schaar.
  2. Gebruik een schaar en pincet voor het oog ophelderen.
  3. Plaats scharen onder de enucleated oog, snijd de oogzenuw en de omliggende weefsels en til het oog. Transfer naar een 24-wells plaat met 4% paraformaldehyde (PFA) bereid in 2x PBS bij kamertemperatuur.
  4. Laat elk oog om vast te stellen voor 10 - 15 minuten, vervolgens transfer naar koude 2x PBS op ijs gedurende 5-10 minuten. Het beste is om enucleations en de daaropvolgende vaststelling wankelen te zorgen voor de mate van fixatie is gelijk voor elk oog.

2. Dissectie van Postnatale Muriene netvliezen

  1. Transfer ogen in een petrischaal met 2x PBS met behulp van een plastic Pasteur pipet die is gesneden om de boring en plaats te verbreden onder een dissecting microscoop.
  2. Verwijder eventueel vet rond de ogen met behulp van een tang en schaar.
  3. Doorboren de rand van het hoornvlies met een scherpe schaar en snijd rond het hoornvlies en de iris en gooi deze weg.
  4. Plaats tang tussen retina en sclera en verwijder de sclera zorg ervoor dat u het netvlies scheuren. De choroid laag kan worden verwijderd, maar als er een gevaar van beschadiging van de retina die tijdens deze stap, kan het vaatvlies laag worden gelaten omdat het niet tot een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van de immunokleuring.
  5. Verwijder de lens en het glasvocht behulp van een tang.
  6. Verwijder de hyaloids schepen door het verzamelen van hen samen in het midden van het oog met een fijne tang vervolgens snel weg te trekken van het centrum van het netvlies (afwisselend knip bij basis van hyaloid schepen met fijne schaar).
  7. Spoel de komvormige retina met PBS in een schone petrischaal.
  8. Voeg 4-5 radiale insnijdingen betrekking op ongeveer 2/3 van de straal van de retina door veerkracht De schaarrs een 'blaadje' vorm te maken.
  9. Tap PBS met behulp van een Pasteur pipet om het netvlies af te vlakken, en verwijder vervolgens het overtollige PBS met een klein stukje absorberend papier.
  10. Langzaam pipet koude (-20 ° C) methanol druppelsgewijs op het oppervlak van het netvlies tot volledig bedekt en vervolgens overstromingen met extra methanol. Dit zal helpen om het netvlies te repareren en zal permeabilisatie vergemakkelijken. Het netvlies wordt wit.
  11. Transfer naar een 2 ml buis met een plastic Pasteur pipet die is gesneden om de boring te verbreden.
  12. Voeg retina in koude methanol gedurende ten minste 20 minuten alvorens immunokleuring. Van de antilichamen hier gebruikt, alleen VE-cadherine niet met succes worden toegepast op methanol vaste netvlies. In dit geval moet netvliezen om rechtdoor gaan tot immunostaining na stap 9.
  13. Desgewenst kan netvlies worden opgeslagen in methanol bij -20 ° C tot enkele maanden voor kleuring.

3. Immuno / isolectin kleuring van het netvlies Vasculature

  1. Verwijder voorzichtig / afgieten methanol en zachtjes netvliezen even uitspoelen in PBS (in dit stadium het netvlies is nog steeds in dezelfde ml tube uit stap 11 hierboven 2).
  2. Verwijder PBS en deksel netvlies met 100 gl Perm / Block oplossing (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% van passende serum (zie tabel 1) en schud voorzichtig gedurende 1 uur.
  3. Verwijder Perm / blokkeren en incubeer netvliezen onder zacht schudden gedurende de nacht bij 4 ° C met 100 gl gekozen primaire antilichamen (zie tabel 1) en / of IsolectinB4, bereid door verdunning in Perm / Block.
  4. Verwijder antilichaam / isolectin en wassen netvliezen 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
  5. In sommige gevallen, bijvoorbeeld na kleuring met IsolectinB4-Alexa488 of direct geconjugeerd primair antilichaam, een secundair antilichaam niet nodig en retina kan direct worden gemonteerd (stap 7). Wanneer een geconjugeerde primaire antilichaam is gebruikt in stap 3, en 100 pl van de geschikte fluorescent secundair antilichaam (1/200 verdund in PBSTx) toegevoegd en gedurende de nacht incuberen bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  6. Verwijder secundair antilichaam en was netvliezen 4 x 15 min in 2 ml PBSTx.
  7. Overdragen netvliezen op dia's met behulp van een breed boring plastic Pasteur pipet en verwijder overtollige PBSTx met een absorberend tissue. Mount netvlies door het toevoegen van 50 pi Verleng afdekmedium op een dekglaasje en zachtjes positie op het netvlies.
  8. Transfer glijdt naar koelkast overnacht bij 4 ° C, ervoor te zorgen dat ze zijn plat en beschermd tegen licht, zodat het verlengen afdekmedium te stellen.
  9. Afbeelding retina met een confocale microscoop of een epifluorescentie microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na dissectie het netvlies moet eruit zien als een platte bloem (figuur 1). Door het protocol hierboven beschreven, kunnen endotheelcellen zichtbaar met isolectin B4-Alexa488 kleuring en ondersteuning vasculaire spiercellen gevisualiseerd met anti-gladde spier alfa actine (Figuur 2). De energiebesparende weergave met 5X doelstelling in figuur 2 kan een overzicht van de vasculaire ordening van de retina. Ook, door een andere combinatie van antilichamen die in het bovenstaande protocol, endotheelcellen zichtbaar met anti-CD31 immunokleuring en ondersteunende pericyten worden gezien met antilichamen tegen NG2 (figuur 3) of desmine (figuur 4). Anti-desmine kleuring is nuttig voor het visualiseren van de vinger, zoals processen van pericyten en het bepalen of deze nauw verbonden zijn met de endotheelcellen. Daarentegen anti-NG2 kleuring worden de kernen van elk pericyte, wat handig is bijdat het aantal pericyte cellen op het vaatstelsel. Dit zou moeten gebeuren door het tellen van het aantal cellen per gezichtsveld met een hoog vermogen (bijv. 60X) doelstelling. Indien nodig kunnen alternatieve combinaties van antilichamen worden gebruikt (zie tabel 1), bijvoorbeeld, anti-collageen IV is nuttig voor het visualiseren van de vasculaire basale membraan. Retina's die zijn gekleurd voor endotheelcellen kan worden geanalyseerd belangrijkste kenmerken van angiogenese, zoals de progressie van de vasculatuur van het centrum naar de rand van de retina, de vasculaire dichtheid en vat vertakking frequentie.

Figuur 1
Figuur 1. Uiterlijk van een neonatale netvlies direct na dissectie en toevoeging van methanol. Dit beeld wordt genomen met behulp van een Zeiss Stemi SV6 en Axiocam HR c camera.

Figuur 2
Figuur 2. Immunokleuring van ganse berg netvliezen (leeftijd P7) met isolectin B4-Alexa488 (groen) (A), zijn anti-alfa-gladde spier actine-Cy3 (rood) (B) of samengevoegde (C). Deze beelden zijn gemaakt met een Zeiss axioimager en Axiocam HRm camera met een 5x doelstelling. Let op het afwisselend patroon van slagaders en aders. Slagaders worden herkend door de capillaire zone die onmiddellijk omringt hen, en zijn bekleed met gladde spiercellen die positief vlek (rood) voor alfa gladdespieractine. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

load/50546/50546fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50546/50546fig3.jpg "/>
Figuur 3 Dubbele immunokleuring van ganse berg netvliezen (leeftijd P6) met anti-CD31 primair antilichaam (gedetecteerd met anti-rat IgG geconjugeerd aan Alexa488, groen, A);. En anti-NG2 primair antilichaam, gedetecteerd met anti-konijn IgG geconjugeerd aan Alexa 594 (rood, B). Deze confocale beelden werden genomen met behulp van een 60X objectief combineert laser scanning beelden van 13 z plakjes, elk van 0,47 micrometer dik. Een overlay van afbeeldingen in C toont CD31-positieve endotheelcellen (groen) en NG2-positieve pericytes (rood). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4
Figuur 4 Dubbele immunokleuring van ganse berg netvliezen (leeftijd P6) met anti-CD31 primair antilichaam (gedetecteerd met anti-rat IgG geconjugeerd aan Alexa488, groen, A);. En anti-desmine primair antilichaam, gedetecteerd met anti-konijn IgG geconjugeerd aan Alexa 594 (rood, B). Deze confocale beelden werden genomen met behulp van een 60X objectief combineert laser scanning beelden van 21 z plakjes, elk van 0,24 micrometer dik. Een overlay van afbeeldingen in C toont CD31-positieve endotheelcellen (groen) en desmine-positieve pericytes (rood). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

<td> Perm Block alleen
Primair antilichaam Werkverdunning Blokkerende oplossing (Serum + Perm / Block) Secundair antilichaam
Anti-NG2 (chondroïtinesulfaat Proteoglycan) 1:250 5% geit serum Geit anti konijn Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% geit serum Geit anti-muis Alexa 488
Anti-desmine 1:500 5% geit serum Geit anti konijn Alexa 594
Anti-collageen IV 1:200 5% geit serum Geit anti konijn Alexa 594
Anti-endogline 1:100 5% geit serum Geit anti rat Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% geit serum Geit anti rat Alexa 488
Anti-VE-cadherine 01:10 5% geit serum Geit anti rat Alexa 594
Anti-ALK-1 01:25 5% ezel serum Ezel anti geit Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tabel 1. Voorbeelden van primaire antilichamen voor immunofluorescentiekleuring van ganse berg netvliezen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier gepresenteerde methode biedt een eenvoudige en efficiënte manier om beelden van gebrandschilderd ganse berg voorbereidingen van neonatale muis netvlies te krijgen, waardoor het een gemakkelijk kwantificeerbare en fysiologisch relevante model van angiogenese. In eerste instantie kan de muis oog heel moeilijk te ontleden vanwege zijn kleine formaat en bol vorm, dus wat oefening en goede dissectie-instrumenten zijn nodig voor betrouwbare resultaten. Dissectie van de ogen bereid 2x concentratie PBS is belangrijk omdat dit veroorzaakt een kleine hoeveelheid water uit het oog verliezen en reduceert de intra-orbitale druk, die dissectie vergemakkelijkt. Goede voorbereiding van het netvlies is belangrijk om verschillende redenen. Eerst handhaaft de integriteit van de vasculatuur. En eveneens indien hyaloid vasculatuur niet goed verwijderd vermindert de efficiëntie van het antilichaam kleuring, wat leidt tot hoge niveaus van achtergrond en verminderde resolutie. Dit probleem kan ook optreden als de PFA fixatie tijd van het netvlies is te lang. Echter,voorafgaand aan kleuring, langdurige opslag tot enkele maanden in methanol in de -20 ° C vriezer geschikt voor isolectin kleuring en voor de meeste van de antilichamen in tabel 1. Hoewel isolectin kleuring zelden problematisch, doet vlekken macrofagen naast endotheelcellen. Voor goede immunokleuring van whole-mount netvlies, de keuze van antilichamen is kritisch en de kleuring protocol moet worden aangepast aan het antilichaam specificiteit en concentratie, die kan variëren tussen batches als polyklonale antilichamen gebruikt. Hoge achtergrond kan meestal worden verminderd door het verlagen antilichaamconcentratie, verhogen wastijd of toevoegen van meer wasmiddel de wasstappen. Antilichamen worden bij aankomst porties verdeeld en opgeslagen zoals aangegeven door de fabrikant. Voor degenen die zijn opgeslagen bij -20 ° C, wordt een aliquot werkt bewaard in de koelkast om herhaalde cycli van bevriezen ontdooien te voorkomen. Wanneer er helder fluorescerende vlekken op de gebrandschilderde specimen, vooral als dit is ook aanwezigin het gebied rond het weefsel suggereert dit geprecipiteerde aggregaten van antilichamen die aanwezig zijn in alle volgende experimenten worden verwijderd door centrifugeren van het antilichaam voor 10.000 rpm gedurende 5 minuten voorafgaand aan gebruik. Sommige antilichamen thans door onze laboratoria in de lijst van materialen met de juiste verdunning (tabel 1). Het kiezen van een geschikte combinatie van antilichamen is zeer belangrijk om ongewenste kruisreactie tussen primaire en secundaire antilichamen voorkomen. Celproliferatie kan worden gevolgd door het injecteren van muizen met een oplossing van BrdU ongeveer twee uur vóór de oogst het weefsel. Deze thymine analoog is opgenomen in prolifererende DNA en kan worden gedetecteerd met een specifiek anti-BrdU-antilichaam, zoals eerder beschreven 8.

Elke netvlies is zeer fragiel, maar kan worden gekleurd voor verschillende vasculaire markers door behandeling van het weefsel zachtjes terwijl werken via het protocol. Een aantal controles zijn opgenomen inelk experiment om de specificiteit van vlekken vertonen. Onbehandelde netvliezen de mate van autofluorescentie in het weefsel, die minimaal zijn onthullen. Een geen primair antilichaam controle zal bepaling van niet-specifieke binding van het tweede antilichaam aan het weefsel. Netvliezen die per ongeluk zijn gescheurd tijdens dissectie kan handig weefsel te voorzien in controles. Na de montage wordt fluorescente kleuring bewaard enkele dagen zolang de slides opgeslagen bij 4 ° C in het donker. Beeldvorming door epifluorescerende microscopie wordt verbeterd door het gebruik van een apotome, die onscherp licht verwijdert. Alternatief confocale microscopie levert nauwkeurige celspecifieke imaging (figuren 3 en 4).

Deze methode heeft vele toepassingsmogelijkheden. Het kan worden toegepast op muizen waarin belangrijke genen die angiogenese reguleren uitgeput, waaronder werk dat gebruik maakt induceerbare Cre-loxP genetica 8-10. Alternatief retinale angiogenese kanondervraagd volgende behandelingen met medicijnen afgeleverd ofwel systemisch of intra-oculair om hun pro-of anti-angiogene effecten 11 te onderzoeken. Het is ook mogelijk om te profiteren van de transgene tools beschikbaar en te gebruiken GFP of RFP transgene muizen om de belangrijkste elementen van de retinale bloedvaten 11,12 visualiseren. (Merk op dat fixatie met 4% PFA in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wordt gebruikt in plaats van methanol voor stap 2.12 van het protocol voor beeldvorming endogene GFP of RFP netvlies van transgene muizen.) Teneinde de moleculaire signalisatie mechanismen, is het nuttig om de mRNA expressie van specifieke genen in het retinale plexus met in situ hybridisatie 13 visualiseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Wellcome Trust en de British Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics