שימוש cytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

הנה, אנחנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש בcytometry תמונה לכימות של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח בתרבות. טכניקה זו יכולה לשמש כאלטרנטיבה לספירת CFU.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Berkes, C., Chan, L. L. Y., Wilkinson, A., Paradis, B. Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells. J. Vis. Exp. (76), e50599, doi:10.3791/50599 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחקרים של מנגנוני פתוגנזה הסלולר של שמרים פתוגניים כגון קנדידה אלביקנס, capsulatum Histoplasma, וneoformans Cryptococcus להעסיק זיהום של מארחים יונקים או תאים מארחים (כלומר מקרופאגים) ואחריו כימות שמרים באמצעות מושבה להרכיב יחידת ניתוח או cytometry זרימה בדרך כלל. בעוד ספירת יחידת המושבה להרכיב כבר את השיטה הנפוצה ביותר בתחום, יש לו טכניקה זו חסרונות ומגבלות, כולל צמיחה איטית של כמה מיני פטריות על תקשורת מוצקה ויעילות ציפוי נמוכה ו / או משתנה, וזה מדאיג במיוחד כאשר משווה צמיחה של זני הבר מסוג והמוטציה. cytometry הזרימה יכול לספק מידע כמותי לגבי כדאיות שמרים מהיר, לעומת זאת, האימוץ של גילוי תזרים cytometric לשמרים פתוגניים היה מוגבל למספר סיבות מעשיות הכולל עלות הגבוהה שלה ושיקולי biosafety. הנה, אנחנו מדגימים מבוססי תמונההמתודולוגיה cytometric באמצעות חזון Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) לכימות של שמרים פתוגניים קיימא בשיתוף התרבות עם מקרופאגים. המחקרים שלנו להתמקד בזיהוי של שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח'. capsulatum colonizes מקרופאגים מכתשיים ידי שכפול בתוך phagosome מקרופאג, והנה, אנו כמותית להעריך את הצמיחה של ה שמרי capsulatum ב264.7 מקרופאגים RAW באמצעות acridine כתום / מכתים יודיד propidium בשילוב עם cytometry תמונה. השיטה שלנו בנאמנות מגמות צמיחה כפי שהיא נמדדת על ידי משחזרת מושבה מסורתית ויצרה ספירת יחידה, אבל עם רגישות מוגברת באופן משמעותי. בנוסף, אנו ישירות להעריך זיהום של מקרופאגים לחיות עם זן ה-GFP-לבטא של ג אלביקנס. המתודולוגיה שלנו מציעה אמצעי מהיר, מדויק וחסכוני לאיתור וכימות של פתוגנים פטרייתי אדם חשובים בשנינות העמותהתאי מארח h.

Introduction

מחקרים של פטריות פתוגניים בשיתוף עם המארחים ו / או תאי מארח שלהם לעתים קרובות דורשים כימות של תאים פטרייתיים קיימא לאורך זמן או כמובן בתנאי זיהום שונים. ספירה של יחידות מושבה להרכיב (CFU) היא השיטה הסטנדרטית שבו מספר התאים פטרייתיים קיימא כבר נמדד, לעומת זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות ומגבלות. ראשית, הרבה מיני פטריות הם בצמיחה איטית. צמיחה של מושבות גלויות על תקשורת מוצקה יכולה לקחת 1-2 שבועות, להאט את קצב המחקר באופן משמעותי. שנית, מניפולציה של דגימות במהלך ציפוי CFU היא תהליך מייגע, שכן כמה דילולים חייבים להיות מצופה על מנת להבטיח מספר מנייה של מושבות. שלישית, מספר CFU הוא בדרך כלל נמוך יותר ממספר אורגניזמים קיימא מצופים בגלל יעילות הציפוי היא גם מתחת ל -100%. לדוגמה, ביעילות ציפוי לcapsulatum Histoplasma הפתוגן פטרייתי דימורפית יכולה להיות גבוהה ככל 90%, אך באופן שגרתי הן נמוכות כמו30% והם נמוכים אף יותר (10%) לdimorph brasiliensis הקשור פטרייתי Paracoccidioides 1, 2. ציפוי יעיל לקנדידה אלביקנס כפוף גם לשונות 3. לבסוף, ניתוח CFU מהווה רק תאי חיים ופעילים המסוגלים חלוקת ביסוס צמיחה על תקשורת מוצקה, ואילו במצבים רבים, זה יהיה שימושי כדי לקבוע את הנוכחות והריכוז של תאים מתים שאינם פעילים ו / או חילוף חומרים.

בעבר, שיטות תזרים cytometric לכימות של כמה מיני פטריות פתוגניים תוארה 4-6. עם זאת, בשל בעיות בלימת biosafety מעורבות עם השימוש בפתוגנים BSL3 ברמת בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL2) או על cytometers זרימה משותף, האימוץ של טכניקה זו היה מוגבל. כמו cytometry הזרימה, cytometry התמונה הוא שיטה רגישה ומהירה של תא כימות. עם זאת, ניתן לבצע cytometry תמונה בכל חלק של העלות עם תוצאות דומות 7 -11. כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע cytometry תמונה של פטריות פתוגניים בשיתוף עם תאי מארח. אנו מדגימים את השיטות שלנו באמצעות שני פתוגנים פטרייתי אדם: capsulatum Histoplasma וקנדידה אלביקנס ח'. capsulatum הוא פתוגן פטרייתי דימורפית שגורם למחלות בדרכי הנשימה, בבני אדם, שהוא גדל שמרי ניצנים וכמשכפל בתוך מקרופאגים מכתשיים קנדידה אלביקנס הוא מין commensal אדם שלעתים גורם לקנדידה.. אנו מראים כי cytometry התמונה מאפשרת כימות מהירה של שמרים אלה, יחד עם יכולת הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זיהום של המקרופאגים עם ח' capsulatum, ג אלביקנס

  1. 16 שעות לפני ההדבקה, מקרופאגים זרעים בצפיפות רצויה ב24 גם צלחות. בפרוטוקול זה, צפיפות של 3.0 x 10 5 תאים / גם הייתה בשימוש.
  2. הוסף תאים פטרייתיים בצמיחת יומן שלב בריבוי רצוי של זיהום (משרד הפנים). פרוטוקול זה יכול להכיל מגוון של משרד הפנים (0.2-5.0). להדבקת RAW264.7 מקרופאגים עם ח' capsulatum, השתמשנו במשרד פנים של 0.2.
  3. בעקבות 1.5 שעות כדי לאפשר לphagocytosis, לשטוף מקרופאגים שלוש פעמים עם PBS להסיר פטריות תאית.
  4. דגירה של מספר רצוי של שעות לפני ניתוח מדגם. במשרד פנים נמוך (0.2 בניסוי שלנו), תאי macrophage נגועים להישאר קיימא במשך כמה ימים, וניתן לנתח דגימות בערך כל 12-24 שעות.

2. תמוגה מקרופאג

  1. לשחרר את פטריות מתאי macrophage, להסיר תקשורת, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולהוסיף 0.5 מיליליטר מים סטריליים. בתנאים אלה, יהיו lyse מקרופאגים ותאי פטריות יישארו ללא שינוי.
  2. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  3. העבר lysate לצינור סטרילי, לשמור על קרח.
  4. העבר את 20 lysate μl לצינור נפרד, ולאחר מכן להוסיף פתרון PI 20 AO / μl. להמשיך ישירות לשלב 5: "לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה"

3. ציפוי CFU

  1. לבצע דילול של פי עשרה מlysates (משלב 2.3) בתקשורת.
  2. צלחת μl 100 של דילול כל, בשני עותקים, על צלחות HMM-agarose. דגירה צלחות בתא humidified על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 7-8 ימים.
  3. לספור ידני מושבות על צלחות מוצגות מינימום של 100 ועד למקסימום של 1,000 מושבות נפרדות.

4. ויזואליזציה של פטריות בתוך המקרופאגים חיים

  1. לאסוף מקרופאגים חיים, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBS. הוסף 0.5 מ"ל PBS ו דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  2. כדי להסיר מקרופאגים מבארות תרבית רקמה, בעדינות פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים. העבר את הנוזל לצינור סטרילי, לשמור על קרח.
  3. העבר את 20 מדגם μl לצינור נפרד, ולאחר מכן להוסיף פתרון PI 20 AO / μl. להמשיך ישירות לשלב 5: "לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה".

5. לדוגמא הכנה לניתוח cytometric תמונה

  1. פיפטה מדגם היעד ביסודיות ולאחר מכן להעביר 20 μl של דגימה לתוך תא ספירת תאים חד פעמי.
  2. אפשר התאים להתיישב בחדר למשך 30 שניות.
  3. הכנס לספור קאמרית לcytometer התמונה.

6. התקנת מכשיר Cellometer

  1. הכנס את מודולים אופטיים הקרינה: VB-535-402 ו-VB-660-502 למערכת ולוודא שהם נעולים במקום.
    1. VB-535-402 (עירור ב 475 ננומטר, פליטה ב 535 ננומטר) משמש לacridine כתום וגילוי ה-GFP.
    2. VB-660-502 (excitatiב540 ננומטר, פליטה ב 660 ננומטר) משמשת לזיהוי יודיד propidium.
  2. הפעל cytometer התמונה ולפתוח את התוכנה הנלווית.

7. התקנת תוכנת Cellometer

  1. בחר את "סוג assay" הקבוע מראש ו" סוג סלולרי "בתפריט הנפתח Assay.
    1. לכדאיות, assay הוא מותאם לacridine כתום וזיהוי יודיד propidium.
    2. לצורך זיהוי של זיהום קנדידה אלביקנס, assay מתוכנן לגילוי ה-GFP.
  2. בחר "אפשרויות" בחלק העליון ולחץ על "תמונת רקע לקחת", ולאפשר את הפעולה כדי להשלים.
  3. לחץ על "תמונה בהירה שדה תצוגה מקדימה".

8. הליך רכישת תמונה

  1. הכנס את המדגם קאמרי המוכן לcytometer התמונה.
  2. השתמש בכפתור הפוקוס ולהתאים את הפוקוס.
  3. פעם אחת בפוקוס, לחץ על "רוזן", ולאפשר את פעולת רכישת התמונה כדי להשלים.
  4. רמוve חדר ספירה חד פעמי ולהשליך כראוי.

9. ניתוח נתוני תמונה

  1. ריכוז ומדידת כדאיות
    1. ברגע שהספירה הושלמה, הריכוז ויכולת הקיום של תאי המטרה מוצגים בדף התוצאות.
    2. לחץ על "יצוא" כדי לייצא את הנתונים לFCS Express 4 לניתוח אוכלוסיית תאי ה-GFP בניסוי זיהום קנדידה אלביקנס.
  2. ניתוח FCS אקספרס של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס
    1. לייבא את קובץ ". NXDAT" לFCS Express 4 ועלילה את התוצאות ביסטוגרמה פלואורסצנטי.
    2. החל שער אוכלוסיית תא ליסטוגרמה כדי לקבוע את אחוזי האוכלוסייה של תאים נגועים בקנדידה אלביקנס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו השתמשנו cytometer תמונת חזון Cellometer לפקח צמיחה של ה capsulatum בתאי macrophage. 264.7 תאי RAW היו נגועים בח' תאי שמרי capsulatum ובנקודות זמן שונים, דגימות היו נתונים לצביעת AO / PI ואחרי ניתוח cytometric מבוסס תמונה. במקביל, דגימות נותחו על ידי ספירת CFU מסורתית. בכל נקודת זמן, דגימות הודגרו במים לlyse מקרופאגים, ותאי השמרים המשוחררים זוהו על ידי תוכנת חזון Cellometer (1A ו-1B דמויות). אנו רואים מגמות דומות מאוד בריכוז של שמרי קיימא זוהה על ידי ניתוח cytometric מבוסס תמונה ופקידת CFU בכל נקודת זמן (איור 1 ג'). כצפוי, המספר המוחלט של שמרי חיים שזוהו על ידי צביעת AO / הצרכן היה גבוה יותר באופן עקבי ממספר השמרים המסוגלים הקמת מושבה על מצע מוצק כפי שהוערך ע"י ניתוח CFU, הדגשת סימןמספרי ificant של תאי קיימא אך אינן מעובדת.

ויזואליזציה של תאים פטרייתי בתוך מקרופאגים חיים יכולה להיות מושלמת בעזרת ה-GFP-לבטא זני שמרים. מקרופאגים מח העצם (שמקורם BMDM) היו נגועים בג תאי שמרי אלביקנס לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת שליטה של אמרגן ADH1 12 (איור 2 א). זיהום של BMDM עם GFP-ג שמרי אלביקנס בmultiplicities של זיהום (משרד הפנים) הנע 0.1-10 תואם את העלייה הדרגתית בעוצמת GFP בתוך מקרופאגים נגועים (איור 2 א), כמו גם אחוז הכולל של מקרופאגים נגועים (איור 2b).

איור 1
איור 1. השוואה בין ניתוח cytometric מבוסס תמונה לCFU ספירה של ה ' capsulatum במהלך זיהום במבחנה של 264.7 מקרופאגים RAW. () 264.7 מקרופאגים RAW היו נגועים בח שמרי capsulatum במשרד פנים של 0.2. ב 24 מרווחי הפועל בעקבות זיהום, מקרופאגים היו lysed ושמרי קיימא הוערכו על ידי צביעת AO / PI במקביל לספירת CFU. (ב) נציג brightfield (BR) וFL1/FL2 (ירוק / אדום) תמונות משולבות של AO / PI הצבעוני H . capsulatum שוחרר מ264.7 מקרופאגים RAW lysed. אלגוריתם פילוח נספר רק שמרים חיוביים AO וPI בתמונות הניאון בעוד 264.7 מקרופאגים RAW PI המוכתמים הגדולים (אדום) אינם נכללים. תמונות שנתפסו בהגדלת 10x. (ג) השוואה ישירה של תפוצת שמרים כפי שהוערכה על ידי צביעת AO / PI וספירת CFU. ניתוח רגרסיה ליניארית של מגמות הצמיחה כפי שהיא נמדדת על ידי CFU ותשואת ניתוח Cellometer R 2 = 0.9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. כימות זיהום BMDM עם זן ה-GFP-לבטא של ג אלביקנס. () כבש brightfield (BR) (למעלה) וניאון (באמצע) תמונות של ה-GFP-ג אלביקנס נגוע BMDMs בהגדלת משרד הפנים. Histograms של עוצמות הקרינה מצביע על עלייה בעוצמת הקרינה ה-GFP כמשרד פן עליות, המייצגת את גידול במספר ג אלביקנס קשור עם תאי BMDM (תחתון). התוכנה זיהתה BMDMs נגוע המבוסס על יישום של סמן ליניארי בבסיס עוצמת הקרינה המוצגת על ידי אוכלוסיית השליטה נגוע (משרד הפנים = 0). (ב) באחוזים infection כפונקציה של משרד הפנים, אשר מראה עלייה בBMDMs נגועות כמו משרד הפנים עליות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

cytometry התמונה מאפשרת למשתמש ללכוד תמונות באיכות גבוהות, ובאמצעות תוכנה מיוחדת, לבצע כימות מהירה של תאים. אתגר אחד פוטנציאל לאימוץ cytometry תמונה בתחום פתוגנזה של חיידקים הוא שהחיידקים שנספרו נמצאים באוכלוסייה מעורבת של תאים, כולל תאי מארח יונקים. כאן, אנו מראים כי cytometry תמונה יכולה לשמש לכימות של שמרים פתוגניים קיימא במהלך הזיהום במקרופאג מבחנה. אמונה את מגמות המתודולוגיה שלנו לא רק משחזרת בצמיחת פטרייתי ואת כדאיות שבנצפתה במהלך מבחני זיהום מקרופאג חוץ גופית, אלא גם מציג את הרגישות משופרת בהשוואה לassay CFU 13 המסורתי.

cytometry התמונה מציעה מספר יתרונות מעשיים בהשוואה לספירה או CFU או cytometry זרימה לכימות של תאי שמרים. כאשר ציפוי CFUs, עובדי מעבדה חייבת צלחת כמה dilutיונים על מנת להבטיח מספר מנייה של תאים על כל צלחת, אשר יכול להיות עבודה אינטנסיבית מאוד. cytometry התמונה מבטלת את הצורך בדילולים מרובים. בעבר, הראו כי הקמת מושבה על תקשורת מוצקה היא לעתים קרובות משתנה, ופטריות בריכוזים נמוכות מאוד עלול להיכשל כדי ליצור מושבות בכלל, ואילו cytometry התמונה מאפשרת ספירה של תאים ללא קשר לריכוז 13. היכולת לזהות ולספור פטריות בריכוזים נמוכים מאוד יכולה להיות מאוד שימושית בשלבים המוקדמים של זיהום במינון נמוך, או באישור, כאשר מספרים וכדאיות יכולים להיות בשוליים של זיהוי. בנוסף, הנתונים שנוצרו על ידי cytometry תמונה זמינים באופן מיידי, ואילו מושבות עשויות להימשך מספר ימים כדי להיות גלוי. אמנם ניתן לאתר הרבה מיני פטריות על ידי cytometry הזרימה, האפשרות של זיהום צולב היא דאגה במתקנים משותפים. חדר הספירה השתמש במחקר זה מציע יתרון משמעותי במונחים של בטיחות ביולוגית, כפי שהוא disposabLe ועצמאי. יתר על כן, תמונת cytometry מציעה את היתרונות המעשיים של מחיר נמוך יותר, וטביעת רגל קטנה יותר בהשוואה לזרימת cytometry הקונבנציונלי, אשר יכולה להיות חשוב למחקר קטן 11 מעבדות.

בנוסף ליתרונות המעשיים שלה, cytometry התמונה של תאי שמרים מספק מידע שספירת CFU לא יכולה. ראשית, ספירת CFU היא רק מסוגלת לזהות פטריות כי הם מסוגלים להקים מושבה על צמיחת המדיום הנבחר, אשר עשוי שלא לייצג במדויק את מספר פטריות קיימא הנמצאים בניסוי זיהום בזמן אמת. כמו כן, היכולת להקים צמיחת מושבה על תקשורת מוצקה יכולה להשתנות כאשר משווים זני הבר מסוג והמוטציה של פטריות, שיכול להיות מקור להטיית ניסיונית 14, והטיות נסתרות אלה עשויים להתגלות על ידי השוואה של cytometry תמונה וכימות של CFU זני הבר מסוג ומוטציה. ברגע שהתנהגותו של זן מסוים מתאפיינת בוספירת ה CFU וcytometry תמונה, אנו מאמינים cytometry התמונה שיכולה לשמש כאמצעי חלופי לכימות פטרייתי.

מגבלה אחת של cytometry בתמונה כללית היא שזה לא מאפשר איסוף של נקודות נתונים רבות כמו cytometry הזרימה. מאז cytometer התמונה נובע מנתונים כמותיים במספר מצומצם של תמונות שנתפסו, קשה למערכת כדי לאסוף נתונים על מאות אלפי למיליוני תאים לכל מדגם. עם זאת, מגבלה זו עשויה להיות לעקיפה על ידי קיבוץ דגימות מרובות לתוך קבוצה אחת של נתונים לניתוח על מנת להגיע לנקודתי נתונים דומות כמו cytometer זרימה. כמו כן, אנו רוצים להדגיש כי שיטת צביעת AO / PI משמשת כאן מייצגת דרך אחת למדידת כדאיות סלולרית, ואינו מצביעה בהכרח על חיוניות ו / או היכולת להקים צמיחה על מצע מוצק בכל מדגם נתון סלולריות. לכן, בעוד שהשיטה שלנו מספקת שיטה קלילה של כימות חי / המת של שמרים, זהגם יהיה מעניין לבדוק את השימוש בcytometry תמונה בשילוב עם אינדיקטורים חילוף חומרים תאיים כגון כיף-1 15.

תוכנת cytometry תמונה מזהה וסופרת תאים של עניין המבוסס על גודל וצורה, ולכן, זה קריטי, כי פרמטרים אלה נקבעים בזהירות בכל ניסוי. בעת ביצוע cytometry תמונה עם זן שמרים חדש, אנו מציעים שאחד ראשון להשוות נתונים שנוצרו מתרבית שמרים טהורה לנתונים שנוצרו מתערובת של ספירת שמרים בתוספת תאי פונדקאים כדי להבטיח כי הפרמטרים מוגדרים כך שהתוכנה יכולה להבחין בין שני סוגי תאים.

בעתיד, עבודה זו תהיה הבסיס להמשך פיתוח של שיטות כדי לזהות ולכמת את חיידקים באמצעות cytometry תמונה. לדוגמה, פיתוח של שיטות cytometric תמונה כדי לזהות פטריות בתוך homogenates האיברים יהיה שימוש רב בתחום. אתגר נוסף בעתיד יהיה לדevelop ולחדד את שיטות cytometric תמונה ותוכנה כך שהוא יכול לשמש לכימות של תאים חיידקיים. עם ההתקדמות במערכות אופטיות, מצלמות דיגיטליות, ומגוון רחב של כתמי ניאון בתחום, יכולת התמונה ולנתח את אוכלוסיית חיידקים יכול להיות מיושמת בcytometers תמונה, אשר יכול לספק שיטה מהירה יותר לריכוז ויכולת קיום או חיוניות מדידה בהשוואה לשיטות CFU או צפיפות אופטית. לסיכום, העבודה שהוצגה כאן היא הוכחה של קונספט מראה כי cytometry התמונה היא שיטה רגישה לכימות של שמרים פתוגניים. התחכום של תוכנת ניתוח cytometric מבוססת תמונה מציע את ההזדמנות כדי לנתח אינטראקציות בין תאי מארח ופטריות מחוללי מחלות באופן כמותי מאוד. טכנולוגיה זו עשויה להיות מותאמת כדי לטפל במגוון רחב של שאלות מחקר בתחום הפתוגנזה פטרייתי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

את ליאו Li-יינג צ'אן וParadis בנימין הכותבים הם עובדי Nexcelom Bioscience LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
DMEM Life Technologies 11965-084
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000044
AO/PI Solution Nexcelom Bioscience CSK-0102
Disposable Counting Chamber Nexcelom Bioscience CHT4-SD100
EQUIPMENT
Cellometer Vision Nexcelom Bioscience
Cellometer Vision Software Nexcelom Bioscience

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Comments

1 Comment

  1. Reply
    Posted by: biocorp b.
    June 20, 2013 - 4:41 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics