Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi

Neuroscience

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Summary

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in un

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

L'angiogenesi è il complesso processo di formazione di nuovi vasi definito dalla germinazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi pre-esistente. Angiogenesi gioca un ruolo chiave non solo nel normale sviluppo di organi e tessuti, ma anche in molte malattie in cui la formazione del vaso sanguigno è disregolato, come il cancro, cecità e malattie ischemiche. Nella vita adulta, i vasi sanguigni sono generalmente quiescente così angiogenesi è un obiettivo importante per il romanzo lo sviluppo di farmaci per cercare di regolare la formazione di nuovi vasi specificamente nella malattia. Per capire meglio l'angiogenesi e di sviluppare strategie appropriate per regolarlo, i modelli sono richieste che rispecchiano fedelmente le varie fasi biologiche che sono coinvolti. Il mouse retina neonatale fornisce un eccellente modello di angiogenesi perché arterie, vene e capillari sviluppano a formare un plesso vascolare durante la prima settimana dopo la nascita. Questo modello ha anche il vantaggio di avere un due dibidimensionale (2D) Struttura rendendo semplice analisi rispetto alla complessa anatomia 3D di altre reti vascolari. Analizzando la retina plesso vascolare in tempi diversi dopo la nascita, è possibile osservare le varie fasi della angiogenesi al microscopio. Questo articolo illustra una procedura semplice per analizzare il sistema vascolare di una retina di topo mediante colorazione fluorescente con anticorpi specifici isolectin e vascolari.

Introduction

L'angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una 'punta' cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali 'gambo'. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una regione avascolare dove formano nuovi tubi vascolari. Al fine di stabilizzare questi tubi per sostenere il flusso di sangue, cellule endoteliali interagiscono con periciti e cellule muscolari lisce, che circondano i nuovi vasi sanguigni 1. Angiogenesi è essenziale per vascolarizzazione dell'embrione e tessuti in crescita. Tuttavia, essa contribuisce anche a molti patologicodisturbi cal come il cancro; che difetti di angiogenesi sono associati a malattie ischemiche. Lo sviluppo di trattamenti farmacologici efficaci per regolare l'angiogenesi come mezzo di trattamento malattia è quindi di grande interesse. Per esempio, efficaci fattori anti-angiogenici ridurranno la crescita del cancro, mentre strategie pro-angiogenici possono essere usati per trattare la malattia ischemica. Così, i modelli di angiogenesi sono essenziali per comprendere meglio la regolazione della formazione di nuovi vasi e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per migliorare o ridurre la crescita vascolare.

Un elemento fondamentale della ricerca angiogenesi è la scelta di un modello appropriato vascolare. Molti modelli in vitro sono stati progettati per riprodurre i passi base dell'angiogenesi come la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione e la sopravvivenza 2,3. Un frequentemente utilizzati saggio in vitro è la formazione di una rete ramificata di cellule endoteliali su una matrice in Matrigel, sebbene til suo non è specifico per le cellule endoteliali, né di solito incorporano il supporto di periciti o cellule muscolari lisce. Valutazione della ex vivo germinazione angiogenesi usando organo cultura mouse, ad esempio, il saggio corpo embrioide, il saggio anello aortico e il saggio metatarso fetale permette l'analisi di angiogenesi delle cellule endoteliali nel contesto delle cellule di supporto aggiuntivi. Tuttavia, le limitazioni principali di questi saggi comprendono la mancanza di flusso di sangue e la regressione dei vasi nel tempo, dando una limitata finestra di analisi. Pertanto, per comprendere la regolazione dell'angiogenesi, più precisamente, in modelli in vivo sono necessari come quelli sviluppati nel topo usando spugne impiantati sottocute o spine matrigel, così come il modello di ischemia dell'arto posteriore. Tuttavia, questi modelli sono difficili da analizzare a causa della complessa architettura 3D del neovasi. In contrasto, l'embrione zebrafish è dimostrato un modello eccellente per visualizzare angiogenesi in tuttamicrorganismo 4. Tuttavia, il topo è evolutivamente molto più strettamente correlato umano rispetto zebrafish, rendendo così il mouse un modello preferito in molti casi. Conseguentemente angiogenesi della retina topo postnatale rappresenta un metodo ben caratterizzato di scelta per la ricerca angiogenesi. Esso non solo fornisce un ambiente fisiologico, ma anche un 2D plesso vascolare che può essere facilmente visualizzato per mezzo di macchie fluorescenti appropriati. L'architettura della rete nave, proliferazione endoteliale, crescita, reclutamento di cellule perivascolari e vaso rimodellamento possono tutti essere studiata utilizzando questa tecnica.

Nella retina neonatale topo, lo sviluppo dei vasi retinici avviene nella prima settimana di vita postnatale. I topi, a differenza degli umani, nascono ciechi e le retine diventano solo vascolarizzato dopo la nascita. Vasi retinici nascono dal centro della retina vicino al nervo ottico al giorno postnatale 0 (P0), e si sviluppano da angiogenesi per formare un altamente organizzared plesso vascolare che raggiunge la periferia retinica di circa 5 P8. I vasi sanguigni si sviluppano in modo caratteristico con il plesso capillare gradualmente crescente verso l'esterno del disco ottico verso la periferia per generare un normale modello di alternanza delle arterie e delle vene, con una rete capillare di intervenire. La vascolarizzazione della retina fornisce un modello ideale per studiare l'angiogenesi come i vasi possono essere facilmente identificati come crescono in quello che è essenzialmente un piano 2D, rendendo così relativamente facile per esaminare la vascolarizzazione retinica nei preparati TV a montaggio 5. Un metodo per isolare il mouse retina neonatale per analisi delle risposte delle cellule endoteliali punta su diverse ore ex vivo è stato riportato 6. In alternativa, un esame più dettagliato di tutto il sistema vascolare della retina e marcatori vascolari associate richiede immunoistochimica di campioni di retina fisse a diversi stadi di sviluppo.

Qui forniamouna descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per tutta la colorazione monte della retina murina plesso vascolare, dalla enucleazione iniziale dell'occhio postnatale (vedere anche 7) attraverso i protocolli di colorazione per l'imaging finale al microscopio.

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Protocol

Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.

1. Enucleazione e la fissazione di postnatali Occhi

  1. Posizionare il mouse eutanasia cucciolo su un lato, togliere la pelle che copre gli occhi con le forbici.
  2. Utilizzare forbici e pinze per enucleare l'occhio.
  3. Luogo forbici sotto l'occhio enucleato, tagliare il nervo ottico e dei tessuti circostanti e sollevare l'occhio. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente 4% paraformaldeide (PFA) composto 2x in PBS a temperatura ambiente.
  4. Consentire ad ogni occhio di fissare per il 10 - 15 min, poi trasferimento al freddo 2x PBS in ghiaccio per 5 - 10 min. È meglio sfalsare enucleazioni e fissazione successiva per garantire il grado di fissazione è uguale per ogni occhio.

2. Dissezione di postnatali retine murini

  1. Trasferire gli occhi in una capsula di Petri contenente 2x PBS utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro e posto sotto una diffuamen microscopio.
  2. Rimuovere eventuale grasso intorno all'occhio con pinze e forbici.
  3. Pierce il bordo della cornea con forbici affilate e tagliare intorno alla cornea e iride e scartare.
  4. Inserire pinza tra retina e la sclera e rimuovere la sclera facendo attenzione a non strappare la retina. Lo strato coroide può anche essere rimosso, ma se vi è il rischio di danni alla retina occorrono durante tale fase, lo strato coroide può essere lasciato in quanto non dovrebbe influenzare significativamente la qualità della immunocolorazione.
  5. Rimuovere la lente e l'umor vitreo con pinze.
  6. Rimuovere i vasi hyaloids raccogliendo insieme nel centro dell'occhio con una pinza sottile poi rapidamente allontanarsi dal centro della retina (in alternativa snip alla base dei vasi hyaloid con le forbici sottili).
  7. Sciacquare la retina a forma di coppa con PBS in un piatto pulito Petri.
  8. Fare 4 a 5 incisioni radiali raggiungono circa 2/3 del raggio della retina mediante molla scissors creare una forma 'petalo'.
  9. Erogare PBS utilizzando una pipetta Pasteur per appiattire la retina, e quindi rimuovere l'eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente.
  10. Lentamente pipetta freddo (-20 ° C) il metanolo goccia a goccia sulla superficie della retina fino totalmente coperto e poi alluvione con ulteriore metanolo. Ciò contribuirà a risolvere le retine e faciliterà permeabilizzazione. Le retine diventeranno bianche.
  11. Trasferire in una provetta 2 ml utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro.
  12. Lascia retina in metanolo freddo per almeno 20 minuti prima di procedere con immunoistochimica. Degli anticorpi usati qui, solo VE-Caderina non può essere utilizzato con successo su metanolo retine fissi. In questo caso le retine devono proseguire dritto dell'immunocolorazione dopo il punto 9.
  13. Se necessario, le retine può essere conservato in metanolo a -20 ° C fino a diversi mesi prima della colorazione.

3. Immuno / colorazione isolectin della retina Vascuslatore

  1. Rimuovere con attenzione / versare via metanolo e delicatamente risciacquare retine brevemente in PBS (in questa fase la retina è ancora nella stessa 2 ml di tubo dal punto 11 di cui sopra).
  2. Rimuovere PBS e copertura retine con 100 ml di soluzione di Perm / blocchi (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% di siero appropriato (cfr. tabella 1) e agitare delicatamente per 1 ora.
  3. Rimuovere Perm / Blocca e incubare retine agitando delicatamente la notte a 4 ° C con 100 ml di anticorpi primari selezionati (vedi Tabella 1) e / o IsolectinB4, tutti preparati diluendo a Perm / blocchi.
  4. Rimuovere anticorpo / isolectin e lavare retine 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
  5. In alcuni casi, per esempio seguente colorazione con IsolectinB4-Alexa488 o un anticorpo primario direttamente coniugato, non è richiesto un anticorpo secondario e retine può essere montato direttamente (fase 7). Quando un anticorpo primario non coniugato è stato utilizzato nel passaggio 3, poi 100 microlitri della appropriata FluorÈ aggiunto anticorpo secondario escent (diluito 1/200 in PBSTx) e lasciata incubare una notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere anticorpo secondario e lavare retine 4 x 15 min in 2 ml PBSTx.
  7. Trasferire retine su vetrini utilizzando un ampio foro di plastica pipetta Pasteur e rimuovere l'eccesso PBSTx con tessuto assorbente. Mount retine con l'aggiunta di 50 ml di prolungare mezzo di montaggio su un vetrino e delicatamente posizione sopra la retina.
  8. Trasferimento scivola al frigorifero per una notte a 4 ° C, assicurando che siano piatte e al riparo dalla luce, per consentire al Prolungare montante per impostare.
  9. Retina immagine utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza.

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Representative Results

Dopo la dissezione della retina dovrebbe apparire come un fiore piatto (Figura 1). Utilizzando il protocollo, di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando isolectin colorazione B4-Alexa488 e sostenendo cellule muscolari vascolari sono visualizzati tramite actina muscolo liscio anti-alfa (Figura 2). La vista a bassa potenza usando un obiettivo 5X in figura 2 consente una visione d'insieme dell'organizzazione vascolare della retina. Inoltre, utilizzando una diversa combinazione di anticorpi indicati nel protocollo di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando immunocolorazione anti-CD31 e periciti supporto sono visti utilizzando anticorpi contro NG2 (Figura 3) o desmina (Figura 4). Colorazione anti-desmina è utile per la visualizzazione del dito come processi degli periciti e determinare se essi sono strettamente associati con le cellule endoteliali. In contrasto, colorazione anti-NG2 delinea i nuclei di ciascun periciti, che è utile quandoquantificare il numero di cellule periciti sul sistema vascolare. Ciò sarebbe fatta contando il numero di cellule per campo visivo usando una potenza elevata (ad esempio 60X) obiettivo. Se richiesto, combinazioni alternative di anticorpi possono essere utilizzati anche (vedi tabella 1), per esempio, anti-collagene IV è utile per la visualizzazione della membrana basale vascolare. Retine che sono stati macchiati per le cellule endoteliali possono essere analizzati per le caratteristiche chiave di angiogenesi, quali la progressione della vascolarizzazione dal centro verso il bordo della retina, la densità vascolare e la frequenza ramificazione vaso.

Figura 1
Figura 1. Aspetto di una retina neonatale immediatamente dopo la dissezione e l'aggiunta di metanolo. Questa immagine è scattata con un Zeiss Stemi SV6 e AxioCam HR fotocamera c.

Figura 2
Figura 2. Immunostaining di tutto il monte retine (età P7) con isolectin B4-Alexa488 (verde) (A), anti-alfa-actina del muscolo liscio Cy3 (rosso) (B), o risultante dalla fusione (C). Queste immagini sono prese con una Zeiss axioimager e AxioCam fotocamera HRM usando un obiettivo 5X. Si noti il modello di alternanza di arterie e vene. Le arterie sono riconosciuti dalla zona franca capillare che li circonda immediatamente, e sono rivestite di cellule muscolari lisce che macchiano positivo (rosso) per l'alfa actina del muscolo liscio. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 3 Doppia immunocolorazione di montare tutto retine (età P6) con anticorpo primario anti-CD31 (rilevata con anticorpi anti-IgG di topo coniugato a Alexa488, verde, A). Ed anticorpo primario anti-NG2, rilevata con IgG anti-coniglio coniugato Alexa 594 (rosso, B). Queste immagini confocale sono state scattate con un obiettivo 60X combina le immagini di scansione laser da 13 z fette, ciascuna di 0,47 micron di spessore. Una sovrapposizione di immagini in C mostra cellule endoteliali CD31-positive (verde) e periciti NG2-positive (rosso). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4
Figura 4 Double immunocolorazione di montare tutto retine (età P6) con anticorpo primario anti-CD31 (rilevata con anticorpi anti-IgG di topo coniugato a Alexa488, verde, A). Ed anticorpo primario anti-desmina, rilevata con IgG anti-coniglio coniugato Alexa 594 (rosso, B). Queste immagini confocale sono state scattate con un obiettivo 60X combina le immagini di scansione laser da 21 z fette, ciascuna di 0,24 micron di spessore. Una sovrapposizione di immagini in C mostra cellule endoteliali CD31-positive (verde) e periciti desmin-positivo (rosso). Clicca qui per ingrandire la figura .

<td> Perm Block solo
Anticorpo primario Diluizione di lavoro Blocco soluzione (Serum + Perm / blocchi) Anticorpo secondario
Anti-NG2 (Condroitin solfato proteoglicani) 1:250 5% siero di capra Capra anti coniglio Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 5% siero di capra Capra anti topo Alexa 488
Anti-Desmina 1:500 5% siero di capra Capra anti coniglio Alexa 594
Anti-collagene IV 1:200 5% siero di capra Capra anti coniglio Alexa 594
Anti-Endoglina 1:100 5% siero di capra Capra anti ratto Alexa 594
Anti-CD31 1:500 5% siero di capra Capra anti ratto Alexa 488
Anti-VE-caderina 01:10 5% siero di capra Capra anti ratto Alexa 594
Anti-Alk1 01:25 5% di siero asino Asino di capra anti Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / A

Tabella 1. Esempi di anticorpi primari per la colorazione di immunofluorescenza di intere retine mount.

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Discussion

Il metodo qui presentato offre un modo semplice ed efficace per ottenere immagini colorate preparativi monte intero di retine neonatali del mouse, il che rende un modello facilmente quantificabile e fisiologicamente rilevanti di angiogenesi. Inizialmente, l'occhio del mouse può essere molto difficile da sezionare grazie alle sue piccole dimensioni e la forma globo, quindi sono necessarie una certa pratica e di buoni strumenti di dissezione per risultati affidabili. Dissezione di occhi preparati in 2x concentrazione di PBS è importante perché questo provoca una piccola quantità di perdita di acqua dall'occhio e riduce la pressione intra-orbitale, che facilita la dissezione. Buona preparazione della retina è importante per diverse ragioni. Prima mantiene l'integrità del sistema vascolare. Secondo, se il sistema vascolare hyaloid non è ben rimosso riduce l'efficienza della colorazione anticorpale, portando ad alti livelli di background e diminuita risoluzione. Questo problema può verificarsi anche se la PFA tempo di fissazione della retina è troppo lunga. Tuttavia,prima della colorazione, stoccaggio a lungo termine fino a diversi mesi di metanolo nel -20 ° C congelatore è previsto prima della colorazione isolectin e per la maggior parte degli anticorpi in Tabella 1. Sebbene colorazione isolectin è raramente problematico, lo fa macrofagi macchia in aggiunta alle cellule endoteliali. Per buona immunocolorazione di montare tutto retine, la scelta di anticorpi è critica e il protocollo di colorazione deve essere adattato in funzione della specificità dell'anticorpo e la concentrazione, che può variare tra i lotti quando si usano anticorpi policlonali. Alta sfondo di solito può essere ridotta abbassando la concentrazione di anticorpi, aumentando il tempo di lavaggio o l'aggiunta di più detergente alle fasi di lavaggio. Anticorpi che un'aliquota all'arrivo e memorizzate come indicato dal costruttore. Per coloro che sono conservati a -20 ° C, una aliquota di lavoro viene conservato in frigorifero per evitare cicli ripetuti di congelamento scongelamento. Se le macchie fluorescenti luminosi appaiono sul campione macchiato, soprattutto se questo è presente anchenella regione intorno al tessuto, questo suggerisce aggregati precipitati di anticorpi sono presenti che dovrebbe essere rimosso in tutti gli esperimenti successivi mediante centrifugazione per l'anticorpo 10,000 rpm per 5 minuti prima dell'uso. Alcuni degli anticorpi attualmente utilizzati dai nostri laboratori sono in elenco dei materiali con la diluizione appropriata (Tabella 1). La scelta di una combinazione compatibile di anticorpi è molto importante per evitare indesiderate reazioni crociate tra anticorpi primari e secondari. La proliferazione cellulare può essere monitorato iniettando topi con una soluzione di BrdU circa due ore prima della raccolta del tessuto. Questo analogo timina è incorporato nel DNA proliferanti e può essere rilevato utilizzando un anticorpo anti-BrdU, come descritto in precedenza 8.

Ogni retina è molto fragile, ma può essere colorato per diversi marcatori vascolari trattando il tessuto delicatamente mentre lavorano attraverso il protocollo. Un certo numero di controlli sono inclusi nellaogni esperimento per mostrare la specificità della colorazione. Retine non trattati rivelerà il grado di autofluorescenza nel tessuto, che dovrebbe essere minimo. Una alcun controllo anticorpo primario consentirà di determinare il legame non specifico dell'anticorpo secondario al tessuto. Retine che sono stati accidentalmente strappate durante la dissezione possono fornire tessuto utile per i controlli. Dopo il montaggio, colorazione fluorescente viene mantenuto per diversi giorni finchè i vetrini vengono conservati a 4 ° C al buio. Imaging mediante microscopia ad epifluorescenza è migliorata con l'uso di un apotome, che rimuove fuori fuoco luce. Alternativamente, microscopia confocale fornisce accurate imaging cellulare-specifica (figure 3 e 4).

Questo metodo ha molte possibili applicazioni. Può essere applicata a topi in cui i geni chiave che regolano l'angiogenesi sono esaurite, compreso il lavoro che utilizza inducibile Cre-loxP genetica 8-10. Alternativamente angiogenesi retinica può essereseguenti trattamenti farmacologici interrogati consegnati sia sistemica o intra-ocularly per indagare i loro pro-o anti-angiogenica effetti 11. E 'inoltre possibile usufruire di strumenti transgenici disponibili e utilizzare GFP o RFP topi transgenici per visualizzare elementi chiave del sistema vascolare retinico 11,12. (Si noti che utilizzando fissazione PFA 4% in PBS per 1 ora a temperatura ambiente viene usato al posto del metanolo per passo 2.12 del protocollo prima di imaging endogena GFP o RFP in retine di topi transgenici.) Inoltre, al fine di studiare segnali molecolari meccanismi, è utile per visualizzare l'espressione di mRNA di geni specifici nel plesso retinica mediante ibridazione in situ 13.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust e della British Heart Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
  8. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5, (9), 1518-1534 (2010).
  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
  10. Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106, (8), 1425-1433 (2010).
  11. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16, (4), 420-428 (2010).
  12. Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, (12), 8701-8710 (2011).
  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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