सीधे लेबल जांच का प्रयोग मजबूत 3 डी डीएनए मछली

1Nuclear Dynamics Programme, The Babraham Institute, 2Epigenetics Programme, The Babraham Institute, 3Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge
Biology
 

Summary

हम सीधे लेबल फ्लोरोसेंट जांच का प्रयोग करके 3D डीएनए मछली द्वारा परमाणु वास्तुकला का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और बहुमुखी प्रोटोकॉल का वर्णन है.

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Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes. J. Vis. Exp. (78), e50587, doi:10.3791/50587 (2013).

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Abstract

3 डी डीएनए मछली नाभिक के तीन आयामी संगठन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रमुख साधन बन गया है, और तकनीक के कई रूपों प्रकाशित किया गया है. इस लेख में हम मजबूती, reproducibility, और उपयोग में आसानी के लिए अनुकूलित किया गया है जो एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. चमकते फ्लोरोसेंट सीधे लेबल जांच डाई के रासायनिक युग्मन द्वारा पीछा एमिनो allyldUTP साथ निक अनुवाद द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. 3 डी डीएनए मछली सेल permeabilization के लिए एक फ्रीज पिघलना कदम और जांच और परमाणु डीएनए के एक साथ विकृतीकरण के लिए एक हीटिंग कदम का उपयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक सीमा है और जांच की एक किस्म (BACS, प्लास्मिड, fosmids, या पूरे क्रोमोजोम पेंट्स) पर लागू होता है और उच्च throughput स्वचालित इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. इस विधि के साथ हम नियमित तौर पर तीन गुणसूत्र क्षेत्रों तक का परमाणु स्थानीयकरण की जांच.

Introduction

स्वस्थानी संकरण में डीएनए प्रतिदीप्ति (डीएनए मछली) सेल चक्र के सभी चरणों के दौरान व्यक्तिगत जीन लोकी, subchromosomal डोमेन और यहां तक कि पूरे गुणसूत्रों के तीन आयामी दृश्य की अनुमति देता है. 3 डी मछली को बड़े पैमाने पर अंतरावस्था दौरान जीनोम और अपने कार्य के स्थानिक संगठन (उसमें 1,2 और संदर्भ) के बीच संबंध की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि 2 डी मछली मेटाफ़ेज़ अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. ऐतिहासिक, सह संघ अध्ययन मछली द्वारा व्यक्तिगत loci के सैकड़ों के दसियों की जांच से प्रदर्शन किया गया. ऐसे 4C और हाय सी के रूप में अभी हाल ही में शक्तिशाली उच्च throughput -3 सी तकनीक आधारित विभिन्न स्थलों के कई हजारों के बीच आणविक पार से बात की जांच की अनुमति, 3 विकसित किया गया है. 3C आधारित तकनीक और डीएनए मछली पूरक तरीकों से किया जा सकता है, वे आवश्यक रूप से एक ही सवाल का जवाब नहीं है. 3C आधारित विधियों एक probabil में जिसके परिणामस्वरूप, मिश्रित सेल आबादी का एक जोड़ा readout प्रदानसह संघों के लिए अल्पसंख्यक. इसके विपरीत, throughput में कम है, जबकि मछली आधारित तकनीक उनके विकासात्मक या सेल चक्र के चरणों के अनुसार व्यक्ति की कोशिकाओं में लोकी या गुणसूत्रों की स्थानिक व्यवस्था का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करते हैं. इसलिए, मछली परमाणु संरचना समारोह रिश्तों की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होना जारी रहेगा.

सफल 3 डी मछली प्रयोगों प्रदर्शन में दो प्रमुख वजहें भी होती हैं. ये हैं, 1. बेहतर लेबल जांच और 2 प्राप्त करने के. निर्धारण, पूर्व और बाद के संकरण कदम, जांच संकरण के लिए पर्याप्त रूप से सुलभ डीएनए बनाने के दौरान जितना संभव परमाणु आकारिकी की रक्षा करने सहित सेलुलर उपचार के विकल्प. कुशल जांच लेबलिंग मछली के लिए महत्वपूर्ण है. परंपरागत रूप से, निक अनुवाद hapten या फ्लोरोफोरे संयुग्मित न्यूक्लियोटाइड 4 या तो लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी प्रकार, वाणिज्यिक निक अनुवाद किट प्रत्यक्ष hapten या फ्लोरोफोरे समावेश, बू के लिए उपलब्ध हैंटी भी दो कदम लेबलिंग के लिए aminoallyl nucleotides और अमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक का उपयोग कर. बाद के डीएनए पोलीमरेज़ के साथ काम करने के लिए एक कम भारी अणु देकर अधिक कुशल डाई समावेश renders. अभी हाल ही में डीएनए की गैर enzymatic लेबलिंग के लिए किट न्यूक्लिक एसिड को प्लैटिनम की coordinative बंधन जो शोषण विकसित किया गया है. मछली जांच भी पहले से ही 5 लेबल खरीदा जा सकता है. किट और वाणिज्यिक निर्मित जांच में कोई संदेह नहीं उपयोग में आसानी देते हैं, वे काफी घर में जांच के व्यक्तिगत घटकों खरीद और उत्पादन की तुलना में अधिक महंगे हैं. हम सीधे कई रंगों में कई अलग अलग बीएसी जांच लेबल करने के क्रम में एक कम लागत निक अनुवाद प्रोटोकॉल अनुकूलित. हम अत्यधिक शुद्ध बीएसी डीएनए प्राप्त करने के 10 की तुलना में, मछली स्लाइड प्रति जांच के केवल 10-20 एनजी के लिए एक आवश्यकता में महत्वपूर्ण और परिणाम है कि पता चला - 20 गुना अधिक अशुद्ध टेम्पलेट डीएनए इस्तेमाल किया जाता है, जब प्रमुख में जिसके परिणामस्वरूप लागत और समय बचत. एमिनो allyldUTP के उपयोग का लचीला लेबलिंग की अनुमति देता हैउपलब्ध अमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक (जैसे एलेक्सा Fluor या Cy-रंजक) या haptens (जैसे बायोटिन, digoxigenin) के साथ जांच. Hapten लेबल जांच संकेत बढ़ाना और कल्पना करने की fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी या streptavidin के द्वारा पता चला रहे हैं. ब्राइट सीधे लेबल जांच आम तौर पर कम पृष्ठभूमि धुंधला दिखाने के लिए और इसलिए परमाणु स्थानीयकरण और ठिकाना आकारिकी की एक अधिक सही प्रतिनिधित्व है, जिसके परिणामस्वरूप संकेतों के अत्यधिक प्रवर्धन से बचें.

NaOH के विकृतीकरण, एचसीएल विकृतीकरण साथ formaldehyde के निर्धारण के साथ glutaraldehyde निर्धारण, और गर्मी विकृतीकरण साथ formaldehyde के निर्धारण 6-9: अलग fixatives, पूर्व उपचार, और बाद संकरण धोने का उपयोग करें, लेकिन इन आम तौर पर निम्नलिखित श्रेणियों में आते हैं कि कई अलग मछली तकनीकों हैं . इनमें से प्रत्येक के फायदे और नुकसान है. Glutaraldehyde निर्धारण अच्छा परमाणु संरचनात्मक संरक्षण में परिणाम है, लेकिन कम से कम करने के लिए एजेंटों को कम करने के साथ उपचार की आवश्यकतापरिणामस्वरूप autofluorescence, और NaOH के इलाज ध्यान से पर्याप्त डीएनए विकृतीकरण और परमाणु संरचना 6 से संभावित नुकसान को संतुलित करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए. Formaldehyde निर्धारण परमाणु वास्तुकला के perturbations की एक वृद्धि की संभावना दे रही है, कम मजबूत है, लेकिन यह भी आम तौर पर मजबूत और अधिक विश्वसनीय संकेत और 9 autofluorescence कम दे रही है. एचसीएल उपचार जांच के लिए डीएनए के लिए अच्छी पहुँच उपलब्ध कराने, प्रोटीन बाहर डीएनए और स्ट्रिप्स depurinates, लेकिन यह भी डीएनए टूट शुरू हो सकता है. ताप शारीरिक रूप से अच्छा लक्ष्य संकरण और मजबूत संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप दो किस्में डीएनए को अलग करती है लेकिन परमाणु संरचना 8 की कुछ गड़बड़ी पैदा कर सकता है. जो इन तकनीकों में से प्रत्येक प्रोटीन एपिटोप्स को प्रभावित करने के लिए डिग्री प्रयोगात्मक प्रत्येक प्रोटीन इम्युनो मछली प्रयोगों में उपयोग करने के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है, जिसके परिणामस्वरूप व्यापक रूप 6,9 बदलता रहता है.

कोई 'सही' डीएनए मछली ते जबकि वहाँअच्छी तरह से नियंत्रित अगर chnique, वे सभी उपयोगी हो सकता है. हमारा लक्ष्य सबसे अधिक विश्वसनीय संकेत के लिए हीटिंग विधि पर ध्यान केंद्रित, सेल प्रकार 10 की एक किस्म में कई स्थलों के स्थानिक स्थिति की जांच के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डीएनए मछली के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन के लिए था. यह और एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली के उपयोग के साथ हम परमाणु व्यवस्था की एकल कोशिका विश्लेषण के लिए throughput बढ़ाने के उद्देश्य से.

Protocol

1. निक अनुवाद द्वारा सीधे लेबल डीएनए जांच जनरेटिंग

नोट: BACS बनाया से सीधे लेबल जांच (100-250 केबी) लगातार उज्ज्वल संकेतों का उत्पादन. छोटे जांच की आवश्यकता है, 5-10 केबी आवेषण युक्त fosmids (40-50 केबी) या भी प्लास्मिड का उपयोग करें. बीएसी या पहनावा या UCSC जीनोम ब्राउज़र का उपयोग कर विशिष्ट जीन को इसी fosmid क्लोन पहचानें. दोहराया तेज़ी से उच्च गुणवत्ता बीएसी डीएनए तैयार करें या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें. कम तैयारी बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के साथ दूषित है, कम जांच स्लाइड प्रति आवश्यक है. दो चरणों में लेबलिंग का पालन: निक अनुवाद aminoallyl-dUTP और एक अमाइन प्रतिक्रियाशील डाई के रासायनिक युग्मन शुरू.

1.1. निक अनुवाद

निक अनुवाद के दौरान, DNase मैं एकल भूग्रस्त टूटता बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. डीएनए पोलीमरेज़ मैं नए लोगों, टी के साथ मौजूदा न्यूक्लियोटाइड जगह, खरोंच 'इनमें से समाप्त होता है' 3 elongates इसके द्वारा 'का अनुवाद' निक और इस प्रकार लेबल nucleotides शामिल करने के लिए अवसर प्रदान करते हैं. Aminoallyl-dUTP डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा क्योंकि कुशल समावेश का चुना जाता है मैं और amine प्रतिक्रियाशील रंजक या haptens करने के बाद रासायनिक युग्मन के लिए अपनी क्षमता. यह DNase मैं Nicking और डीएनए पोलीमरेज़ मैं अनुवाद के बीच सही संतुलन हासिल करने के लिए महत्वपूर्ण है, बहुत ज्यादा DNase मैं, बहुत कम अनुवाद आरंभ करने के लिए पोलीमर्स के लिए पर्याप्त nicks के उत्पादन नहीं होगा, कम उपज और छोटा टुकड़ा आकार देने अत्यधिक डीएनए पाचन में परिणाम होगा बड़ा टुकड़ा आकार और aminoallyl-dUTP के गरीब समावेश दे रही है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन यह अलग बैचों या विभिन्न निर्माताओं से DNase मैं टाइट्रेट करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

  1. 16 से कम 2 घंटे के लिए बर्फ और सेते पर प्रतिक्रिया लेबलिंग डिग्री सेल्सियस सेट करें इस 0.5-1 ग्राम निक अनुवाद डीएनए का उत्पादन करना चाहिए और बढ़ाया जा सकता है. DNase मैं बफर में DNase मैं 1:30 (यानी 0.3 यू / μl) पतला.
1 "> घटक स्टॉक की एकाग्रता मात्रा या राशि बीएसी डीएनए 5-10 ग्राम एनटीबी बफर 10x 5 μl डीटीटी 0.1 एम 5 μl dNTP मिश्रण 10x 5 μl Aminoallyl-dUTP 0.5 मिमी 6 μl डीएनए पोलीमरेज़ मैं 10 यू / μl 1 μl DNase मैं 10 यू / μl 1 μl (एक 1:30 कमजोर पड़ने से) एच 2 हे 50 μl के लिए
  1. लेबल टुकड़ों के आकार की जाँच करने के लिए एक 2% agarose जेल पर 1 μl चलाएँ. आप जेल चलाने के लिए, बर्फ पर प्रतिक्रिया रखना. सफल निक translatiपर ~ 1 केबी (: प्रतिनिधि परिणाम देखना महत्वपूर्ण कदम) में कुछ बड़े टुकड़े के साथ 150 बीपी और 700 बीपी के बीच चल टुकड़े के थोक के साथ एक धब्बा में परिणाम होगा. यदि आवश्यक हो, 15-30 मिनट के लिए 16 पर एक ताजा 01:30 DNase मैं कमजोर पड़ने और सेते की एक और 1 μl डिग्री सेल्सियस जोड़ें. ऊष्मायन समय बीएसी डीएनए की मात्रा और गुणवत्ता के हिसाब से अलग अलग होंगे.
  2. 10 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस 75 से हीटिंग द्वारा DNase मैं निष्क्रिय.
  3. एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर साफ हुआ अमाइन संशोधित डीएनए. 100 μl एच 2 ओ में Elute
  4. 10 μl 3 एम NaOAc (5.2 पीएच) और 275 μl इथेनॉल जोड़कर इथेनॉल वेग डीएनए. कम से कम 1 घंटे या रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें. 4 में 30 मिनट के लिए अधिकतम गति से स्पिन डिग्री सेल्सियस 500 μl 70% इथेनॉल के साथ गोली धो लें और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं. यह कदम लेबलिंग प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप करेगा जो ट्रेस amines निकालता है. 1x प्रारंभिक प्रतिक्रिया प्रति 6 μl एच 2 ओ में resuspend गोली.
  5. अमाइन संशोधित डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए 1 μl का प्रयोग करेंmicrovolume यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा.

1.2. फ्लोरोसेंट डाई के युग्मन

जांच के फ्लोरोसेंट लेबलिंग डाई के रासायनिक युग्मन द्वारा प्राप्त किया है. एलेक्सा Fluor succinimidyl एस्टर रंगों जिससे सीधे लेबल जांच के उत्पादन, एक सहसंयोजक बांड फार्म एमिनो allyldUTP संशोधित डीएनए की amines के साथ प्रतिक्रिया. एलेक्सा Fluor 488, 555, और 647 रंगों के इस प्रक्रिया के लिए सफल रहे हैं.

  1. 5 μl की एक मात्रा को एमिनो एलिल संशोधित डीएनए की 4 ग्राम समायोजित, 95 को गर्मी डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए, बर्फ पर शांत तस्वीर, और 0.2 एम 3 NaHCO के 3 μl जोड़ें.
  2. कमरे के तापमान पर 2 μl निर्जल DMSO में अमाइन प्रतिक्रियाशील डाई की एक विभाज्य भंग. 3 NaHCO, भंवर, 1 घंटे के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर पल्स स्पिन और सेते साथ 8 μl संशोधित डीएनए जोड़ें.

नोट: अमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक निम्नलिखित योजना के आधार पर एक से अधिक जांच लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ओ के बाद सेजांच के nly 10-20 एनजी स्लाइड लेबलिंग के अनुसार किया जाता है, 1 ग्राम 50-100 स्लाइड्स के लिए पर्याप्त जांच देता है. यह -20 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य लेबलिंग प्रतिक्रियाओं के लिए अमाइन संशोधित डीएनए स्टोर करने के लिए भी संभव है

डीएनए राशि डीएनए की मात्रा 0.2 एम 3 NaHCO डाई की मात्रा संपूर्ण पर्याप्त के लिए
4 एक्स 1 ग्राम 1.25 μl प्रत्येक 0.75 μl प्रत्येक 0.5 μl प्रत्येक 2.5 μl (1/4) 50-100 स्लाइड्स के प्रत्येक
3 एक्स 1.35 माइक्रोग्राम 1.67 μl प्रत्येक 1 μl प्रत्येक 0.67 μl प्रत्येक 3.34 μl (1/3) 65-130 स्लाइड प्रत्येक
2 एक्स 2 ग्राम 2.5 μl प्रत्येक 1.5 μl प्रत्येक 1 μl प्रत्येक 5 μl (1/2) 100-200प्रत्येक स्लाइड
1 एक्स 4 ग्राम 5 μl 3 μl 2 μl 10 μl (पूर्ण) 200-400 स्लाइड
  1. 90 μl एच 2 हे और एक पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग कर शुद्ध लेबल जांच जोड़ें. 100 μl 10 mMTris-सीएल (8.5 पीएच) में Elute.
  2. बीयर लैम्बर्ट समीकरण (निर्देश एलेक्सा Fluor प्रतिक्रियाशील रंजक के साथ या ऑनलाइन पाया जा सकता है डेटा पत्रक में दिया जाता है) का उपयोग microvolume पूर्ण स्पेक्ट्रम स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्र 2 देखें) से जांच एकाग्रता और लेबलिंग दक्षता का निर्धारण करते हैं. 100 बीपी प्रति 3-6 रंजक युक्त जांच अच्छी तरह से काम करते हैं. निगमन के कम डिग्री के साथ जांच कमजोर मछली संकेत दे सकता है. वैकल्पिक रूप से, डीएनए के बिना एक 2% agarose जेल पर 5 μl चलाने के दाग और एक phosphoimager उपयोग कर फ्लोरोसेंट डाई के समावेश की जाँच करें. Ethidium ब्रोमाइड या डीएनए धुंधला के विकल्प के साथ जेल के बाद दाग और कुल डीएनए के लिए लेबल डीएनए की तुलना करें.

निम्न चरणों के माध्यम से, ब्याज की कोशिकाओं स्लाइड करने और तय permeabilized रहे हैं. सेलुलर डीएनए और सीधे लेबल जांच तो एक गर्म थाली पर एक साथ विकृत और एक हलका सा humidified कक्ष में रात भर संकरित हैं.

2.1. दिन 1

  1. जांच वर्षा
    नोट: दिन 1 के दौरान कुछ बिंदु पर वेग जांच. यह आराम से कोशिकाओं का इलाज करने के लिए समानांतर में किया जा सकता है और दिन की शुरुआत में किया जाना जरूरी नहीं है.
    1. 10-20 एनजी सीधे लेबल जांच, 6 μl सी 0 टी -1 डीएनए (6 ग्राम), सामन वृषण से 1 μl एकल असहाय डीएनए (9.7 ग्राम) मिलाएं और पानी के साथ 100 μl के लिए मात्रा समायोजित करें.
    2. Vortexing द्वारा 10 μl 3 एम NaOAc और 275 μl EtOH, और मिश्रण जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए वेग
    3. 4 में 30 मिनट के लिए अधिकतम गति पर microfuge में स्पिन डिग्री सेल्सियस 70% EtOH के साथ गोली धो लें और फिर से स्पिन. सूखी गोलीऔर 5 μl विआयनीकृत formamide में resuspend. प्रकाश से सुरक्षित 1000 आरपीएम (thermomixer पर जगह पन्नी) को मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए Resuspend.
    4. 37 में dextran सल्फेट मिश्रण के 5 μl जोड़ें और एक और 10 मिनट के लिए हिला डिग्री सेल्सियस फिर से प्रकाश से रक्षा की. बस coverslip पर pipetting से पहले और नीचे पिपेट.
      नोट: बीएसी जांच, एक सुविधाजनक विकल्प तैयार करने के लिए उपयोग संकरण मिश्रण में आपूर्ति की जाती है जो पूरे गुणसूत्र चित्रकला जांच के साथ संयुक्त गुणसूत्र चित्रकला के लिए. Resuspend बीएसी जांच उपजी (सी 0 के साथ सामन वृषण से t1 डीएनए और एकल असहाय डीएनए) ऊपर pipetting और नीचे से 10 μl गुणसूत्र रंग मिश्रण में. 10 मिनट के लिए 300-500 rpm पर मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. गुणसूत्र रंग / हाजिर प्रति बीएसी जांच मिश्रण के 10 μl का प्रयोग करें.
  2. स्लाइड्स के लिए सेल संलग्न
    नोट: स्लाइड का पालन करने के लिए कोशिकाओं प्रवृत्ति बहुत सेल प्रकार के साथ बदलता रहता है. प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए निर्धारितइष्टतम अनुभव से समय और सेल घनत्व निपटाने. संगत परिणामों के लिए, कोशिकाओं को एक एकल कक्ष निलंबन में होना चाहिए.
    पीबीएस में resuspended कोशिकाओं के लिए यह सख्ती जरूरी नहीं है, हालांकि उपयोग चक्र की आसानी के लिए कोशिकाओं को क्षेत्र, एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ पर देखा जाएगा. एक हाइड्रोफोबिक बाधा, स्लाइड पर फैलने से निलंबन रोकता स्लाइड अच्छी तरह से अलग प्रति तीन नमूने लिए ऊपर रहता है और इम्युनो मछली में एंटीबॉडी समाधान की बहुत छोटी मात्रा के उपयोग के लिए अनुमति देता है. सेल संख्या कम कर रहे हैं, तो भी खोलना क्षेत्र एक न्यूनतम करने के लिए रखा जा सकता है.
  3. माउस भ्रूण जिगर की कोशिकाओं
    1. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा पीबीएस और resuspend के लगभग 1.5 मिलीलीटर में प्रत्येक E13.5 माउस भ्रूण जिगर लीजिए. 2 मिनट के लिए 3000 rpm पर microfuge में स्पिन. दोहराएँ तीन बार washes. एक 70 माइक्रोन चलनी के माध्यम से पिछले धोने, तनाव कोशिकाओं पर. 160 μl पीबीएस में एक जिगर से कोशिकाओं Resuspend और मौके प्रति 50 μ का उपयोग करें. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें.
  4. एमouse ते प्रकोष्ठों
    1. माउस ES कोशिकाओं स्लाइड को आसानी से नहीं रहना होगा. एक स्लाइड पर, वृत्त क्षेत्र कोशिकाओं एक हाइड्रोफोबिक कलम के साथ पर देखा जाएगा. सर्कल में सामान्य मध्यम संस्कृति, पिपेट में 80-100 μl प्रति 20,000-50,000 कोशिकाओं के निलंबन की तैयारी और एक humidified इनक्यूबेटर नोट में लगभग 3 घंटे के लिए संलग्न करने के लिए छोड़ दें. वैकल्पिक रूप से, ES कोशिकाओं स्लाइड पर संवर्धित किया जा सकता है, लेकिन तब बनेगी स्वचालित इमेजिंग और लचीलापन है जो कालोनियों.
  5. फिक्स्ड कोशिकाओं
    1. कुछ प्रयोगों स्वयं द्वारा स्लाइड को संलग्न नहीं है जो निश्चित कोशिकाओं के उपयोग की आवश्यकता होती है. एक cytocentrifuge का उपयोग कर 3 मिनट के लिए 300 rpm पर कोमल कताई कोशिकाओं के तीन आयामी संरचना को बरकरार रखता है और कोशिकाओं से गिर नहीं है कि यह सुनिश्चित करता है.
सेल प्रकार में निलंबन समय निपटाने टिप्पणी
माउसभ्रूण जिगर पीबीएस 2 मिनट बेंच पर
माउस ते पूरक आहार के साथ DMEM 4 घंटा Humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस
माउस लिम्फोसाइटों पीबीएस 2 मिनट बेंच पर
माउस P20 जर्म कोशिकाओं समाधान में फिक्स Cytospin बेंच पर
  1. 10 मिनट के लिए: कक्षों, 4% पीएफए ​​में धीरे डूब स्लाइड (धूआं हुड में प्रदर्शन सतर्कता) को ठीक करने के लिए. . कोशिकाओं का सबसे अच्छा प्रतिधारण (एक टिप बॉक्स के ढक्कन में जैसे 50 मिलीलीटर 4% पीएफए) के लिए एक ट्रे में फ्लैट स्लाइड नोट के साथ कोशिकाओं को ठीक करें: यह कदम स्लाइड्स के लगाव से पहले तय की कोशिकाओं पर लागू नहीं होता.

बाद के सभी चरणों के लिए 50 मिलीग्राम या 100 मिलीलीटर Coplin जार का उपयोग करें. जार के बीच स्लाइड जब चलती कोशिकाओं परिमार्जन नहीं ख्याल रखना.

  1. 0.1 एम Tris सी में बुझानाएल, आरटी पर 10 मिनट के लिए 7.4 पीएच.
  2. 0.1% में कोशिकाओं Permeabilize saponin/0.1% ट्राइटन आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में एक्स 100.
  3. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार धोएं.
  4. . 20% ग्लिसरॉल / आरटी पर पीबीएस नोट में कम से कम 20 मिनट के लिए सेते: इस बिंदु पर, स्लाइड्स कम से कम कई हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 50% ग्लिसरॉल / पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है. यह संकेत ताकत 9 में वृद्धि में कम से कम एक दिन के परिणाम के लिए कि भंडारण देखा गया है. . नोट आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान 20% ग्लिसरॉल / पीबीएस में recalibrate: इस जांच (2.1.1 देखें) precipitating शुरू करने के लिए एक सुविधाजनक स्थान है.
  5. 3x फ्रीज / तरल नाइट्रोजन में विगलन. एक छोटे देवर का उपयोग कर तरल नाइट्रोजन में एक समय में डूब गयी स्लाइड. कुछ सेकंड और एक विशेषता पॉपिंग ध्वनि के बाद वापस ले लें, और defrost करने के लिए कागज तौलिया पर जगह. फिर फ्रीज तो गायब करने अपारदर्शी जमे हुए ग्लिसरॉल के लिए प्रतीक्षा करें. ऊपर से 15 स्लाइड्स तीन फ्रीज / पिघलना चक्र के लिए रोटेशन में आराम से किया जा सकता है.
  6. डब्ल्यूआरटी पर 5 मिनट के लिए दो बार पीबीएस में राख.
  7. आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.1 एम एचसीएल में सेते हैं.
  8. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में धो लें.
  9. आरटी पर 30 मिनट के लिए 0.5% saponin/0.5% ट्राइटन X-100/PBS में Permeabilize.
  10. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में दो बार धोएं.
  11. आरटी पर कम से कम 10 मिनट के लिए 50% formamide/2x एसएससी में संतुलित.
  12. एक coverslip पर पिपेट जांच. जार से स्लाइड निकालें और एक कागज तौलिया के साथ सेल स्थान (एस) के आसपास किसी भी अतिरिक्त तरल बंद सूखी. Formamide जल्दी dries के रूप में, कोशिकाओं के बाहर सूखी नहीं ख्याल रखना. दो या तीन सेल धब्बों के साथ स्लाइड्स के लिए, स्लाइड पर स्थान हाजिर करने के लिए एक्स 50 मिमी coverslip इसी एक 22 मिमी पर हाजिर प्रति जांच के 10 μl लागू होते हैं. स्थान (एस) से अधिक स्लाइड पर coverslip उलटें. रबर सीमेंट के साथ सील और यह पूरी तरह से सूखे की अनुमति. बाद के सभी चरणों में प्रकाश से सुरक्षित रखें.
  13. 78 को गर्मी स्लाइड डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर ठीक 2 मिनट (एक औंधा हीटिंग ब्लॉक, महत्वपूर्ण कदम उदा: चर्चा देखें) के लिए. एक कवर (गत्ते का डिब्बा या सिम रखें गर्म थाली पर ilar) विकृतीकरण दौरान प्रकाश से बचाने के लिए.
  14. एक हलका सा humidified कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. , गीला एक हलका सा बॉक्स में कागज तौलिए जगह और पानी से गीला हो जाना.

2.2 दिवस 2

  1. बाद में धोने कदम के लिए सही तापमान पर समाधान के साथ Coplin जार तैयार. बाद के सभी चरणों के दौरान जितना संभव प्रकाश से स्लाइड्स को सुरक्षित रखें. एक कॉफी Coplin जार के लिए एक अच्छा प्रकाश तंग कवर करता है सकते हैं.
  2. रबर सीमेंट और 2x एसएससी में जगह स्लाइड छीलकर coverslips ढीला और बंद स्लाइड जब तक.
  3. 45 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 50% formamide/2x एसएससी में धो लें Waterbath पर प्लेस ढक्कन प्रकाश से बचाने के लिए.
  4. 63 पर 15 मिनट के लिए 0.2x एसएससी में धो डिग्री सेल्सियस
  5. 45 डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट के लिए 2x एसएससी में धो लें
  6. आरटी पर 5 मिनट के लिए 2x एसएससी में धो लें.
  7. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में धो लें.
  8. आरटी पर एक Coplin जार में 2 मिनट के लिए DAPI (5 ग्राम / 2x एसएससी में एमएल) के साथ दाग.
सामग्री "> नोट: DAPI के समाधान 4 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री 2 महीने के लिए अंधेरे में सी.

  1. आरटी पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में Destain.
  2. Coverslip के माउंट करने के लिए, पिपेट एक coverslip पर मध्यम बढ़ते. एक जगह है, और 22 मिमी 2-3 स्थानों के लिए x 50 मिमी coverslips के लिए 22 मिमी x 22 मिमी coverslips का उपयोग कर, सेल मौके प्रति 10 μl का प्रयोग करें. सेल स्थान के रूप में ज्यादा के रूप में संभव के आसपास पीबीएस सूखे से लेकिन कोशिकाओं को बाहर सूखी नहीं ख्याल रखना. स्लाइड पर coverslip, और नेल वार्निश के साथ सील पलटना.

Representative Results

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित (अवलोकन के लिए चित्रा 1) जीनोमिक संगठन के विश्लेषण के लिए उच्च throughput छवि पर कब्जा करने के साथ डीएनए मछली गठबंधन करने के लिए महान प्रभाव के लिए इस्तेमाल किया गया है. अच्छी गुणवत्ता की जांच की पीढ़ी (चर्चा देखें) सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. चित्रा 2 मछली जांच के लिए दो महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण दर्शाता है. निक अनुवाद के बाद, डीएनए का एक धब्बा 150 के बीच और 700 बीपी (2A चित्रा) चल टुकड़े के थोक के साथ दिखाई जानी चाहिए. रासायनिक युग्मन के बाद, फ्लोरोसेंट डाई का समावेश जांच के स्पेक्ट्रोस्कोपी विश्लेषण (चित्रा 2 बी) से लगाया जा सकता है.

अच्छा जांच का उपयोग करते हैं, डीएनए मछली प्रोटोकॉल के बाद आमतौर पर कम पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल डीएनए मछली संकेतों में परिणाम है. हम सफलतापूर्वक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की एक किस्म पर इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया, और महामारी प्रतिदीप्ति या confocal सूक्ष्मदर्शी किसी के साथ किया है. एक महामारी fluorescenc का उपयोग कर स्वचालित इमेजिंगconfocal माइक्रोस्कोपी अधिक तीव्र संकेतों की आवश्यकता है, जबकि ई माइक्रोस्कोप, छोटी सी पृष्ठभूमि (चित्रा 3) के साथ तेजी से, आसानी से पहचाना मछली संकेतों की आवश्यकता है. चित्रा -4 ए प्रतिनिधि संसाधित छवियों से पता चलता है. मछली संकेतों के परमाणु निर्देशांक प्राप्त किया जा सकता है, और जीनोमिक क्षेत्रों के स्थानिक संबंध (एक उदाहरण के लिए 4B चित्रा देखें) गणना की जा सकती है. हम भी उनके गुणसूत्र क्षेत्रों के भीतर मछली संकेतों के 3 डी मॉडलिंग (1 मूवी) के लिए confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की छवि के ढेर का इस्तेमाल किया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. जांच लेबलिंग और डीएनए मछली के लिए कार्यप्रवाह. जांच तैयारी नीले रंग में दिखाया गया है. डीएनए मछली प्रक्रिया हरे रंग में दिए गए विवरण के साथ काले रंग में दिखाया गया है.


चित्रा 2. निक अनुवाद और लेबल जांच की गुणवत्ता नियंत्रण से जांच लेबल. डीएनए सीढ़ी, लेन 2 और 3: निक अनुवाद के बाद BACS) ए) जेल DNase मैं (1 लेन निष्क्रिय हीटिंग से पहले आदर्श धब्बा दिखा. टुकड़े 150-700 बीपी सीमा में होना चाहिए. ~ 1 केबी पर एक अतिरिक्त धब्बा अक्सर सफल निक अनुवाद प्रतिक्रियाओं के साथ मनाया जाता है. लेबल जांच बी) Microvolume पूर्ण स्पेक्ट्रम विश्लेषण. एलेक्सा Fluor 488: 495 एनएम, एलेक्सा Fluor 555: 555 एनएम, एलेक्सा Fluor 647: 650 एनएम 260 एनएम पर एक डीएनए शिखर जांच के साथ लेबल है फ्लोरोफोरे के absorbance तरंगदैर्ध्य को इसी एक दूसरी चोटी के साथ मनाया जाता है. दिखाया अच्छा समावेश के साथ तीन जांच कर रहे हैं: फ्लोरोफोरे absorbance के चोटियों एक समान ऊंचाई या डीएनए चोटियों की तुलना में अधिक हैं. एलेक्सा Fluor 647 आम तौर पर उच्च absorbance हैबदले में एलेक्सा Fluor 488 से अधिक absorbance के है जो एलेक्सा Fluor 555, से. एलेक्सा Fluor 488 भी इसलिए इस जांच के लिए पहली बार चोटी के अन्य लोगों की तुलना में अधिक है, 260 एनएम पर कुछ प्रकाश अवशोषित. गरीब समावेश शो फ्लोरोफोरे absorbance के साथ जांच के लिए डीएनए absorbance के मुकाबले कम 2-3-गुना. डीएनए शिखर की तुलना में 2 गुना अधिक फ्लोरोफोरे शिखर की तुलना में एक अधिक से जांच आम तौर पर मछली में पृष्ठभूमि के कारण हो सकता है कि विसंयुग्मित डाई होते हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक ठेठ तीन रंग मछली प्रयोग दिखा MetaCyte 3 डी मछली इमेजिंग सॉफ्टवेयर से स्क्रीनशॉट. स्क्रीन कई भागों में विभाजित है. Metafer / MetaCyte स्लाइड स्कैनिंग प्रणाली द्वारा कब्जा ए) कच्चे क्षेत्र के दृश्य (FOV) छवि. बी) गैलरी संयुक्त राष्ट्र है कि पहचान नाभिक की छवियों कीमछली संकेतों के लिए dergone इमेज प्रोसेसिंग और विभाजन. डेटा के विभिन्न प्रकार के प्रत्येक गैलरी छवि पर प्रदर्शित किया जा सकता है. द्वारा स्कैन क्षेत्र के साथ स्लाइड का विश्लेषण. डी में पहचान नाभिक की संख्या के साथ इस उदाहरण सेल संख्या में विभिन्न interallelic और interlocus दूरी शीर्ष अधिकार के साथ और प्रत्येक छवि के नीचे दोनों ओर के लिए ऊपर छोड़ दिया दिखाया गया है. सी) स्लाइड नाम) चित्रण स्कैन किए गए क्षेत्र की व्यवस्था. ई) इज़ाफ़ा. सफेद धब्बे FOV प्रति पहचान नाभिक का प्रतिनिधित्व करते हैं. एफ) प्रसंस्कृत डेटा. इस उदाहरण में हरे रंग का संकेत है (ऊपर) और लाल संकेत (नीचे) के बीच अधिक से अधिक interallelic दूरी दिखाए जाते हैं. दिखाया गया डेटा माउस P20 जर्म कोशिकाओं से है. जांच HBB और एचवीए जीन और एक histone क्लस्टर को कवर अलग क्रोमोसोम पर स्थित हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


4 चित्रा. संसाधित छवियों और व्युत्पन्न स्थितीय डेटा के उदाहरण हैं. Myc और Kcnq1 जीन (क्रमशः Myc और KvDMR, रंग हरे और लाल, कहा जाता है) interallelic दूरी का प्रतिनिधित्व. बी) Tukey बॉक्स गलमुच्छा भूखंडों को कवर अलग क्रोमोसोम पर स्थित बीएसी जांच के साथ दाग E13.5 माउस भ्रूण जिगर की कोशिकाओं के लिए एक) प्रसंस्कृत छवियों 600 नाभिक में एक ही स्थल के लिए वितरण. Interallelic दूरी परमाणु आकार में बदलाव के लिए खाते में नाभिक 'त्रिज्या (दूरी / त्रिज्या) के एक अंश के रूप में साजिश रची है. ES सेल नाभिक के चारों ओर 5 माइक्रोन की परिधि है. (पी <0.01, unpaired टी परीक्षण ***) लाल जांच हरी जांच से करीब एक साथ काफी हैं. 10 से डाटा.

मूवी 1. उनके गुणसूत्र टी के भीतर दो loci के 3 डी मॉडलिंगerritory. माउस 7 गुणसूत्र के दोनों छोर के पास स्थित दो बीएसी जांच लेबल (लाल और दूर लाल, (छद्म रंग सफेद)) और माउस ES कोशिकाओं के लिए एक पूरे गुणसूत्र रंग (हरा) के साथ संकरित थे. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

3 डी डीएनए मछली नाभिक में स्थानिक व्यवस्था का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त उपकरण बन गया है. मछली के रूप में हर तकनीक के साथ, दृश्य और प्रत्यक्ष परिणाम प्रदान करता है, एक अपनी सीमाओं के बारे में पता करने की जरूरत है. डीएनए मछली अपेक्षाकृत कठोर उपचार अंत में विश्लेषण किया जा रहा है कि परमाणु संरचना बहुत बात बाधित जो मछली जांच के लिए chromatin सुलभ बनाने के लिए आवश्यक हैं कि जन्मजात समस्या झेलनी पड़ती है. कई रणनीतियों पहुंच और संरचना संरक्षण हथकंडा करने के लिए अपनाई गई है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, गुणसूत्र डीएनए जांच के संकरण से पहले कोशिकाओं और गर्मी विकृतीकरण के फ्रीज पिघलना permeabilization के द्वारा सुलभ बना दिया है. Solovei, एट अल., (2002) इसी तरह के उपचार के बाद संरचनात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण किया और chromatin डोमेन की औसत विस्थापन जीनोम 8 में लगभग 1 एमबी क्षेत्रों के लिए संरचनात्मक विश्लेषण का संकल्प सीमा है, जो 300 एनएम था. इस उच्च संकल्प नहीं है, यहपरमाणु स्थिति का विश्लेषण करने के लिए एक उचित पैमाने पर है.

मछली के विश्लेषण के लिए एक और अधिक व्यावहारिक विचार है कि छवि के अधिग्रहण और परमाणु दूरी की माप का विश्लेषण किया जा सकता है कि नाभिक की संख्या सीमित है, जो समय लेने वाली प्रक्रिया है है. हम उच्च throughput स्वचालित इमेजिंग करने के लिए उद्देश्य से निराला घटनाओं का अध्ययन करने के लिए आदेश में. फिर, जगह में उपयुक्त नियंत्रण के साथ, पर्याप्त संख्या स्थानिक संबंधों की मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए तुलना की जा सकती. हम नियमित रूप से हम परमाणु मात्रा के भीतर सभी मछली संकेतों के 3 डी निर्देशांक निर्धारित जिसके लिए डेटा बिंदु प्रति 600 नाभिक का विश्लेषण. ये आंकड़े बहुत कम भंडारण स्थान की आवश्यकता होती है और अंतर और इंट्रा allelic दूरी, या किसी भी बिंदु पर बाद में रेडियल पदों के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, स्वचालित प्रसंस्करण बहुत बेहोश पूर्वाग्रह की संभावना को कम कर देता है जो एक शोधकर्ता अंधा तरीके से किया जा सकता है.

उच्च throughput analys के इस तरह सक्षम करने के लिए, हमारे लक्ष्य डीएनए मछली प्रदर्शन की एक तेज और कुशल तरीके से स्थापित करने के लिए किया गया है. हम प्रोटोकॉल लगातार कम पृष्ठभूमि के साथ उज्ज्वल संकेतों के उत्पादन, बेहद मजबूत होने के लिए यहाँ वर्णित पाया. यह हम स्लाइड करने के लिए कोशिकाओं को संलग्न करने के कदम अनुकूलित प्रदान की कोशिश की सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए काम किया. इसके अलावा, एक अपवाद के साथ, हम सभी इस्तेमाल BACS उज्ज्वल जांच में तब्दील किया जा सकता है. हम भी सफलतापूर्वक डीएनए मछली के बाद एंटीबॉडी धुंधला द्वारा परमाणु प्रोटीन का एक नंबर का पता चला है. यह अच्छी तरह से काम करता है कुछ प्रोटीन के लिए करते हैं, हम अगर और डीएनए इम्युनो मछली (11) की तुलना के बीच एंटीबॉडी धुंधला पैटर्न की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए परंपरागत immunofluorescence (यदि) के साथ तुलना की सलाह देते हैं.

आम तौर पर, हम अलग अलग रंग में लेबल जांच ही परिणाम है कि उत्पादन पाया. लेबलिंग डाई जब चुनने हालांकि, निम्नलिखित पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, की fluorophore रंग माइक्रोस्कोप यू द्वारा अच्छी तरह से पता लगाने योग्य होने की जरूरतपता. दूसरा, fluorophores के द्वारा उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य अन्य चैनल में माध्यम से खून से बचने के लिए पर्याप्त रूप से अलग होना चाहिए. इस माइक्रोस्कोप में फिल्टर पर निर्भर करेगा. और तीसरा, कम से कम हमारे हाथ में कुछ रंग अधिक लगातार दूसरों की तुलना में उज्जवल संकेतों का उत्पादन. हम हमेशा जांच लेबलिंग के लिए अच्छा विकल्प एलेक्सा Fluor 555 (लाल), 488 (हरा) बनाता है जो एक counterstain रूप DAPI (नीला) का इस्तेमाल किया, और 647 (दूर लाल) है. हमारे इमेजिंग प्रणाली के साथ, हम एलेक्सा Fluor 488 (हरा) के बाद प्रतिभाशाली संकेतों, निर्माण करने के लिए एलेक्सा Fluor 555 (लाल) पाया. एलेक्सा Fluor 647 (दूर लाल) यह मानव आँख से नहीं पाया जा सकता है और माइक्रोस्कोप के नीचे देख जब इसलिए कोई संकेत देखा जा सकता है कि नुकसान है. दो रंग मछली कर इस प्रकार, यदि हम लाल और हरे रंगों के संयोजन की सलाह देते हैं.

दो प्रमुख समस्याएं पैदा कर सकते हैं: कक्षों स्लाइड और कमजोर संकेतों दूर धोने. अच्छी तरह से कोशिकाओं स्लाइड का पालन कैसे बेहद चर betw हैeen प्रकार की कोशिकाओं और कोशिकाओं को निर्धारित करने की आवश्यकता है / बीज व्यवस्थित करने के लिए सबसे अच्छा प्रोटोकॉल. हम सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है या तो सकारात्मक आरोप लगाया या पाली एल lysine लेपित स्लाइड्स (इस्तेमाल के लिए तैयार खरीदा है), लेकिन कोशिकाओं को आम तौर पर पाली एल lysine लेपित स्लाइड्स के लिए बेहतर पालन पाया. हम यह भी कोशिकाओं स्वचालित इमेजिंग बाधा उत्पन्न किया गया था, जबकि बहुत घने पूरे क्षेत्रों, एक पत्र के रूप में दूर छील होगा थे जब कोशिकाओं को भी विरल थे कि पाया. नमूना भी कीमती नहीं है इस प्रकार, यदि अलग सेल नंबर आदर्श घनत्व निर्धारित करने के लिए वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. कोशिकाओं को धोने के लिए विशेष रूप से ग्रस्त हैं, तो एक hydrophobic बाधा कलम का इस्तेमाल किया जा सकता है, और मछली कदम सावधानी से सीधे स्लाइड पर समाधान pipetting द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. Pipetting भी काफी जरूरत अभिकर्मकों की मात्रा कम कर देता है, लेकिन एकाधिक स्लाइड कर जब काफी समय लेता है.

कमजोर संकेतों आमतौर पर गरीब जांच की वजह से कर रहे हैं, और यह अच्छे लोगों को बनाने में समय निवेश के लायक भी है. स्वच्छ बीएसी डीएनए का उपयोग किया जाना चाहिएदोहराया वर्षा या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो सामग्री के रूप में शुरू किया. बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के साथ प्रदूषण को नकारात्मक रूप से सेल के दौरान जांच की गुणवत्ता और सावधानी से निपटने को प्रभावित करता है और सेल lysate के फिल्टर एक न्यूनतम करने के लिए रखने के लिए यह आवश्यक है. यह बहुत उपज कम कर देता है के रूप में यह है, तथापि, रैखिक डीएनए को पचाने के लिए एक exonuclease कदम का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है. जांच के कुशल लेबलिंग महत्वपूर्ण है. इस कदम के लिए सबसे महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण (प्रतिनिधि परिणाम देखें) निक अनुवाद के बाद टुकड़ा आकार जाँच कर रहा है. एक 'अच्छा' धब्बा लगभग हमेशा एक चमकीले रंग जांच का परिणाम देगा. हालांकि, हम कभी कभी एक निश्चित बीएसी एक अच्छा जांच में कार्रवाई की है, और एक अलग बीएसी चुने जाने की आवश्यकता नहीं किया जा सकता है कि मिल गया है. एक और महत्वपूर्ण कदम गर्मी विकृतीकरण है. तापमान बहुत कम है, डीएनए केवल आंशिक रूप से विकृत हो जाएगा और जांच संकरण ख़राब हो जाएगा. तापमान बहुत अधिक है, तो परमाणु संरचना वाईआवश्यकता से अधिक परेशान हो जाएगा. हमारे हाथ में, एक औंधा गर्म ब्लॉक पर 78 डिग्री सेल्सियस आदर्श समझौता है, लेकिन इस का इस्तेमाल संबंधित गर्म ब्लॉक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.

हम Vectashield बढ़ते माध्यम का उपयोग कर अच्छे परिणाम था, लेकिन SlowFade गोल्ड कम पृष्ठभूमि है और लंबे समय तक के लिए फ्लोरोसेंट संकेत को बरकरार रखता है कि मिल गया है. हम इस 3 डी संरचना को प्रभावित करने के लिए और समय के साथ हवा बुलबुले बनाने के लिए मिल गया के रूप में हम कड़ी मेहनत से सेट बढ़ते मध्यम के इस्तेमाल की सिफारिश नहीं है.

अंत में, यहाँ वर्णित डीएनए मछली प्रोटोकॉल के साथ चमकीले फ्लोरोसेंट सीधे लेबल जांच जैविक सवालों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है जो परमाणु वास्तुकला की मजबूत और तेजी से विश्लेषण के लिए एक कुशल समाधान प्रदान करते हैं.

Disclosures

इस लेख का उत्पादन आंशिक रूप से कार्ल जीस और MetaSystems द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Acknowledgments

इस काम बीबीएसआरसी और वेलकम ट्रस्ट द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम bioinformatic विश्लेषण के साथ मदद के लिए इमेजिंग और फेलिक्स ईद्भूजर के साथ सहायता के लिए साइमन वाकर को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
NTB buffer Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT Invitrogen D-1532 Step 1.1.1
dNTPs Bioline BIO-39025 Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP Ambion AM8439 Step 1.1.1
DNA Polymerase I New England Biolabs M02095 Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free Roche 4716728001 Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc VWR 27653 Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3 Sigma S5761 Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications Invitrogen (Molecular Probes) A32750, A32756, A32757 Step 1.2.2
DMSO (anhydrous) Sigma Aldrich 276855 Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain Life Technologies S33102 Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA Invitrogen 18440-016 Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes Sigma D7656 Step 2.1.1.1
Deionised formamide Sigma F-9037 Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate Sigma Life Sciences D8906 Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes MetaSystems 000000-0528-837 Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides Sigma Aldrich P0425 Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge) Vector Laboratories H-4000 Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only) BD Falcon 352350 Step 2.1.2.1
PFA Sigma Aldrich P6148 Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark Sigma Aldrich 47036 Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100 Sigma T9284 Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS Life Technologies (GIBCO) 70011-036 Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol Fisher Scientific G/0650 Step 2.1.6
HCl VWR 20252 Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide Sigma Aldrich 47670 Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22 Menzel-Glaser BB022022A1 Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50 Menzel-Glaser BB022050A1 Step 2.1.15
Rubber cement Marabu 2901 (10 000) Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI Invitrogen Molecular Probes D3571 Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold Invitrogen S36936 Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish Any supplier Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager GE Life Sciences Step 1.2.4
Coplin jars Sigma-Aldrich S6016 (6EA)/S5516 (6EA) Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar Any supplier Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber) Simport M920-2 Step 2.1.17
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform MetaSystems automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis MetaSystems automated imaging software
Axio Imager Z2 upright Zeiss epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000) Olympus confocal microscope
Bitplane, version 7.3 Imaris image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1 Huygens image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes
Name Composition Comments
10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5
0.05 M MgCl2
0.5 mg/ml BSA
dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C
0.5 mM dATP
0.5 mM dCTP
0.125 mM dTTP
4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze
2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C
20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave.
Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C

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References

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