Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese

Neuroscience

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Summary

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese em

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Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo. J. Vis. Exp. (77), e50546, doi:10.3791/50546 (2013).

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Abstract

A angiogénese é o processo complexo da nova formação de vasos sanguíneos definido pelo surgimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes. A angiogénese desempenha um papel importante não só no desenvolvimento normal dos órgãos e tecidos, mas também de muitas doenças em que a formação de vasos sanguíneos é desregulada, tal como o cancro, cegueira e doenças isquémicas. Na vida adulta, os vasos sanguíneos são geralmente de repouso para a angiogênese é um alvo importante para a novela desenvolvimento de drogas para tentar regular a formação de novos vasos especificamente na doença. A fim de entender melhor a angiogênese e desenvolver estratégias adequadas para regulamentá-la, os modelos são necessários que refletem com precisão as diferentes etapas biológicos que estão envolvidos. A retina do rato neonatal fornece um excelente modelo da angiogénese porque as artérias, veias e capilares desenvolver para formar um plexo vascular durante a primeira semana após o nascimento. Este modelo também tem a vantagem de ter um dois-disional estrutura (2D) fazendo análise directa em comparação com o complexo anatomia 3D de outras redes vasculares. Ao analisar o plexo vascular retiniano em diferentes momentos após o nascimento, é possível observar os diferentes estádios da angiogénese sob o microscópio. Este artigo demonstra um procedimento simples para analisar a vascularização da retina de um rato utilizando a coloração fluorescente com anticorpos específicos isolectin e vascular.

Introduction

A angiogénese é um processo de desenvolvimento complexo definida pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes e é regulada por vários caminhos de sinalização. A mais importante destas é a via de VEGF. VEGF é liberado por células isquêmicos e leva à abertura de angiogênico brotando nos vasos sanguíneos vizinhos. A principal célula endotelial vascular a partir de um novo rebento é uma célula "ponta", que produz filopodios que chegar em direcção à fonte de VEGF, e é seguida por proliferação de células endoteliais "stalk". Desta forma, as células endoteliais activadas migrar e proliferar no sentido de uma região avascular, onde formam novos tubos vasculares. A fim de estabilizar esses tubos para apoiar o fluxo sanguíneo, as células endoteliais, pericitos e interagir com as células musculares lisas, que rodeiam os vasos sanguíneos novos 1. A angiogénese é essencial para a vascularização do embrião e os tecidos em crescimento. No entanto, também contribui para muitos patológicasdistúrbios cal, tais como câncer, enquanto os defeitos na angiogênese estão associados com doenças isquêmicas. O desenvolvimento de tratamentos eficazes para regular a angiogénese de drogas como um meio para o tratamento da doença é, portanto, de grande interesse. Por exemplo, os factores anti-angiogénicos eficaz irá reduzir o crescimento do cancro, enquanto pró-angiogénicos estratégias podem ser usadas para tratar a doença isquémica. Assim, os modelos de angiogénese é essencial para compreender melhor a regulação da formação de novos vasos e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para aumentar ou diminuir o crescimento vascular.

Um elemento fundamental da pesquisa angiogénese é a escolha de um modelo adequado vascular. Muitos modelos in vitro ter sido concebido para reproduzir os passos básicos da angiogénese, tais como migração de células endoteliais, proliferação e sobrevivência 2,3. Um frequentemente utilizado no ensaio in vitro é a formação de uma rede ramificada de células endoteliais sobre uma matriz Matrigel, apesar de tele não é específico para células endoteliais, nem geralmente incorporam o apoio de pericitos ou de células musculares lisas. Avaliação ex vivo da angiogénese brotando do rato usando a cultura de órgãos, tais como o ensaio de corpo embrióides, o ensaio do anel aórtico e o ensaio metatarso fetal permite a análise da angiogénese de células endoteliais, no contexto de células de suporte adicionais. No entanto, as principais limitações destes ensaios incluem a falta de fluxo sanguíneo e a regressão dos vasos ao longo do tempo, dando uma janela limitada para análise. Portanto, para compreender a regulação da angiogénese, mais precisamente, em modelos in vivo são necessários, tais como os desenvolvidos em ratinhos usando esponjas implantadas subcutaneamente ou tampões matrigel, bem como o modelo de isquemia dos membros posteriores. No entanto, estes modelos são difíceis de analisar devido ao complexo de arquitectura em 3D do neovasos. Em contraste, o embrião do peixe-zebra demonstrou ser um excelente modelo para a visualização de angiogénese no conjunto4 organismo. No entanto, o rato é evolutivamente muito mais intimamente relacionada com a humana do peixe-zebra, tornando o rato um modelo preferido, em muitos casos. Consequentemente angiogénese da retina do rato pós-natal, representa um método bem caracterizado de escolha para a pesquisa da angiogênese. Ele não só proporciona um ambiente fisiológico, mas também um plexo vascular 2D que podem ser facilmente visualizada utilizando manchas fluorescentes adequadas. A arquitetura da rede de vasos, proliferação endotelial, surgimento, o recrutamento de células perivascular e remodelamento podem ser investigadas usando esta técnica.

Na retina de rato neonatal, o desenvolvimento dos vasos sanguíneos da retina ocorre na primeira semana de vida pós-natal. Ratos, ao contrário dos humanos, nascem cegos e as retinas só se tornam vascularizado após o nascimento. Vasos retinianos surgir a partir do centro da retina perto do nervo óptico no dia 0 pós-natal (P0), e por angiogénese desenvolver para formar um altamente organizard plexo vascular que atinge a periferia da retina de cerca de 5 P8. Os vasos sanguíneos em desenvolvimento de uma forma característica, com o plexo capilar progressivamente crescente para fora a partir do disco óptico para a periferia para gerar um padrão de alternância regular das artérias e veias, com uma rede capilar interveniente. A vasculatura retiniana fornece um modelo ideal para estudar angiogénese, porque os vasos pode ser facilmente identificado à medida que crescem no que é essencialmente um plano 2D, tornando-se assim relativamente fácil para examinar a vasculatura da retina em preparações plana de montagem 5. Um método para isolar a retina do rato neonatal para análise de respostas de células endoteliais da ponta ao longo de várias horas ex vivo, foi avaliado 6. Alternativamente, uma investigação mais detalhada de todo o sistema vascular da retina e marcadores vasculares associadas requer imunocoloração de amostras retina fixos em diferentes fases de desenvolvimento.

Aqui nós fornecemosUma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para a coloração de montagem todo o plexo vascular retiniana de murino, a partir da enucleação inicial de pós-natal do olho (ver também a 7) por meio dos protocolos de coloração para imagiologia último sob o microscópio.

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Protocol

Todos os passos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Enucleação e Fixação de pós-parto Olhos

  1. Posicione o mouse sacrificados filhote de cachorro de lado, retire a pele que cobre o olho com uma tesoura.
  2. Use uma tesoura e uma pinça para enuclear o olho.
  3. Coloque tesoura abaixo do olho enucleado, cortar o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira para uma placa de 24 poços contendo 4% de paraformaldeído (PFA) confeccionados em 2x PBS à temperatura ambiente.
  4. Permitir que cada olho para corrigir por 10 - 15 min, em seguida, transferir para o frio 2x PBS no gelo por 5 - 10 min. O melhor é escalonar enucleações e fixação posterior para garantir o grau de fixação é igual para cada olho.

2. Dissecção da Retinas Murino pós-parto

  1. Transferência de olhos em uma placa de Petri contendo 2x PBS usando uma pipeta Pasteur de plástico que foi cortada para alargar o furo e colocar sob um Dissecting microscópio.
  2. Retire toda a gordura ao redor dos olhos usando uma pinça e tesouras.
  3. Pierce a borda da córnea com uma tesoura afiada e corte em torno da córnea e íris e descarte.
  4. Insira fórceps entre retina ea esclera e remover a esclera tomando cuidado para não rasgar a retina. A camada coróide também pode ser removido, mas se houver um risco de danos na retina que ocorra durante este passo, a camada coróide, pode ser deixado em que não deve afectar significativamente a qualidade da imunocoloração.
  5. Retire a lente eo humor vítreo usando uma pinça.
  6. Remover os vasos hyaloids reunindo-os em conjunto no centro do olho com uma pinça fina e puxe rapidamente para longe do centro da retina (alternativamente recorte na base de vasos hialóide com uma tesoura fina).
  7. Enxágüe a retina em forma de copo com PBS em uma placa de Petri limpa.
  8. Adicione 4-5 incisões radiais que alcançam, aproximadamente, 2/3 do raio da retina utilizando mola Tesourasrs para criar uma forma de "pétala".
  9. Desenhe off PBS usando uma pipeta Pasteur para achatar a retina e, em seguida, retire o excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente.
  10. Lentamente pipeta frio (-20 ° C) queda de metanol por queda sobre superfície de retina até totalmente coberto e, em seguida, inundação com metanol adicional. Isso vai ajudar a consertar as retinas e irá facilitar a permeabilização. As retinas ficará branco.
  11. Transferir para um tubo de 2 ml usando uma pipeta de Pasteur de plástico que foi cortado para alargar o furo.
  12. Deixe retina em metanol frio por pelo menos 20 min antes de prosseguir com imunomarcação. Dos anticorpos utilizados aqui, apenas VE-caderina não pode ser utilizado com sucesso em metanol retinas fixos. Neste caso retinas precisa avançar direto para a imunocoloração após a etapa 9.
  13. Se necessário, as retinas podem ser armazenadas em metanol a -20 ° C durante vários meses antes da coloração.

3. Immuno / coloração isolectin da retina Vasculature

  1. Cuidadosamente remover / deitar fora metanol e lavar cuidadosamente as retinas brevemente em PBS (nesta fase a retina ainda está no mesmo tubo de 2 ml a partir da etapa 11).
  2. Remover PBS e tampa retinas com 100 ul de solução de Perm / Bloco (PBS + 0,3% Triton + BSA a 0,2%) + 5% de soro apropriado (ver Tabela 1) e agitar suavemente durante 1 hora.
  3. Remover Perm / Bloco retinas e incubar com agitação suave durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários seleccionados (ver Tabela 1) e / ou IsolectinB4, todas preparadas por diluição em Perm / bloco.
  4. Remover anticorpo / isolectin retinas e lavar 4 x 10 min em PBS + 0,3% de Triton (PBSTX).
  5. Em alguns casos, por exemplo, a seguir a coloração com IsolectinB4-Alexa488 ou a um anticorpo primário directamente conjugados com um anticorpo secundário não é necessária e as retinas podem ser montados directamente (passo 7). Quando um anticorpo primário não conjugado tenha sido utilizado no passo 3, em seguida 100 ul da adequado fluorescent anticorpo secundário (diluição 1/200 em PBSTX) é adicionado e deixado a incubar durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente.
  6. Remover o anticorpo secundário e lava-se as retinas de 4 x 15 min em 2 ml de PBSTX.
  7. Transferir retinas em lâminas utilizando uma grande furo pipeta de Pasteur de plástico e remover o excesso de tecido absorvente com PBSTX. Mount retinas pela adição de 50 mL de prolongar montagem sobre uma lamela e posição suavemente sobre a retina.
  8. Transferir lâminas para frigorífico durante a noite a 4 ° C, assegurando que são planas e protegida da luz, para permitir a montagem prolongar para definir.
  9. Retina de imagem usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência.

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Representative Results

Após a dissecção da retina deve ser semelhante a uma flor plana (Figura 1). Usando o protocolo descrito acima, as células endoteliais podem ser vistas por meio da coloração B4-Alexa488 isolectin e apoiando células musculares vasculares são visualizadas através de actina do músculo liso anti-alfa (Figura 2). O ponto de vista de baixa potência usando uma objetiva de 5X na Figura 2 permite uma visão geral da organização vascular da retina. Além disso, usando uma combinação de diferentes anticorpos indicados no protocolo acima, as células endoteliais podem ser vistos usando a imunocoloração anti-CD31 e pericitos comprovativos são vistos usando anticorpos contra NG2 (Figura 3) ou a desmina (Figura 4). Coloração anti-desmina é útil para visualizar o dedo, como os processos de pericitos e determinar se eles estão intimamente associados com as células endoteliais. Em contraste, a coloração anti-NG2 descreve os núcleos de cada pericyte, que é útil quandodeterminando o número de células pericyte sobre a vasculatura. Isso seria feito através da contagem do número de células por campo de visão usando um alto poder (por exemplo, 60X) objetiva. Se desejado, as combinações alternativas de anticorpos também podem ser utilizados (ver Tabela 1), por exemplo, anti-colagénio IV é útil para visualizar a membrana basal vascular. Retinas que foram coradas para células endoteliais pode ser analisada para características chave da angiogénese, tais como a progressão da vasculatura, do centro para a borda da retina, a densidade vascular e frequência de ramificação do vaso.

Figura 1
Figura 1. Aparecimento de uma retina neonatal imediatamente após a dissecção e adição de metanol. Esta imagem é feita com uma Zeiss Stemi SV6 e Axiocam HR câmera c.

Figura 2
Figura 2. Imunomarcação de toda montagem retinas (idade P7) com isolectin B4-Alexa488 (verde) (A), anti-alfa-actina de músculo liso Cy3 (vermelho) (B) ou fusão (C). Estas imagens são tiradas com uma Zeiss axioimager e câmera HRM Axiocam usando uma objetiva de 5X. Observe o padrão alternado de artérias e veias. As artérias são reconhecidos pela zona livre capilar que rodeia imediatamente, e são revestidas com células do músculo liso que coram positivo (vermelho) para a alfa-actina do músculo liso. clique aqui para ver figura maior .

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Figura 3 imunocoloração dupla de toda montagem retinas (idade P6) com o anticorpo primário anti-CD31 (detectado com anti-IgG de rato conjugado com Alexa488, verde, A),. Anticorpo primário e anti-NG2, detectado com anti-IgG de coelho conjugado com Alexa 594 (vermelho, B). Estas imagens confocal foram feitas usando um objetivo 60X combinando imagens de varredura a laser a partir de 13 fatias z, cada um de 0,47 m de espessura. Uma sobreposição de imagens em C mostra as células endoteliais CD31 positivas (verde) e pericitos NG2-positivos (vermelho). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4
Figura 4 imunocoloração dupla de toda montagem retinas (idade P6) com o anticorpo primário anti-CD31 (detectado com anti-IgG de rato conjugado com Alexa488, verde, A),. Anticorpo primário e anti-desmina, detectado com anti-IgG de coelho conjugado com Alexa 594 (vermelho, B). Estas imagens confocal foram feitas usando um objetivo 60X combinando imagens de varredura a laser a partir de 21 z fatias, cada uma de 0,24 m de espessura. Uma sobreposição de imagens em C mostra as células endoteliais CD31 positivas (verde) e pericitos desmina-positivas (vermelho). Clique aqui para ver a figura maior .

<td> Perm bloco só
O anticorpo primário Diluição de trabalho Solução de bloqueio (soro + Perm / Bloco) Anticorpo secundário
Anti-NG2 (sulfato de condroitina proteoglicanos) 1:250 Soro de cabra a 5% Goat anti coelho Alexa 594
Anti-GFAP 1:500 Soro de cabra a 5% Goat anti rato Alexa 488
Anti-desmina 1:500 Soro de cabra a 5% Goat anti coelho Alexa 594
Anti-Collagen IV 1:200 Soro de cabra a 5% Goat anti coelho Alexa 594
Anti-Endoglin 1:100 Soro de cabra a 5% Goat anti rato Alexa 594
Anti-CD31 1:500 Soro de cabra a 5% Goat anti rato Alexa 488
Anti-VE-caderina 01:10 Soro de cabra a 5% Goat anti rato Alexa 594
Anti-Alc1 01:25 5% de soro de burro Donkey anti cabra Alexa 594
Anti-ASMA-Cy5 1:100 N / D

Tabela 1. Exemplos de anticorpos primários para a coloração por imunofluorescência de retinas inteiras de montagem.

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Discussion

O método aqui apresentado oferece uma maneira simples e eficaz para obter imagens das preparações de montagem de retinas inteiras coradas neonatais de rato, tornando-se um modelo facilmente quantificáveis ​​e fisiologicamente relevante da angiogénese. Inicialmente, o olho do rato pode ser bastante difícil para dissecar devido ao seu pequeno tamanho e forma do globo, então um pouco de prática e boas ferramentas de dissecação são necessários para obter resultados confiáveis. Dissecação de olhos preparado na concentração 2x de PBS é importante porque isso faz com que uma pequena quantidade de perda de água a partir do olho e reduz a pressão intra-orbital, o que facilita o esvaziamento. Uma boa preparação da retina é importante por várias razões. Primeiro que mantém a integridade da vasculatura. Em segundo lugar, se a vasculatura hialóide não é bem removido reduz a eficiência da coloração do anticorpo, conduzindo a elevados níveis de fundo e diminuiu resolução. Este problema também pode ocorrer se o tempo de fixação do PFA da retina é muito longo. No entanto,antes da coloração, o armazenamento a longo prazo, até vários meses em metanol no congelador de -20 ° C é adequada isolectin antes da coloração e para a maioria dos anticorpos presentes na Tabela 1. Embora a coloração isolectin raramente é problemático, faz macrófagos mancha além das células endoteliais. Para uma boa montagem de toda a imunocoloração retinas, a escolha de anticorpos é crítico e o protocolo de coloração deve ser adaptado de acordo com a especificidade do anticorpo e da concentração, que pode variar de lote para lote, quando são usados ​​anticorpos policlonais. Alta fundo geralmente pode ser reduzida baixando a concentração de anticorpo, o aumento do tempo de lavagem ou a adição de mais detergente nos passos de lavagem. Os anticorpos são aliquotadas e armazenadas na chegada, como indicado pelo fabricante. Para aqueles que são armazenadas a -20 ° C, uma alíquota de trabalho é mantido no frigorífico, para evitar ciclos repetidos de congelamento descongelamento. Se manchas fluorescentes brilhantes aparecem na amostra manchada, especialmente se este também está presentena região em volta do tecido, isto sugere agregados precipitados de anticorpo estão presentes, que devem ser removidos em todas as experiências subsequentes, através da centrifugação do anticorpo para 10.000 rpm durante 5 min antes da utilização. Alguns dos anticorpos actualmente utilizados pelos nossos laboratórios estão na lista de materiais, com uma diluição adequada (Tabela 1). Escolhendo uma combinação compatível de anticorpos é muito importante para evitar reação cruzada indesejada entre anticorpos primários e secundários. A proliferação celular pode ser monitorizada por injecção de ratinhos com uma solução de BrdU aproximadamente duas horas antes da colheita do tecido. Este análogo timina está incorporada proliferando DNA e pode ser detectada utilizando um anticorpo anti-BrdU específico, como previamente descrito 8.

Cada retina é muito frágil, mas pode ser corada para marcadores vasculares diferentes por tratamento do tecido gentilmente durante o trabalho com o protocolo. Um certo número de controlos estão incluídas nacada experimento para mostrar a especificidade da coloração. Retinas não tratados revelará o grau de autofluorescência no tecido, o qual deve ser mínimo. Um controlo sem anticorpo primário irá permitir a determinação da ligação não específica do anticorpo secundário para o tecido. Retinas que foram acidentalmente arrancados durante a dissecção pode fornecer tecido útil para controles. Após a montagem, a coloração fluorescente é mantido durante vários dias, enquanto as lâminas são armazenadas a 4 ° C no escuro. Imagem por microscopia de epifluorescência é melhorada pela utilização de um ApoTome, que remove fora de foco de luz. Alternativamente, proporciona imagens de microscopia confocal de células específicas de precisão (Figuras 3 e 4).

Este método tem muitas aplicações possíveis. Ele pode ser aplicado a ratinhos em que os genes-chave que regulam a angiogénese estão esgotados, incluindo trabalho que utiliza induzível Cre-loxP genética 8-10. Alternativamente, a angiogénese pode ser retinaseguintes tratamentos medicamentosos interrogados entregue via sistêmica ou intra-ocular para investigar as suas pró-ou anti-angiogênico efeitos 11. Também é possível tirar vantagem das ferramentas disponíveis transgénicos e utilizar GFP ou ratinhos transgénicos RFP para visualizar elementos fundamentais da vasculatura retiniana 11,12. (Note-se que a fixação com PFA a 4% em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente, é usado em vez de metanol para o passo 2.12 do protocolo antes da imagem endógeno GFP ou RFP em retinas de ratinhos transgénicos.) Além disso, a fim de estudar sinalização molecular mecanismos, que é útil para visualizar a expressão de mRNA de genes específicos no plexo da retina utilizando hibridização in situ 13.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust e da Fundação Britânica do Coração.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Plastic pipettes 3 ml Scientific Laboratory Supplies PIP4210 Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates Scientific Laboratory Supplies 353226
Select Petri dishes TV 90 mm Scientific Laboratory Supplies SLS2002
Histobond slides VWR 631-0624
Coverslips 22 x 22 mm VWR 631-1336
Dumont Tweezers #5 World precision instruments 14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades World precision instruments 501235 Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 500086 Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips World precision instruments 501778 Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml Starlab E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasic Sigma S0876 PBS reagent
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 PBS reagent
Sodium chloride Sigma S9625 PBS reagent
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA Sigma A7638
Triton X-100 Sigma T9284
Donkey serum Sigma D9663
Goat serum Vector S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent Invitrogen P36930 Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594 Invitrogen I21413 Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488 Invitrogen I21411 Use at 1:200 dilution
Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) Millipore AB5320 Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) Millipore MAB360 Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) Millipore 04-585 Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) Chemicon AB756P Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) Sigma C6198 Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) BD Pharmingen 550546 Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) BD Pharmingen 553370 Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) BD Pharmingen 550548 Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal) R&D Systems AF770 Detects endothelial cells
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594 Invitrogen A11012 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488 Invitrogen A11006 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594 Invitrogen A11007 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488 Invitrogen A11029 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594 Invitrogen A11058 All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Microscopes
Dissection microscope Zeiss Stemi SV6
Camera Zeiss Axiocam HRc Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope Zeiss Axioimager with Apotome
Camera Zeiss Axiocam HRm Camera for Axioimager
Confocal Microscope Nikon A1R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, (7347), 298-307 (2011).
  2. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85, (5), 233-248 (2004).
  3. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, (2-3), 172-183 (2007).
  4. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248, (2), 307-318 (2002).
  5. Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10, (2), 77-88 (2007).
  6. Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5, (10), 1659-1665 (1038).
  7. Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
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  9. Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7, (9), e39336 (2012).
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  13. Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7, (6), 1086-1096 (2012).

Comments

5 Comments

  1. Thank you for an excellent tutorial on whole mounting of neonatal mouse retina!

    I was wondering: when you are mounting the dissected retina on the object glass after several steps of washing/staining, how can you tell that you mount it the correct way and not upside down?

    Thank you!

    Best regards,

    Tora Sund Morken, NTNU, Norway

    Reply
    Posted by: Tora m.
    May 5, 2015 - 4:49 AM
  2. Thanks for your comment. There are two ways to know that mounting of your retina is correct. First, the side of the retina in contact with the choroid layer is always darker than the inside of the retina. Second, most of the time the flattened retina will have a slight curve and a cup morphology. This will help you to decide if your retina is correctly mounted.”

    Reply
    Posted by: Helen A.
    May 5, 2015 - 7:33 AM
  3. Hello, the protocol was really excellent for retina staining of neonatal pups when I have tried !
    Here I have some questions that confuse me.1: if I want to dissect the retina for western blot or real time PCR,whether I can use the 2X PBS, will it affect the mRNA or the protein? 2: The eyes followed by the 2x PBS after fixation usually will stay more than 10 minutes, because I fixed eyes in the 4% PFA after euthanasia in the vivarium room,which often means eight or ten eyes meantime, it takes a maybe 1 hour to dissect all the retinas. how I can deal with the issue?or just put the eyes which I cannot dissect meantime in the 1XPBS (cold) first ,when I need to dissect it ,then transfer the eye into 2XPBS 5-10 minutes ahead .3:Recently I have done lots of whole mount retina staining ,but the protein like GIT1 or VEGFR3 or ERG almost can not be stained ,I prolonged the time of primary antibody included the secondary antibody ,but still fails.I was wondering the co-staining of two or three primary antibody will interference each other or I need increase the concentration of Triton? I am struggling with the issue,and I have already avoided the interact of secondary antibody.

    thank you

    your sincerely

    Guofu zhu

    Reply
    Posted by: Zhu, G.
    December 13, 2015 - 1:01 AM
  4. 1. For RNA extraction, I dissected unfixed retinas in 1xHBSS + 0.1%BSA +2mM EDTA on ice .

    2. I staggered the enucleations by 1 min per eye, so that all eyes were fixed for exactly 10 min. The eyes are held in 2XPBS on ice during the rest of the removals.

    3.Often it is the fixation or the methanol storage which interferes with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after retina dissection rather than storing in the freezer

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 9:51 AM
  5. 1. For qPCR, I have dissected the retinas in: 1xHBSS +0.1%BSA +2mM EDTA on ice, without fixation of the eyes.

    2. I staggered the dissections of each pup by 2min ( or however long it takes to remove the eyes), so all the eyes have exactly 10 min fixation. After this, the eyes can stay in cold 2XPBS on ice during the retina dissections.

    3. Often it is the fixation step or the methanol storage steps which can interfere with the staining. Don't fix for longer than 10 min, and try staining immediately after dissection, rather than store in the freezer.

    Reply
    Posted by: Kathleen R A.
    December 15, 2015 - 6:05 AM

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