Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis

Neuroscience

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Summary

La retina murino neonatal proporciona un modelo bien caracterizado fisiológica de la angiogénesis, que permite que las investigaciones de las funciones de los diferentes genes o fármacos que modulan la angiogénesis en un

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

La angiogénesis es el proceso complejo de la nueva formación de vasos sanguíneos definido por el surgimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes. La angiogénesis juega un papel clave no sólo en el desarrollo normal de los órganos y tejidos, pero también en muchas enfermedades en las que la formación de los vasos sanguíneos es mal regulada, tales como el cáncer, la ceguera y enfermedades isquémicas. En la vida adulta, los vasos sanguíneos son generalmente de reposo para la angiogénesis es un importante objetivo para el desarrollo de fármacos novedoso para tratar de regular la formación de nuevos vasos específicamente en la enfermedad. Con el fin de entender mejor la angiogénesis y para desarrollar estrategias apropiadas para regularlo, se requieren modelos que reflejan con precisión los diferentes pasos biológicos que están involucrados. La retina del ratón neonatal proporciona un excelente modelo de la angiogénesis debido a arterias, venas y capilares desarrollan para formar un plexo vascular durante la primera semana después del nacimiento. Este modelo también tiene la ventaja de tener una de dos diestructura dimensional (2D) hacer análisis simple en comparación con la compleja anatomía 3D de otras redes vasculares. Mediante el análisis del plexo vascular de la retina en diferentes momentos después del nacimiento, es posible observar las diversas etapas de la angiogénesis bajo el microscopio. Este artículo muestra un procedimiento sencillo para el análisis de la vasculatura de la retina del ratón usando tinción fluorescente con anticuerpos específicos isolectina y vasculares.

Introduction

La angiogénesis es un proceso de desarrollo complejo definido por la formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de una red de vasos pre-existentes y está regulada por varias vías de señalización. La más destacada de éstas es la vía del VEGF. VEGF es liberada por las células isquémicas y conduce a la iniciación de brotes angiogénicos en los vasos sanguíneos vecinos. La célula endotelial líder de un nuevo brote vascular es una célula de 'punta', que produce filopodios que alcanzan hacia fuera hacia la fuente de VEGF, y es seguida por la proliferación de células endoteliales 'tallo'. De esta manera, las células endoteliales activadas migran y proliferan hacia una región avascular, donde forman nuevos tubos vasculares. Con el fin de estabilizar estos tubos para apoyar el flujo de sangre, las células endoteliales interactúan con los pericitos y células musculares lisas, que rodean los vasos sanguíneos nuevos 1. La angiogénesis es esencial para la vascularización del embrión y tejidos en crecimiento. Sin embargo, también contribuye a muchos patológicatrastornos de cal como el cáncer; mientras que defectos en la angiogénesis están asociados con enfermedades isquémicas. Por consiguiente, el desarrollo de tratamientos farmacológicos eficaces para regular la angiogénesis como un medio de tratamiento de la enfermedad es de gran interés. Por ejemplo, los factores anti-angiogénicos eficaces reducirán el crecimiento del cáncer, mientras que las estrategias de pro-angiogénicos pueden ser usados ​​para tratar la enfermedad isquémica. Por lo tanto, los modelos de angiogénesis son esenciales para entender mejor la regulación de la formación de nuevos vasos y para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para mejorar o disminuir el crecimiento vascular.

Un elemento fundamental de la investigación de la angiogénesis es la elección de un modelo vascular apropiada. Muchos en modelos in vitro se han diseñado para reproducir los pasos básicos de la angiogénesis tales como la migración de células endoteliales, proliferación y supervivencia 2,3. A utilizado con frecuencia en el ensayo in vitro es la formación de una red ramificada de células endoteliales sobre una matriz de Matrigel, aunque tla suya no es específico de las células endoteliales, ni tampoco suelen incorporar el apoyo de los pericitos o células del músculo liso. Evaluación ex vivo de la angiogénesis brotación usando cultivo de órganos de ratón, tales como el ensayo de cuerpo embrioide, el ensayo de anillo aórtico y el ensayo metatarsiano fetal permite el análisis de la angiogénesis de las células endoteliales en el contexto de células de soporte adicionales. Sin embargo, las principales limitaciones de estos ensayos incluyen la falta de flujo de sangre y la regresión de los vasos a través del tiempo, dando una ventana limitada para el análisis. Por lo tanto, para comprender la regulación de la angiogénesis con mayor precisión, en modelos in vivo son necesarios tales como los desarrollados en el ratón utilizando esponjas implantadas por vía subcutánea o tapones de matrigel, así como el modelo de isquemia de las extremidades posteriores. Sin embargo, estos modelos son difíciles de analizar debido a la compleja arquitectura 3D de los neovasos. En contraste, el embrión de pez cebra ha demostrado ser un excelente modelo para la visualización de la angiogénesis en el conjuntoorganismo 4. Sin embargo, el ratón es evolutivamente mucho más estrechamente relacionada con la humana que pez cebra, haciendo que el ratón un modelo preferido en muchos casos. Por consiguiente la angiogénesis de la retina del ratón postnatal representa un método bien caracterizado de elección para la investigación angiogénesis. No sólo proporciona un entorno fisiológico, pero también un plexo vascular 2D que puede ser fácilmente visualizado utilizando manchas fluorescentes apropiados. La arquitectura de la red de vasos, la proliferación endotelial, germinación, reclutamiento de células perivasculares y remodelado vascular todo puede ser investigada utilizando esta técnica.

En la retina del ratón neonatal, el desarrollo de los vasos sanguíneos de la retina se produce en la primera semana de vida postnatal. Los ratones, a diferencia de los humanos, nacen ciegos y las retinas sólo son vascularizados después del nacimiento. Surgen vasos de la retina desde el centro de la retina cerca del nervio óptico en el día postnatal 0 (P0), y se desarrollan por la angiogénesis para formar un altamente organizard plexo vascular que llega a la periferia de la retina en aproximadamente 5 P8. Los vasos sanguíneos se desarrollan de una manera característica con el plexo capilar creciente gradualmente hacia fuera desde el disco óptico hacia la periferia para generar un modelo de alternancia regular de las arterias y venas con una red capilar intervenir. La vasculatura de la retina proporciona un modelo ideal para estudiar la angiogénesis como los vasos se pueden identificar fácilmente a medida que crecen en lo que es esencialmente un plano 2D, por lo que es relativamente fácil de examinar la vasculatura de la retina en los preparativos de montaje plana 5. Un método para el aislamiento de la retina del ratón neonatal para el análisis de las respuestas de células endoteliales punta durante varias horas ex vivo ha sido reportado 6. Alternativamente, una investigación más detallada de toda la vasculatura de la retina y de los marcadores vasculares asociadas requiere la inmunotinción de muestras de retina fijos en diferentes etapas de desarrollo.

Aquí proporcionamosuna descripción detallada de un método fiable y técnicamente sencillo que utilizamos para la tinción de todo el montaje de la retina plexo vascular murino, de la enucleación del ojo inicial postnatal (ver también 7) a través de los protocolos de tinción a la imagen final bajo el microscopio.

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Protocol

Todas las etapas se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.

1. Enucleación y Fijación de postnatal Eyes

  1. Coloque el ratón sacrifique a las crías en su lado, quitar la piel que cubre el ojo con unas tijeras.
  2. Con unas tijeras y pinzas para enucleación del ojo.
  3. Coloque las tijeras por debajo del ojo enucleado, cortar el nervio óptico y los tejidos circundantes y levantar la vista. Transferencia a una placa de 24 pocillos que contenía 4% de paraformaldehído (PFA) formado por 2x en PBS a temperatura ambiente.
  4. Permita que cada ojo para fijar por 10 - 15 min, luego traslado al frío 2x PBS en hielo durante 5 - 10 min. Es mejor escalonar enucleaciones y la posterior fijación para asegurar el grado de fijación es igual para cada ojo.

2. Disección de retinas murinos postnatales

  1. Transferencia de los ojos en una placa de Petri que contiene 2x PBS utilizando una pipeta Pasteur de plástico que se ha cortado para ensanchar el agujero y colocar en Dissección de microscopio.
  2. Retire toda la grasa alrededor de los ojos con unas pinzas y tijeras.
  3. Pierce el borde de la córnea con tijeras y cortar alrededor de la córnea y el iris y el descarte.
  4. Inserte pinzas entre la retina y la esclerótica y retire la esclerótica con cuidado de no romper la retina. La capa de la coroides también se puede quitar, pero si hay un riesgo de daño a la retina que ocurre durante este paso, la capa de la coroides se puede dejar en, ya que no debería afectar significativamente la calidad de la inmunotinción.
  5. Retire la lente y el humor vítreo utilizando pinzas.
  6. Retire los recipientes hialoides por reuniéndolos en el centro de la atención con unas pinzas finas y luego tire rápidamente lejos del centro de la retina (como alternativa tijeretazo en la base de los vasos hyaloid con tijeras finas).
  7. Enjuague la retina en forma de copa con PBS en una placa de Petri limpia.
  8. Hacer 4 a 5 incisiones radiales que alcanzan aproximadamente 2/3 del radio de la retina utilizando primavera scissors para crear una forma de "pétalo".
  9. Extraiga PBS utilizando una pipeta Pasteur para aplanar la retina y, a continuación, eliminar el exceso de PBS con un pequeño trozo de papel absorbente.
  10. Lentamente pipeta frío (-20 ° C) metanol gota a gota sobre la superficie de la retina hasta totalmente cubierto y luego inundación con metanol adicional. Esto le ayudará a fijar las retinas y facilitará la permeabilización. Las retinas se volverá blanco.
  11. Transferir a un tubo de 2 ml utilizando una pipeta Pasteur de plástico que ha sido cortado para ensanchar el orificio.
  12. Agregar la retina en metanol frío durante al menos 20 min antes de proceder con la inmunotinción. De los anticuerpos utilizados aquí, sólo la VE-cadherina no puede ser utilizado con éxito en las retinas fijadas con metanol. En este caso retinas deben proceder directamente a inmunotinción después del paso 9.
  13. Si es necesario, las retinas se puede almacenar en metanol a -20 ° C durante hasta varios meses antes de la tinción.

3. Immuno / isolectina tinción de la retina Vasculatura

  1. Retire cuidadosamente / verter el metanol y enjuagar suavemente retinas brevemente en PBS (en esta etapa de la retina se encuentra todavía en el mismo tubo de 2 ml de la etapa 11 anterior).
  2. Retire PBS y retinas de cobertura con 100 l de solución de Perm / Block (PBS + 0,3% Triton + 0,2% de BSA) + 5% de suero adecuado (vea la Tabla 1) y agite suavemente durante 1 hora.
  3. Retire Perm / Bloquear e incubar retinas con agitación suave durante la noche a 4 ° C con 100 l de anticuerpos primarios seleccionados (véase la Tabla 1) y / o IsolectinB4, todo preparada diluyendo en Perm / Bloquear.
  4. Retire anticuerpo / isolectina y lavar retinas 4 x 10 min en PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
  5. En algunos casos, por ejemplo, después de la tinción con IsolectinB4-Alexa488 o un anticuerpo primario conjugado directamente, no es necesario un anticuerpo secundario y las retinas se puede montar directamente (paso 7). Cuando un anticuerpo primario sin conjugar se ha utilizado en el paso 3, a continuación 100 l de la fluor apropiadoSe añade anticuerpo secundario escent (diluido 1/200 en PBSTx) y se deja incubar durante la noche a 4 ° C o durante 4 horas a temperatura ambiente.
  6. Retire anticuerpo secundario y lavar retinas 4 x 15 min en 2 ml PBSTx.
  7. Traslado retinas en portaobjetos utilizando una amplia perforación de plástico pipeta Pasteur y eliminar el exceso PBSTx con el tejido absorbente. Mount retinas por la adición de 50 l de prolongar medio de montaje sobre un portaobjetos y coloque suavemente sobre la retina.
  8. Transferencia desliza a refrigerador durante la noche a 4 º C, asegurando que son planas y protegido de la luz, para que el medio de montaje Prolongar para ajustar.
  9. Imagen retina utilizando un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia.

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Representative Results

Después de la disección de la retina debe ser similar a una flor plana (Figura 1). Al utilizar el protocolo, descrito anteriormente, las células endoteliales se pueden ver mediante la tinción de B4-isolectina Alexa488 y el apoyo a las células musculares vasculares se visualizaron utilizando actina de músculo liso anti-alfa (Figura 2). El punto de vista de baja potencia utilizando un objetivo de 5X en la Figura 2 permite una visión general de la organización vascular de la retina. Además, mediante el uso de una combinación diferente de anticuerpos dadas en el protocolo anterior, las células endoteliales se pueden ver usando inmunotinción anti-CD31 y pericitos de soporte están visto utilizando anticuerpos contra NG2 (Figura 3) o desmina (Figura 4). Tinción anti-desmina es útil para visualizar el dedo como los procesos de los pericitos y determinar si están estrechamente asociados con las células endoteliales. En contraste, la tinción anti-NG2 esboza los núcleos de cada uno de pericitos, que es útil cuandocuantificar el número de células pericitos en la vasculatura. Esto se hace contando el número de células por campo de visión con una alta potencia (por ejemplo, 60X) objetivo. Si es necesario, combinaciones alternativas de anticuerpos también se pueden utilizar (véase la Tabla 1), por ejemplo, anti-colágeno IV es útil para la visualización de la membrana basal vascular. Retinas que han sido teñidas para células endoteliales pueden ser analizados para las características clave de la angiogénesis tales como la progresión de la vasculatura desde el centro hacia el borde de la retina, la densidad vascular y la frecuencia de ramificación del vaso.

Figura 1
Figura 1. La aparición de una retina neonatal inmediatamente después de la disección y la adición de metanol. Esta imagen fue tomada usando un Zeiss Stemi SV6 y Axiocam HR cámara c.

La figura 2
Figura 2. La inmunotinción de todo montaje retinas (edad P7) con isolectina B4-Alexa488 (verde) (A), anti-alfa-actina de músculo liso Cy3 (rojo) (B) o combinada (C). Estas imágenes se tomaron con un Zeiss axioimager y cámara Axiocam HRM utilizando un objetivo de 5X. Tenga en cuenta el modelo de alternancia de las arterias y las venas. Las arterias son reconocidos por la zona libre capilar que de inmediato les rodea, y están recubiertas con células de músculo liso que se tiñen positivo (rojo) para actina alfa de músculo liso. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

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Figura 3 una doble inmunotinción de todo el montaje de retinas (edad P6) con el anticuerpo primario anti-CD31 (detectado con anti-IgG de rata conjugado con Alexa488, verde, A);. Anticuerpo primario y anti-NG2, detectado con anti-IgG de conejo conjugado con Alexa 594 (rojo, B). Estas imágenes confocal fueron tomadas con un objetivo de 60x combinando imágenes de escaneo láser de 13 rebanadas z, cada una de 0,47 m de espesor. Una superposición de imágenes en C muestra células endoteliales CD31-positivos (verde) y los pericitos NG2-positivo (rojo). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4
Figura 4 una doble inmunotinción de todo el montaje de retinas (edad P6) con el anticuerpo primario anti-CD31 (detectado con anti-IgG de rata conjugado con Alexa488, verde, A);. Anticuerpo primario y anti-desmina, detectado con anti-IgG de conejo conjugado con Alexa 594 (rojo, B). Estas imágenes confocal fueron tomadas con un objetivo de 60x combinando imágenes de escaneo láser de 21 z rebanadas, cada una de 0,24 m de espesor. Una superposición de imágenes en C muestra células endoteliales CD31-positivos (verde) y los pericitos desmina positivos (rojos). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

<td> Block Perm sólo
El anticuerpo primario Dilución de trabajo El bloqueo de la solución (Serum + Perm / Bloque) Anticuerpo secundario
Anti-NG2 (sulfato de condroitina proteoglicanos) 1:250 5% de suero de cabra De cabra anti-conejo Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% de suero de cabra De cabra anti-ratón Alexa 488
Anti-desmina 1:500 5% de suero de cabra De cabra anti-conejo Alexa 594
Anti-colágeno IV 1:200 5% de suero de cabra De cabra anti-conejo Alexa 594
Anti-endoglina 1:100 5% de suero de cabra De cabra anti rata Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% de suero de cabra De cabra anti rata Alexa 488
Anti-VE-cadherina 01:10 5% de suero de cabra De cabra anti rata Alexa 594
Anti-Alk1 01:25 5% de suero de burro Burro anti cabra Alexa 594
Lucha contra el ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tabla 1. Ejemplos de anticuerpos primarios para la tinción de inmunofluorescencia de las retinas de todo el montaje.

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Discussion

El método presentado aquí ofrece una manera sencilla y eficaz para obtener imágenes de las preparaciones de todo el montaje manchadas de retinas de ratones neonatales, por lo que es un modelo fácilmente cuantificables y fisiológicamente relevantes de la angiogénesis. Inicialmente, el ojo del ratón puede ser muy difícil de diseccionar debido a su pequeño tamaño y la forma de globo, por lo que un poco de práctica y las buenas herramientas de disección son necesarias para obtener resultados fiables. La disección de los ojos preparados en la concentración 2x ​​de PBS es importante porque esto hace que una pequeña cantidad de pérdida de agua de los ojos y reduce la presión intra-orbital, que facilita la disección. Una buena preparación de la retina es importante por varias razones. En primer lugar se mantiene la integridad de la vasculatura. En segundo lugar, si la vasculatura hialoidea no está bien retirado que reduce la eficiencia de la tinción de anticuerpos, lo que conduce a altos niveles de fondo y la disminución de resolución. Este problema puede producirse también si el tiempo de fijación de PFA de la retina es demasiado largo. Sin embargo,antes de la tinción, el almacenamiento a largo plazo, de hasta varios meses en metanol en el congelador a -20 ° C es adecuada antes de la tinción isolectina y para la mayoría de los anticuerpos en la Tabla 1. Aunque la tinción isolectina rara vez es problemático, lo hace macrófagos mancha además de las células endoteliales. Para una buena inmunotinción de todo el montaje de la retina, la elección de los anticuerpos es crítico y el protocolo de tinción debe ser adaptada de acuerdo a la especificidad del anticuerpo y la concentración, que puede variar entre los lotes cuando se utilizan anticuerpos policlonales. Fondo de alta por lo general puede ser reducido mediante la reducción de la concentración de anticuerpo, el aumento de tiempo de lavado o la adición de más detergente a los pasos de lavado. Los anticuerpos se dividen en partes alícuotas a la llegada y se almacenan tal como se indica por el fabricante. Para aquellos que se almacenan a -20 ° C, una alícuota de trabajo se mantiene en la nevera para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación. Si manchas fluorescentes brillantes en la muestra teñida, especialmente si esto también está presenteen la región alrededor del tejido, esto sugiere agregados precipitados de anticuerpos están presentes que debe ser eliminado en todos los experimentos posteriores por centrifugación el anticuerpo de 10.000 rpm durante 5 min antes de su uso. Algunos de los anticuerpos utilizados actualmente por nuestros laboratorios están en la lista de materiales con la dilución adecuada (Tabla 1). La elección de una combinación compatible de anticuerpos es muy importante para evitar la reacción cruzada no deseada entre los anticuerpos primarios y secundarios. La proliferación celular se puede monitorizar mediante la inyección de ratones con una solución de BrdU aproximadamente dos horas antes de la recolección del tejido. Este análogo de timina se incorpora en la proliferación de ADN y se puede detectar utilizando un anticuerpo anti-BrdU específica, como se ha descrito previamente 8.

Cada retina es muy frágil, pero se puede teñir para diferentes marcadores vasculares mediante el tratamiento del tejido con suavidad mientras se trabaja a través del protocolo. Una serie de controles se incluyen encada experimento para demostrar la especificidad de la tinción. Retinas no tratadas revelarán el grado de autofluorescencia en el tejido, lo que debería ser mínimo. Un control sin anticuerpo primario permitirá la determinación de la unión no específica del anticuerpo secundario para el tejido. Retinas que han sido arrancados accidentalmente durante la disección pueden proporcionar tejido útil para los controles. Después del montaje, la tinción fluorescente se mantiene durante varios días, siempre y cuando las diapositivas se almacenan a 4 ° C en la oscuridad. Imagen por microscopía de epifluorescencia se mejora por el uso de un apótoma, que elimina de enfocar la luz. Alternativamente, microscopía confocal ofrece imágenes de células-específica precisa (Figuras 3 y 4).

Este método tiene muchas aplicaciones posibles. Puede ser aplicado a ratones en los que los genes clave que regulan la angiogénesis están agotadas, incluyendo el trabajo que utiliza inducible Cre-loxP genética 8-10. Alternativamente angiogénesis retiniana puede sersiguientes tratamientos farmacológicos interrogados entrega sistémica o intra-ocular para investigar sus pro-o anti-angiogénicos efectos 11. También es posible tomar ventaja de las herramientas transgénicos disponibles y utilizar GFP o RFP ratones transgénicos para visualizar elementos clave de la vasculatura de la retina 11,12. (Tenga en cuenta que la fijación con PFA al 4% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente se utiliza en lugar de metanol para la etapa 2.12 del protocolo antes de la imagen endógena GFP o RFP en las retinas de ratones transgénicos.) Por otra parte, con el fin de estudiar la señalización molecular mecanismos, que es útil para visualizar la expresión de mRNA de los genes específicos en el plexo retina utilizando la hibridación in situ 13.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el Wellcome Trust y la Fundación Británica del Corazón.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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