MR التصوير الجزيئي للسرطان البروستاتا مع وكيل النقيض المستهدفة الجزيئية الببتيد الصغيرة CLT1

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

لإثبات السرطان MR التصوير الجزيئي مع الببتيد الصغيرة المستهدفة التصوير بالرنين المغناطيسي وكيل النقيض محددة لبروتينات البلازما في متخدر سدى الورم في الفأر نموذج البروستاتا السرطانية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wu, X., Lindner, D., Yu, G. P., Brady-Kalnay, S., Lu, Z. R. MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent. J. Vis. Exp. (79), e50565, doi:10.3791/50565 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الورم المصفوفة خارج الخلية لديها وفرة من البروتينات المرتبطة بالسرطان التي يمكن أن تستخدم المؤشرات الحيوية للسرطان التصوير الجزيئي. في هذا العمل، أثبتنا فعالية سرطان MR التصوير الجزيئي مع الببتيد الجزيئية الصغيرة المستهدفة GD-DOTA معقدة أحادي الأميد باعتباره التصوير بالرنين المغناطيسي وكيل النقيض المستهدفة محددة لبروتينات البلازما متخدر في الورم سدى. أجرينا تجربة تقييم فعالية وكيل للكشف غير الغازية من ورم البروستاتا مع التصوير بالرنين المغناطيسي في الماوس مثلي PC-3 البروستاتا نموذج السرطان. وكان وكيل النقيض المستهدفة فعالة لإنتاج كبيرة تعزيز الورم في المقابل جرعة منخفضة من 0.03 ملمول ش ج / كجم. الببتيد المستهدفة التصوير بالرنين المغناطيسي عامل تباين واعدة لMR التصوير الجزيئي للورم البروستاتا.

Introduction

التصوير الفعال للأهداف المتعلقة السرطان الجزيئي ذات اهمية كبيرة لتحسين دقة في وقت سابق الكشف عن سرطان والتشخيص. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) هو طريقة التصوير السريري قوية لقرار مكانية عالية واي اشعاعات التأين 1. ومع ذلك، ليس وكيل النقيض المستهدفة متاح لسرطان MR السريرية التصوير الجزيئي. أن التصميم المبتكر والتنمية المستهدفة عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي دفع كثيرا من تطبيق سرطان MR التصوير الجزيئي. وقد بذلت جهود كبيرة لتطوير عوامل التباين المستهدفة للتصوير MR من المؤشرات الحيوية أعربت على سطح الخلايا السرطانية. نظرا لحساسية منخفضة نسبيا من التصوير بالرنين المغناطيسي وتركيز منخفض من هذه المؤشرات الحيوية، فإنه يشكل تحديا لتوليد تعزيز النقيض كافية لMR فعالة التصوير الجزيئي باستخدام عوامل التباين الجزيئي صغيرة استهدفت 2،3. من أجل الحصول على تعزيز كافية، ونظم تسليم مختلف يمثتم إعداد ح كما الليبوزومات، النانوية وتقارن البوليمر مع حمولة عالية من ممغطس كلمة المدير العام (III) يخلب لزيادة تركيز المحلية من عوامل التباين في المواقع المستهدفة 4،5. على الرغم من أن هذه الأنظمة تسليم تمكنوا من توليد تعزيز الورم كبيرا في النماذج الحيوانية، نتج أحجامها كبيرة في القضاء بطيئة وغير مكتملة من الجسم، مما يؤدي إلى تراكم طويلة من السامة كلمة المدير العام (III) الأيونات، والتي قد تسبب مخاوف تتعلق بالسلامة خطيرة 6. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت بعض الدراسات أن القيود المفروضة على التصوير بالرنين المغناطيسي للتصوير الجزيئي يمكن التغلب عليها من خلال تحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية السليم مع التعبير المحلية عالية في الآفات واستخدام وكلاء الجزيئية الصغيرة التي يمكن أن تفرز بسهولة 7،8. الميزة الرئيسية لهذه العوامل هو أنها تستهدف الواسمات الجزيئية الحاضر بكثرة في الأنسجة المريضة مع وجود القليل من الأنسجة الطبيعية. وتركيز عال من عوامل التباين يمكن ربط هذه الأهداف، مما أدى إلى sufficient تعزيز النقيض للتصوير الجزيئي فعالة MR. منذ حجمها أصغر من عتبة الترشيح الكلوي، عوامل التباين غير منضم يمكن بسهولة أن تفرز من الجسم مع تقليل الضوضاء الخلفية. قمنا بتحديد العلامات البيولوجية المرتبطة بالسرطان عالمية، بروتينات البلازما متخدر، والتي توجد بوفرة في الورم سدى، ونادرا ما تكون موجودة في أنسجة طبيعية 9. نحن توليفها وكيل النقيض المستهدفة التي تحتوي على الببتيد صغيرة تستهدف CGLIIQKNEC (CLT1)، والذي أظهر محددة قوية ملزمة لPC3 البروستاتا الورم نموذج 10، وأربعة يخلب أحادي الأميد GD-DOTA. هنا، ونحن نقدم منهجية لسرطان MR التصوير الجزيئي للكشف عن الأورام في الفئران.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بروتوكول مقتبسة من دراسة قبل 11.

1. إختبارات من GD-DOTA لCLT1 الببتيد

  1. باستخدام معيار الببتيد التوليف الصلبة مرحلة وتوليف CLT1 الببتيد (CGLIIQKNEC) من الأحماض الأمينية Fmoc المحمية على راتنج كلوريد 2-chlorotrityl (1.0 ملمول).
  2. بعد إضافة حمض أميني النهائي، cyclize الببتيد الخطية على الراتنج مع الثاليوم (III) trifluoroacetate (1.09 غرام، 2.0 ملمول، 2 يعادله) في DMF (20 مل) في 0 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  3. المقبل، والمكورات PEG يسين بالتتابع إلى N-محطة من CLT1 الببتيد (1.0 ملمول) على الراتنج عن طريق تفاعل متسلسل مع Fmoc-NH-PEG-COOH (3.0 ملمول)، Fmoc-ليز (Fmoc)-OH (3.0 ملمول)، والدفعة الثانية من Fmoc-ليز (Fmoc)-OH (6 ملمول).
  4. إزالة Fmoc مع تأكسد. إضافة DOTA-تريس (ر بو) (4.58 غ، 8.0 ملمول، 2 حكمه على كل مجموعة الأمينية) لتتفاعل مع الأمينات أربعة خالية من dendrimer يسين على الراتنج لمدة 2 ساعة.
  5. أخيرا، ويلتصق deprotect المنتجمن راتنج عن طريق التعامل مع كوكتيل من حمض trifluoroacetic، والمياه، وtriisobutylsilane (TIS) (20 مل، 95/2.5/2.5) لمدة 8 ساعة على RT. إزالة الراتنج عن طريق الترشيح تليها الغسيل مع حمض trifluoroacetic (TFA). إضافة الرواشح مجتمعة قطرة قطرة إلى الأثير الباردة الإيثيلي (200 مل)، أجهزة الطرد المركزي، ويغسل مع الأثير إيثيل 4X. تجف تحت فراغ لإعطاء عديم اللون الصلبة (1.99 غرام، 61٪ العائد).
  6. تنقية الناتج الخام مع HPLC التحضيرية باستخدام التدرج من 0-40٪ المذيبات B (0.1٪ في أسيتونتريل TFA) في المذيبات A (TFA 0.1٪ محلول مائي) لمدة 20 دقيقة و40-90٪ مذيب B في مذيب لمدة 10 دقيقة .
  7. حل CLT1-ديسيلتر (DOTA) 4 (250 ملغ، 0.077 ملمول) في الماء DI (15 مل)، وضبط درجة الحموضة إلى 6 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم. إضافة كلمة المدير العام (سلا) 3 .4 H 2 O (472 ملغ، 0.462 ملمول، 1.5 المعادل لDOTA أحادي الأميد) في أجزاء إلى حل، مع الحفاظ على درجة الحموضة في 6 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم. يحرك محلول التفاعل على RT لمدة 48 ساعة.
  8. مجمع ش ج المتبقية (III) مع البريدحمض thylenediaminetetraacetic (EDTA) (90 ملغ، 0.31 ملمول)، وتنقية الناتج الخام مع عمود حجم الاستبعاد لإعطاء المنتج النهائي CLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 (169 ملغ، 57٪).

2. توصيف عوامل التباين

  1. قياس كلمة المدير العام (III) مع المحتويات بالحث البلازما مطياف الانبعاث الضوئي.
  2. اكتساب بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز / التأين وقت من الطيران (MALDI-TOF) أطياف الشامل في وضع خطي مع حمض 2،5-dihydroxybenzoic (2،5-DHB) في شكل مصفوفة.
  3. قياس أوقات الاسترخاء من محلول مائي من عوامل التباين من CLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 وكيل السيطرة nontargeted sCLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 مع تركيزات مختلفة في 60 ميغاهيرتز (1.5 T) مع relaxometer في 37 درجة مئوية. استخدام تسلسل نبض استرداد انعكاس لقياس T 1 و تسلسل كار-بورسيل-Meiboom-500 مع جيل أصداء لقياس T 2. حساب T 1 و T 2 relaxivities من الوكلاء البريد من منحدرات المؤامرات من 1 / T 1 و 1/2 T مقابل تركيزات ش ج.

3. الثقافة الخلية وتطوير نموذج حيواني مع ورم مثلي PC3 البروستاتا

  1. ثقافة PC3 البروستاتا الخلايا السرطانية مع التعبير التأسيسية للبروتين مضان الخضراء (GFP) في RPMI المتوسطة تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني والبنسلين / الستربتوميسين / fungizone، والحصاد من قبل trypsinization و resuspend في كثافة 2.5 × 10 4 خلية / ميكرولتر PBS.
  2. الحفاظ على المعاهد الوطنية للصحة الفئران عارية athymic الذكور (4-5 أسابيع من العمر) في مرفق Athymic الحيوان الأساسية، جامعة كيس ويسترن ريزيرف (CWRU) وفقا لبروتوكول الحيوانية التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية CWRU.
  3. تم رش الأسطح الجراحية مع 2٪ محلول الكلورهيكسيدين ثم مغطاة الستائر ماصة. كانت ترتديه والقفازات الجراحية المعقمة أثناء العملية. قبل الجراحة الحيوانية، والملكية الفكرية حقن آفيرتين (250 ملغ / كغ) إلى anesthetizالبريد الفئران. بدلا من ذلك، يمكن استخدام الكيتامين / زيلازين / آسيبرومازين بتركيز 50/5/1 ملغم / كغم. تم تطبيق مرهم للعين لالماوس للحفاظ على رطوبة كافية أثناء التخدير.
  4. بدء الجراحة عن طريق قطع شق صغير من خلال الجلد والغشاء البريتوني على طول خط الوسط السفلي بطول حوالي 1 سم باستخدام مشرط معقم. وتمت تغطية ثنى الجراحية المعقمة حول موقع شق أثناء العمليات الجراحية البقاء على قيد الحياة.
  5. من الداخل للظاهر بلطف وتحقيق الاستقرار في الفصوص الظهرية البروستاتا لفضح البروستاتا. حقن خلايا تعليق PC3-GFP في برنامج تلفزيوني (20 ميكرولتر) في البروستاتا مع إبرة قياس 30. أخيرا إغلاق شق الجرح مع autoclip 12.
  6. لرصد آخر إجراء، ومراقبة الحيوانات مرتين يوميا لمدة 1 أسبوع. وتشمل علامات المرض نقص الأكل، وجمع البول الداكن حول مجرى البول، ومشية غير مستقرة والتي يمكن أن تشير إلى الإصابة أو انسداد المثانة في المواد الغذائية.
  7. بعد 10 أيام، وإزالة رانه المواد الغذائية باستخدام مزيل التيلة. مراقبة الحيوانات يوميا لتقييم حجم الورم وأي دليل على الألم مثل فقدان الوزن، والانحرافات السلوكية، وعيوب السيارات. الموت ببطء الحيوانات التي أظهرت حجم الورم تتجاوز الحد المسموح به أخلاقيا أو أدلة من الألم أثناء نمو الورم.

4. تأكيد ورم خصوصية ملزم من الببتيدات مع الإسفار التصوير وعلم الأنسجة

  1. بعد التلقيح الخلايا السرطانية، والسماح حوالي 4 أسابيع من نمو الورم قبل البدء مع التصوير. قبل الحقن للتحقيقات الببتيد، الحصول على صور مضان GFP مع الفئران الحية على تصوير مضان للتحقق من وجود الورم.
  2. رابعا حقن المسمى تكساس الأحمر الببتيدات إلى الورم الحاملة الفئران بجرعة من 10 نانومول / الماوس.
  3. التضحية الفئران 2 ساعة في وقت لاحق من قبل خلع عنق الرحم، وجمع الورم والأجهزة الرئيسية، وعلى الفور صورة على تصوير مضان. استخدام مرشحات الضوء الأخضر لGFP (الإثارة: 444-490 نانومتر؛ الانبعاثات: 515 نانومتر مرشح تمريرة طويلة؛ إعدادات الاستحواذ: 500-720 في 10 خطوات نانومتر) ومرشحات الضوء الأحمر لتكساس الأحمر (الإثارة: 576-621 نانومتر؛ الانبعاثات: 635 نانومتر مرشح تمريرة طويلة؛ الاستحواذ الإعدادات: 630-800 في 10 خطوات نانومتر). 10 ميللي ثانية زمن التعرض للGFP و 150 ميللي ثانية لتكساس الأحمر.
  4. مباشرة بعد قياس مضان النسيج كله، وجمع أنسجة الورم، مع تحديد الفورمالين، وcryosection إلى شرائح 5 ميكرون.
  5. بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني، جبل مع 1 قطرة من تصاعد المتوسط ​​تحتوي على 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي)، الصورة فورا على المجهر متحد البؤر المسح الضوئي ليزر.

5. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)

  1. بعد ما يقرب من 4 أسابيع التلقيح الخلايا السرطانية، والسماح للأورام لتنمو لتصل إلى 0.3-0.6 سم وقطرها. استخدام الماسح الضوئي 7 T التصوير بالرنين المغناطيسي مع الترددات الراديوية حجم (RF) لفائف للتصوير بالرنين المغناطيسي الدراسة.
  2. تخدير الماوس مع 2٪ خليط isoflurane والأكسجين في غرفة تحريض isoflurane و. OPHتم تطبيق مرهم thalmic إلى الماوس للحفاظ على رطوبة كافية أثناء التخدير.
  3. إدراج إبرة قياس 30 إلى 1.0 متر أنابيب طويلة مليئة heparinized المالحة. وضع القسطرة عصامي في الوريد ذيل الفأر.
  4. ضع الماوس في جذب والاحتفاظ تحت التخدير استنشاق مع 1.5٪ isoflurane والأكسجين عبر مخروط الأنف.
  5. وضع جهاز استشعار الجهاز التنفسي متصلة نظام رصد على البطن لمراقبة معدل وعمق التنفس. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية التي تهب الهواء الساخن في المغناطيس من خلال نظام التحكم في ردود الفعل.
  6. تبدأ الصور قسم السهمي باستخدام تسلسل إضفاء الطابع المحلي لتحديد موقع الورم (TR / TE = 200/3.7 ميللي ثانية، فوف = 3.0 سم، وسمك شريحة = 2.2 مم، عدد = 16 شريحة، متوسط ​​= 2، وزاوية الوجه = 45 درجة، مصفوفة = 128 × 128).
  7. استخدام التدرج تسلسل قمع الدهون 2D T1 المرجحة للحصول على الصور المحوري 2D لCE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 ميللي ثانية، فوف = 3.0 سم × 3.0 سم، قسمك القمل = 1.2 مم، عدد شريحة = 12، متوسط ​​= 1، وزاوية الوجه = 80 درجة، مصفوفة = 128 × 128).
  8. بعد ما قبل الحقن الحصول على الصور MR خط الأساس، والبدء في ضخ وكيل أو وكيل استهدفت السيطرة على جرعة من 0.03 ملمول ش ج / كجم من قبل بيغ مع 200 ميكرولتر من المياه المالحة.
  9. الاستمرار في الحصول على صور CE-MRI في نقاط زمنية مختلفة لمدة تصل إلى 30 دقيقة.

6. معالجة الصورة والتحليل

  1. استخدام برامج التصوير لتحليل الصور.
  2. رسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) على الورم كله والكلى في الطائرة التصوير ثنائي الأبعاد وقياس متوسط ​​كثافة الإشارة.
  3. لقياس البيانات CE-التصوير بالرنين المغناطيسي، قياس الورم أو تعزيز النقيض الكلى (ΔSNR) من خلال حساب الزيادة في آخر التباين SNR أكثر من قبل النقيض SNR باستخدام المعادلة التالية: ΔSNR = (S ر / ر σ) - (S 0 / σ 0)، حيث S و S ر 0 دلالة الإشارة في تومأو أو الكلى قبل وبعد النقيض من ذلك، وσ σ 0 و ر هي الانحراف المعياري لقياس الضوضاء الخلفية من الجو قبل وبعد التباين.
  4. حساب القيم ص باستخدام ثنائي الطرف اختبار t للطالب، على افتراض دلالة إحصائية عند P <0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1 يصور توليف وكيل النقيض المستهدفة CLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) (4) والخطة الشاملة للتجربة. CLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 عروض relaxivity أعلى بكثير من السريرية GD-DOTA (الجدول 1). في 1.5 T، وrelaxivity T 1 في الجادولينيوم من CLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) هو أعلى ما يقرب من 3 مرات من تلك التي من GD-DOTA 10. التصوير المايسترو يؤكد محددة ملزمة قوية من تكساس وصفت الأحمر CLT1 (CLT1-TR) إلى الورم مع ملزمة قليلا إلى الأعضاء والأنسجة العادية، في حين سارعت وغير محددة الببتيد (sCLT1-TR) يظهر الورم القليل جدا ملزم (الشكل 2). ويبين الشكل 3 نموذجي قبل وبعد الحقن النقيض المحسن (CE) T-1 المرجحة الصور. النتائج الوكيل المستهدفة في تعزيز أكبر وأطول في أنسجة الورم مقارنة مع وكلاء تدافعت غير المستهدفة. تعزيز النقيض في المثانة البولية يزيد تدريجيا على مدىالوقت، مشيرا إلى أن عوامل التباين وتفرز عن طريق الترشيح الكلوي. التحليل الكمي إشارة يكشف أن وكيل استهدفت تعزيز إنتاج إشارة أكثر أهمية في أنسجة الورم من وكيل التحكم (P <0.05) ما يصل إلى 30 دقيقة. تظهر الدراسة biodistribution وكيل لديه الحد الأدنى من الاحتفاظ كلمة المدير العام في الأعضاء والأنسجة الرئيسية 2 بعد أيام من الحقن. وتظهر بيانات الأولية التي لدينا CLT1 استهدفت عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي يمكن أن يتم تسليم تحديدا إلى ورم في جرعة منخفضة نسبيا (ثلث الجرعة السريرية).

ص 2 (ملي -1. ق -1) ص 1 (ملي -1. ق -1) المحتويات كلمة المدير العام (ملمول-GD / ز)
في كلمة المدير العام في جزيء في كلمة المدير العام عجزيء إيه
CLT1 (GD-DOTA) 4 10.1 ± 1.0 40.4 ± 3.0 13.0 ± 3.1 52.0 ± 9.6 1.05 ± 0.10
sCLT1 (GD-DOTA) 4 11.5 ± 1.4 46.0 ± 5.0 12.4 ± 0.3 49.6 ± 1.3 0.97 ± 0.08
GD-DOTA 4 2.9 * 2.9 * 3.2 * 3.2 *

الجدول 1. الخصائص الفيزيائية والكيميائية للعوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي المستهدفة وسارعت في 1.5 T، 37 ° C (* Relaxivities لGD-DOTA في الماء عند 37 درجة مئوية هي من مرجع 10).

الشكل 1
> الشكل 1. تصوير بياني الإجراء التوليف والتجربة بشكل عام. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. الورم ملزمة من CLT1-TR. استهدفت CLT1-TR (A) وغير المستهدفة sCLT1-TR (B) تم حقن في الوريد لathymic الفئران عارية تحمل مثلي-PC3 GFP البروستاتا عند تناول جرعة مقدارها 10 نانومول / الماوس. بعد 2 ساعة، تم جمع الأورام ومختلف الأجهزة و تصوير. الصور مضان الخضراء هي من الخلايا السرطانية-PC3 GFP. الصور مضان الحمراء هي من CLT1-TR (A) وsCLT1-TR (B) تحقيقات. 1. الورم؛ 2. الطحال؛ 3. القلب؛ 4. الكلى؛ 5. الخصية، 6. الكبد؛ 7. الرئة؛ 8. العضلات؛ 9. الدماغ.565fig2highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.

الرقم 3
الرقم 3. المحوري الصور ممثل T1 المرجحة 2D التدرج من مثلي PC-3 ورم البروستاتا الإنسان قبل وبعد الحقن في الوريد من CLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 (A) وsCLT1-ديسيلتر (GD-DOTA) 4 (B) في 0.03 مليمول ش ج / كجم في نو / نو الفئران. ورم المسمى مع دائرة حمراء والمثانة المسمى مع دائرة خضراء. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خطوات حاسمة

اختيار العلامات البيولوجية السليم واستهداف الببتيد الصغيرة

لتطوير وكيل النقيض المستهدفة مع حجم صغير بنجاح، تحتاج إلى النظر فيها نقطتين رئيسيتين. أولا، من المهم لتحديد المؤشرات الحيوية الجزيئية الصحيحة التي هي موجودة بكثرة في الأنسجة المريضة مع وجود القليل من الأنسجة الطبيعية. لدينا مختارة العلامات البيولوجية المرتبطة بالسرطان، بروتينات البلازما متخدر، يفي بهذا الشرط. ثانيا، ينبغي أن يكون وكلاء الجزيئية الصغيرة المستهدفة المحددة تقارب ملزمة عالية لالمؤشرات الحيوية بحيث عوامل التباين كافية يمكن ربط هذه الأهداف، مما أدى إلى تعزيز النقيض بما فيه الكفاية. في هذه الدراسة، اخترنا الببتيد CLT1 ملزم الجلطة التي تظهر قوية محددة ملزمة للبروتينات البلازما متخدر في الورم 11.

على النقيض عامل التجميعي

توليف الببتيد ينطوي ثورidizing مجموعتين ثيول في جزيء الببتيد خطي لتشكيل النهائي دوري CLT1 الببتيد. بينما عادة ما تتم الببتيد cyclisation في حل بتركيز منخفض لتقليل التجميع المحتملة، dimerization وoligomerization، على الراتنج سيكليزيشن يستفيد من هذه الظاهرة الزائفة التخفيف فضلا عن إزالة الكواشف عن طريق الغسيل بسيطة والترشيح 13. في إجراء توليف لدينا، نجد أن سيكليزيشن على الراتنج باستخدام الثاليوم (III) trifluoroacetate يعمل بشكل جيد مع ارتفاع العائد وdimerization قليلا، على الرغم من الثاليوم (III) trifluoroacetate هي سامة جدا ويجب الحرص أثناء التعامل مع ذلك. يستخدم النهج الثاني 20٪ DMSO في الحل في انخفاض تركيز الببتيد. ولكن هناك حاجة إلى المزيد من الخطوات لإزالة DMSO، وlyophilizing الحل الحجم الكبير يستغرق وقتا أطول. باستخدام أي من الطريقتين، لا بد من التأكد من تشكيل السندات ثاني كبريتيد كاملة من داخل الجزيء. عندما كومبليكسينج يجند الببتيد مع الله، لا يمكن للثيول مجانية لحثتجمعات كبيرة لأن المعادن النزرة في المخزن المؤقت تحفيز أكسدة الهواء، مما أدى إلى overoxidation من السيستين لتشكيل البلمرة 14. هذا يقلل بشكل كبير من المحصول عادة ونقاء المنتج النهائي. للتأكد من تشكيل فرقة كاملة ثاني كبريتيد، أولا نحن بحاجة إلى استخدام ظروف أكسدة خفيفة لتجنب تشكيل الجزيئات ثاني كبريتيد السندات مما أدى إلى تشكيل ديمر أو قليل وحدات أعلى. ثانيا، ينبغي الحفاظ طويلة بما فيه الكفاية وقت رد الفعل للتأكد من أن جميع الفئات ثيول تتأكسد قبل الخطوة اقتران كلمة المدير العام.

نموذج الحيوان والقسطرة من الوريد ذيل الفأر

إعداد نموذج الورم الحيوان والذيل الوريد القسطرة هي أيضا جوانب هامة جدا من هذا الإجراء. أثناء الجراحة، ويجب أن تبقى أدوات / مقاعد البدلاء نظيفة ومعقمة لتجنب العدوى المحتملة التي يمكن أن تجرح أو تقتل الفئران. من أجل تجنب تحريك الماوس قبل وبعد injecنشوئها، فمن الضروري أن يقني؛ يدخل القنية الماوس الذيل الوريد. لإعداد القسطرة عن القسطرة، وكسر إبرة قياس 30 من محور وإدراج نهاية حادة إلى 1.0 متر أنابيب طويلة، وربط آخر من نهاية الأنبوب إلى حقنة محملة 1٪ heparinized المالحة. دفع حقنة لملء الأنابيب. تمدد الذيل بالماء الدافئ (~ 105 ° F). ادخال الإبرة في الوريد. ارتجاعي الدم في أنابيب يشير الإدراج الناجح لقسطرة. للتحقق من أن الإبرة في الوريد، ودفع بلطف حقنة والمالحة يمكن حقنها على نحو سلس، يتم مسح الوريد مع حقن كمية صغيرة من المياه المالحة. إصلاح القسطرة في مكان مع الشريط قبل تحريك الماوس إلى الماسح الضوئي.

القيود والتعديلات الممكنة

وهناك العديد من القيود في الدراسة الحالية لدينا. أولا، من النتائج الأولية نلاحظ أن CLT1 يغسل بسرعة جدا من موقع الاستهداف على الرغم من أنه ركلات الترجيحالدودة الحلزونية ممتازة ملزمة للورم. المحتمل يسبب تدهور بروتين في الجسم الحي عدم استقرار CLT1. تعديل CLT1 للحماية ضد تدهور بروتين ينبغي تحسين استقرارها وإطالة وقت غسل الخروج في الجسم الحي. باستخدام D-نوع الأحماض الأمينية ليحل محل L-نوع من الأحماض الأمينية الطبيعية هي استراتيجية محتملة لتحقيق هذا الهدف. الثانية، لا يوضح الدراسة الحالية التي مكونات بالضبط في بروتينات البلازما متخدر الببتيد CLT1 بربط. أخيرا، ونحن تجميع عوامل التباين أساسا باستخدام توليف المرحلة الصلبة مع منخفضة نسبيا العائد والتكلفة العالية. وينبغي تطوير مرحلة طريقة تركيب السائل زيادة المحصول وخفض التكاليف.

تطبيقات

نحن نعمل على تطوير تقنيات لكشف دقيق من الأورام الخبيثة صغيرة مع تباين تعزيز التصوير بالرنين المغناطيسي. التصوير بالرنين المغناطيسي مع وكيل استهدفت توفر بديلا أكثر فعالية وأكثر أمانا لسرطان التصوير الجزيئي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويدعم هذا العمل في جزء من GRA الربيع 09 زمالة ما بعد الدكتوراه جمعية القلب الأمريكية (09POST2250268) والمعاهد الوطنية للصحة R01 CA097465. نحن نقدر تقديرا عاليا الدكتور ون لى والدكتور فيكاس Gulani لاختبار بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي والإعداد، والسيدة ايفون باركر لمساعدتها على زرع الورم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Fmoc protected amino acids EMD Chemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu) TCI America
PyBOP, HOBt, HBTU Nova Biochem
DIPEA, Thallium(III) trifluoroacetate, TIS Sigma-Aldrich Corp.
Texas Red, succinimidyl ester, single isomer Invitrogen T20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 HPLC system Agilent
ZORBAX 300SB-C18 PrepHT column Agilent
ICP-–S Optima 3100XL Perkin-Elmer
MALDI-TOF mass spectrometer Bruker AutoflexTM Speed
Maestro FLEX In Vivo Imaging System Cambridge Research Instrumentation, Inc.
Biospec 7T MRI scanner Bruker

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
  2. Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
  3. Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
  4. Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
  5. Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
  6. Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
  7. Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
  9. Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
  10. Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
  11. Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
  12. Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
  13. McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3, (3), 193-198 (1996).
  14. Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335, (1), 168-170 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics