במקביל לכידת תמונות בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה: יישומים לסלולריים הידבקות

1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Russ College of Engineering and Technology, Ohio University, 2Biomedical Engineering Program, Ohio University
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה למיקרוסקופ פלואורסצנטי שני צבעים ליצור רצפי תמונה בזמן אמת עם רזולוציה אופטית ובזמן חריג, דרישה של מבחני תא חי מסוימים, לרבות מבחני זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילות. כאשר תוכנה היא מועסק למזג תמונות מערוצי פליטה רכשו בו זמנית, רצפי תמונת pseudocolored מיוצרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מיקרוסקופיה immunofluorescence צבע רב כדי לזהות מולקולות ספציפיות בקרום התא יכולה להיות בשילוב עם מבחני זרימת צלחת קאמריים במקביל לחקור את המנגנונים המסדירים את הידבקות תא בתנאי זרימה דינמיות. לדוגמא, ניתן perfused תאים הסרטניים שכותרתו עם fluorophores מרובה על פני מצע שעלול להיות תגובתי למודל מנגנונים של גרורות סרטניות. עם זאת, מערכות מצלמה אחת מרובה ערוצים ומצלמות צבע חסרונות תערוכה ברכישת תמונה לניתוח תא חי בזמן אמת. כדי להתגבר על המגבלות האלה, השתמשנו מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה כדי ללכוד בו זמנית רצפי תמונה בזמן אמת של תאים שכותרתו fluorescently בתא הזרימה. אורך גל מסנן מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה מוגדר נע לשתי מצלמות CCD בצבע אחד, ובכך בו זמנית ללכוד שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי. בהמשך לכך, תמונות אחד ערוצי psuedocolored משולבות לתוך אחדזמן אמת התמזג רצף שיכול לחשוף מולקולות מטרה מרובות בתאים עוברים במהירות על פני אזור של עניין.

Introduction

שיטות לניתוח של מולקולות על פני התא, כגון immunostaining, להעסיק בדיקות הכימיות מצומדת לfluorophores, המאפשרים זיהוי של מולקולות מטרה. הדמיה תא חי ומבחני הידבקות תא המבוסס על זרימה הידרודינמית נרשמים בדרך כלל עם מצלמות CCD מונוכרום נועדו ללכוד תהליכים פיסיולוגיים ברמה התאית ו / או מולקולרית 1, 2. מצלמות אלה הן מאוד רגישות, לספק שיעורים מהר מסגרת (יותר מ 30 פריימים לשניה), ולספק פתרון זמני חריג (עקב שיעורים מהר מסגרת וזמני חשיפה קצרה). עם זאת, מצלמות מונוכרום יכולות רק ללכוד ערוץ פליטה בודד (גילוי fluorophore יחיד) כדי לאסוף את התמונות. ניתן לשלב מערכות פיצול פליטת מצלמה אחת כדי ללכוד ערוצי פליטה מרובים, אך לעתים קרובות לצמצם את שדה הראייה ודורשות באותו זמן חשיפה להדמיה את כל הערוצים. כדי ללכוד את קשת צבעים מלאים מהתאים שכותרתו עם multiple fluorophores, מצלמה צבע יכולה לשמש כחלופה. עם זאת, מצלמות צבע הם בדרך כלל לא מסוגלים לספק הרזולוציה של הזמן רצוי להדמית תא חי ביישומים מסוימים. מכשיר הדמיה נוסף נחוץ ליישומים בהם יש יתרון לתאי חי תמונה באורכי גל מרובה תוך שמירה על רזולוציה גבוהה זמנית. יישום ניסיוני ראש הוא assay המקביל תזרים צלחת קאמרי ההידבקות, שבו תאים הם perfused בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית על מצע פוטנציאלי תגובתי 1, 3. תאים בזרימה המבטאים את המולקולות בתא שטח ספציפיות עשויים לדבוק ומתגלגלים על המצע, כגון monolayer תא לבטא מולקולות הדבקות או חלבונים adsorbed משטח תאיים מטריקס 4, 5. תאים מתגלגלים עשויים לעבור תנועה סיבובית וtranslational בחלקיקים שניים. תכונות מולקולריות במתגלגלים ותאים חסיד, כגון צבירים של מולקולות בתא שטח, יש גם potentiאל לעבור ארגון מחדש פעיל על פני התא. לכן, מערכות הדמיה חייבות לספק פתרון זמני חריג (30 פריימים לשניה ומעלה ו" קרובים לאפס "זמני חשיפה) כדי ליצור רצף תמונה הממחיש את התקדמות צעד אחר צעד של התא מתגלגל 6, 7. מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה הן מסוגלים לעמוד בדרישות אלה לתאי הדמיה שכותרתו עם fluorophores מרובה.

מערכות פיצול פליטת מצלמה כפולה לפצל וערוצי הקרינה מסנן לשתי מצלמות דומות כדי ללכוד בו זמנית שתי תמונות מרחבית זהות אבל fluorophore הספציפי תוך שמירה על השדה המלא של תצוגה. טכנולוגיה זו מאפשרת השוואה ישירה של התמונה שצולמה בזמן אמת בכל ערוץ ומאפשרת למשתמש לעבור במהירות בין דגמי מצלמות עם יכולות הדמיה שונות. תכונה זו שימושית לביצוע התאמות להגדרות לכידת תמונה במצלמה אחת שטוב יותר לאפשר למערכת כדי ללכודfluorophores עם עוצמות שונות, תקופות חיים, ומקדמי הכחדה 8. יחד עם תוכנת הדמיה, מערכות פיצול כפולה מצלמה פליטה מאפשרות הקלטה של מבחני הדמיה תא חיים באורכי גל מרובים בזמן אמת ועשויות לשפר את מבחני במבחנה המשתמשים בקרינה כדי ללמוד על התנהגות תא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התקנת תוכנה

  1. לרכוש StreamPix 5 תוכנת Multi-מצלמה עם מודול SimulPix או תוכנת הדמיה אחרת מסוגל איסוף ושילוב של תמונות שנתפסו על ידי מצלמות CCD מונוכרום.
  2. דרישות מינימום עבור StreamPix 5 כוללות: מחשב מצויד בCore 2 Duo עם 2.4 GHz או יותר טוב עם GB זיכרון RAM 2 ומעלה. מצלמה נתמכת IEEE דיגיטלי או אנלוגית ולוכד תמונות תואמות. Windows XP/7/Vista 32 או 64 קצת. צג תומך ברזולוציה 1,024 x 768 ומעלה. מתאם גרפי עם ביצועים טובים 2D (יחידת פשע מאורגן להביע 16x או יותר מומלץ) וכונן דיסק קשיח 7,200 סל"ד להקלטה בתצורת RAID-O.

2. התקנה של מערכת מצלמה כפולה מסוגלים שתי הדמיה בזמן אמת הצבע סימולטני

  1. חבר את מפצל DC2 Photometrics פליטה, או התקן פיצול פליטת מצלמה כפולה דומה, למיקרוסקופ על ידי הזזה מתאם DC2 C-Mount ליציאת וידאו של MICRoscope כך שהדיור של dichroic במכשיר הוא נגיש.
  2. הכנס את שתי מצלמות CCD מונוכרום לתוך C-mount 1 נקבה והנקבה C-mount 2. מצלמות זהות עדיפות. ניתן להשתמש במצלמות דומות, אבל התאימות תלויה בחומרה פנימית, והכי חשוב חיישן CCD התמונה.
  3. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להציג תמונות משתי המצלמות. השלבים הבאים (2.3.1 - 2.3.4) יחולו על StreamPix 5 עם מודול SimulPix וצריכים להיות מותאמים לתוכנת הדמיה מרובה מצלמה אחרת.
    1. StreamPix פתוח 5 ובחר "סביבת עבודה" בסרט המשימה.
    2. "מנהל סביבת עבודה" פתוח הממוקם בקצה הימני של המסך, ובחר באפשרות "סביבת עבודה חדשה".
    3. לאחר מתן שם מצלמה, בצע את התוכנה תבקש ממך לבחור חוטף מרשימה מולאה מראש. בחר את חוטף דגם המצלמה התאמה ולחזור לסביבת העבודה של המצלמה השנייה. לסביבת העבודה הממוזגת, חוזרים פעם נוספת, אבל "כל המצלמות נמצאות בשימוש" מ 'שגיאהessage יופיע. הודעה זו היא נורמלית.
    4. ברגע שסביבת העבודה הממוזגת נטענת, להקצות מצלמות מסביבת העבודה וסביבת העבודה של 1 2 לסביבת העבודה הממוזגת בפנל העגינה הממוקם בצד הימני של מסך הצפייה.
  4. יישר מצלמות במערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה.
    1. יישר מצלמות בשדה בהיר או ניגוד שלב עם רשת הכיול המסופקת על ידי היצרן באמצעות מטרת PlanApo 40X (או יותר).
    2. שלח אור לעיניות המיקרוסקופ, הנח את רשת הכיול מצופה המתכת שסופקה על ידי היצרן על הבמה מיקרוסקופ, ולרבע את הרשת על הבמה מיקרוסקופ.
    3. להביא את הרשת אל מוקד.
    4. לעקור, אבל לא להסיר, דיור dichroic ליישר מצלמה 1 (עוקפת מצלמה). להציג את הרשת ללא binning וללא autoscaling. למקד את התמונה באמצעות חיוג התאמת התמקדות ביציאת C-Mount 1.
    5. דחוף את דיור dichroic לchanne הכפולמכשיר רכישת ליטר באופן מלא, כך שהתמונה מחולקת על ידי dichroic לשתי המצלמות.
    6. שחרר את שלושה 5/64 "להגדיר ברגים ולסובב את המצלמה השנייה על C-mount 2 הנקבה עד הנטייה של הרשת היא זהה בשתי התמונות. באמצעות חיוג התאמת דגש על C-mount נמל 2, להביא את התמונה ממצלמה 2 אל מוקד.
    7. לסיים את היישור באמצעות התמונה המשולבת בסביבת העבודה הממוזגת של תוכנת ההדמיה. זה מאפשר לראות שכבת pseudocolor זמן אמת של שתי התמונות של רשת הכיול. התאם את עמדות תמונה המשולבות רק באמצעות ידית R / L בצד ימין של DC2. התאם כפתור זה עד גבול אנכי ימין / שמאל של התמונות מיושרת במדויק.
    8. השתמש בכפתור U / D כדי להתאים את למעלה / למטה היישור של התמונה השנייה ועד לברי רשת אופקיים מיושרים כמו שצריך.
    9. אם במהלך למעלה / למטה יישור סיבוב מצלמה קל מתרחש בעיה, נכונה זו על ידי שחרור שלושה 5/64 scre אינץ "ws למצלמה 2 ולסובב עד שהתמונה המוצגות מיושרת כהלכה.

3. הכנת תאי הסרטן לפלייט במקביל תזרים לשכת הידבקות Assay

  1. 20-BT תאי סרטן שד תרבות במדיום המינימום הכרחי (MEM) בתוספת להשלמת בינונית עם 10% בסרום שור העובר (FBS) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין על 37 מעלות צלזיוס ו.5.0% CO 2 תיארו 2 כמו בעבר.
  2. תאים סרטניים קציר עם טיפול טריפסין לדלל ולספור תאים עם hemocytometer.
  3. לשטוף ולהשעות את התאים ב10 7 תאים / מיליליטר באלבומין 0.1% מסרום שור (BSA) בDPBS עם סידן ומגנזיום (DPBS +).
  4. מדולל נוגדנים ראשוניים, CD24 אנטי אנושי בעכבר וחולדה מטוהר מטוהרת HECA-452 (אנטיגנים אנטי sialofucosylated), לריכוז אופטימלי שנקבע מראש ב0.1% DPBS + BSA. דגירה תאים למשך 30 דקות 9, 10.
  5. תאי צנטריפוגה ב 1,200 סל"ד להשיג תא גלולה. ASPIלדרג נוגדן ראשוני, ולשטוף את התאים פעמיים עם 0.1% DBPS + BSA.
  6. מדולל נוגדנים משני, עז אנטי העכבר IgG AlexaFluor 568 (פליטת מקסימום, 603 ננומטר), ועז אנטי עכברוש IgM AlexaFluor 488 (פליטת מקסימום, 519 ננומטר), לריכוז אופטימלי שנקבע מראש ב0.1% DPBS + BSA. דגירה תאים למשך 30 דקות.
  7. שטוף תאי פעמיים ולהשעות ב0.1% DPBS + BSA ב10 6 תאים / מיליליטר ב0.1% DPBS + BSA.

4. הכנת התשתית לתגובתי פלייט במקביל תזרים לשכת הידבקות Assay

  1. חבר את שני אורכים נפרדים של צינורות ליציאות הכניסה ויציאה של זרימת צלחת התא המקביל שמתאים בתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. צינור אחד יתחבר למאגר של תאים שכותרתו תלויים ב0.1% DPBS + BSA והשני למשאבת המזרק, שייסוג נוזל בקצב זרימה שצוין.
  2. חבר קו ואקום לתא הזרימה 1.
  3. מקם את תא הזרימה מעל di תרבית רקמת 35 מ"מsh מכיל monolayer של תאי השחלה אוגר הסיני מביע E-selectin (CHO-E). תאי CHO-E היו גדלו במדיום שלם MEM ב 37 ° C ו-CO 2 .5.0% 2.
  4. התאם את תא הזרימה ו / או אטם תא זרימה כדי להבטיח חותם ואקום נאות 1.
  5. לסגת נוזל ממאגר, ניטור ההרכבה תא זרימה לחותם תקין ואין עדות חזותית של היווצרות בועת אוויר 1.
  6. הנח קאמרי הרכבה זרימה במיקרוסקופ (לייקה DMI 6000B) 1.

5. רכישת תמונה בשני צבעים

  1. כוח מקור לייקה EL-6000 אור הקומפקטי, או מכשיר דומה, כדי להפיק אור בעוצמה גבוה וזוג אותו לתוך ספר אור. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי להעביר את האור הזה דרך קוביית מסנן שילוב, כלומר קוביית מסנן G / R (ירוק / אדום), כדי לעורר fluorophores של צבע / עוצמה רצויה.
  2. הבטחת דיור dichroic נמצא במצב הפעלה נכון (מדוכא) והוא לא במצב עוקף.
  3. פועל מיקרוסקופ במצב הקרינה ובחר קובייה תקינה מסנן הקרינה (ירוק / אדום).
  4. קבע את זמן החשיפה ולהשיג במצלמת 1 (אדום; 620 ± 60 ננומטר) ומצלמת 2 (ירוק; 535 ± 40 ננומטר).
    1. לדכא את dichroic כדי להשיג תמונות בשני ערוצי הפליטה האדומים וירוקים. השתמש assay תא זרימה עם תאים שכותרתו עם fluorophore האדום בלבד, ולקבל תמונה במסלול האדום על ידי התאמת זמן החשיפה של המצלמה 1 ב" הגדרות חיות "של תוכנת ההדמיה.
    2. התאם את זמן החשיפה של מצלמה 2 לזמן החשיפה של המצלמה 1. אם תמונה שנצפתה בערוץ הירוק, חפצים לדמם דרכם בהווה ובזמן חשיפה בשתי המצלמות צריך להיות מופחת.
    3. שמירה על זמן החשיפה מקביל במצלמה 1 ומצלמת 2, לצמצם את זמן החשיפה עד החפץ לדמם דרך הוא כבר לא נראה לעין במסלול הירוק. התאם את הרווח של המצלמה 1 כדי לשפר visibilit תמונהy במסלול האדום במידת צורך.
    4. חזור על השלבים 5.4.1 - 5.4.3 עם תאים שכותרתו עם fluorophore הירוק בלבד, אך מגדיר את זמן חשיפה במצלמה 2 תאי תמונה במסלול הירוק בלי חפצים לדמם דרך במסלול האדום שנאסף על ידי מצלמה 1.
    5. נוגדני Retitrate אם לא ניתן למנוע חפצים לדמם דרך 11, או אם זמני חשיפה של מצלמה 1 ומצלמת 2 שונים באופן מהותי כך שהתמזגו תמונות עשויות להיות temporally מתואמים.
  5. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להציג תמונות שנתפסו בו זמנית משתי מצלמות CCD מונוכרום בניסוי תא זרימה.
  6. מיזוג תמונות שנאספו משני המצלמות משתמשים במודול SimulPix של Streampix 5 או חבילת תוכנה חלופית.
  7. השתמש בהתאמות תיקון דיגיטליות בSimulPix או תוכנה חלופית כדי ליישר מרחבית תמונות הממוזגות, במידת צורך. ניתן לתקן תמונות עם מודול SimulPix לאופקי, אנכי, והתאמות סיבוב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Assay הידבקות זרימת צלחת קאמרית במקביל היה בשימוש כדי להדגים מערכת כפולה פליטת המצלמה פיצול שבו זמנית נתפסה רצפי תמונה בזמן אמת בשני ערוצי פליטה (איור 1). מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה זוהתה 20-BT תאים שכותרתו fluorescently עם CD24 אנטי אנושי וHECA-452 (גילוי אנטיגנים sialofucosylated) נוגדנים חד שבטיים ונוגדנים משני מתאימים (איור 2). כמה תאים מתגלגלים מוצג אותות אדומים (CD24) עדיין בלתי ניתן לגילוי אותות ירוקים (HECA-452), אחרים מוצגים אותות ירוקים ואדומים לגילוי אותות, ובכל זאת תאים אחרים המוצגים שני אותות אדומים וירוק (איור 2). ערוצי פליטה התמזגו חשפו את ההפצה וcolocalization של CD24 ומולקולות sialofucosylated על פני השטח של 20-BT תאים מתגלגלים על והקפדה על monolayers CHO-E (איורים 3 ו -4). Spli פליטת המצלמה הכפולהמערכת tting במקור הייתה שגיאת יישור תמונה קלה עקב היישור של המצלמות, אבל השגיאה הזו תוקנה עם התאמות דיגיטליות (איור 5) באמצעות מודול SimulPix של StreamPix 5. בסך הכל, מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה יש הרזולוציה מרחבית, זמנית, ואופטית הדרושות כדי לחשוף את התכונות תאיות ומולקולרית ביישומים כגון מבחני הידבקות תא זרימה, שבו תאים לנוע במהירות בשדה הראייה.

איור 1
איור 1. איור של מערכת כפולה מצלמה פליטת פיצול לרכישת תמונות בassay זרימת צלחת קאמרית הידבקות מקבילה. משאבת מזרק משמש לינקבו תאים על פני מצע בזרימת צלחת הקאמרית המקבילה. מערכת הפיצול הכפולה פליטת מצלמה מחוברת למיקרוסקופ Epifluorescence הפוך משתמשת מ 'dichroicקוביות irror ומסנן לפצל ולסנן ערוצי פליטה לשתי מצלמות. מצלמות אלה ללכוד בו זמנית שני רצפי תמונה מרחבית זהים אבל fluorophore הספציפי. מחשב מצויד בתוכנת הדמיה מרובה מצלמה משמש למיזוג ורצפי תמונת שיא מכל ערוץ פליטה.

איור 2
איור 2. מערכת פיצול כפולה מצלמה פליטה שימשו הדמיה בו זמנית בזמן אמת של assay הידבקות תא זרימת צלחת מקביל. 20-BT תאים שכותרתו עם (1) CD24 אנטי אנושי ואנטי עכבר IgG AlexaFluor 568 (אדום, פליטת מקסימום pseudocolored, 603 ננומטר; מצלמה 1, 620 ± 60 ננומטר) ו (2) HECA-452 ואנטי עכברוש IgM AlexaFluor 488 (pseudocolored ננומטר 519 הירוק, מקסימום פליטה; מצלמת 2, 535 ± ננומטר 40) היו perfused מעל monolayer CHO-E בלחץ גזירה קיר = דיין 1/2 סנטימטר. מצלמה כפולה התמזגה iהמגים לחשוף הטרוגניות בתוך אוכלוסיית תאים מתגלגלת וניתן להשתמש בם כדי לאפיין התנהגויות מתגלגלות מבוססות על ביטוי של מולקולות פני השטח של תא. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. תמונה שנרכשה עם מטרת 10X.

איור 3
איור 3. רצף זמן של תמונות הממוזגות שנתפסו על ידי מערכת פיצול כפולה פליטת המצלמה מראה 20-BT תאים לבטא CD24 מולקולות (אדום pseudocolored) וsialofucosylated (pseudocolored ירוקות) מתגלגל על monolayer CHO-E בלחץ גזירה קיר = דיין 1/2 סנטימטר. מצלמות נשמרו הרזולוציה האופטית ובזמן כדי לעקוב אחר תכונות תא בתא הנופל "מקצה אל קצה", כפי שהתגלגל על ​​המצע תגובתי בכיוון הזרימה. חצים לבנים מצביעים אשכול מעקב של מולקולות פני השטח של תא. אותות פליטה בכל ערוץ היו pseudocolored והתמזגו בiתוכנת maging. שים לב שאותות colocalized מופיעים צהובים / כתום. תמונות סטילס יוצאו מרצפי תמונה בזמן אמת בנקודות זמן שמוצגים. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. תמונות שנרכשו עם מטרת 40X.

איור 4
איור 4. מערכת פיצול פליטת מצלמה כפולה חושפת colocalization של CD24 (pseudocolored אדום) ומולקולות sialofucosylated (pseudocolored ירוק) שהביעו נציג 20-BT תאי סרטן השד מתגלגלים על monolayer CHO-E. ביטוי הטרוגניות של () CD24 ו (ב) sialofucosylated מולקולות על פני התא מודגש בכל תמונה. (C) colocalization של מולקולות נראה צהוב / כתום pseudocolored כתמים כאשר ערוצי פליטת pseudocolored אדומים וירוקים מתמזגים. קוטר תא הוא כ 10 מיקרומטר. wi תמונות שנרכשה אובייקטיבית 40X.

איור 5
5.Adjustments איור להגדרות המרחבית אופקיים, אנכיות וסיבוביות של תמונות שנתפסו במצלמה 1 ומצלמת 2 יכול לשפר את היישור המרחבי בתמונה הממוזגת. יישור נכון הוא קריטי כדי לתאר במדויק כיצד תאים דבקים ומתגלגלים בassay ההידבקות . (א) תמונה הממוזגת של 20-BT תא בודד מתואמת בשל מיקום מצלמה. (ב) יישור מרחבית משופר עם התאמות תוכנה במודול SimulPix של StreamPix 5. (C) התאמות תוכנה נוספות להשיג יישור כמעט מושלם. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר. תמונות שנרכשו עם מטרת 40X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה יש הרזולוציה מרחבית, זמנית, ואופטית הדרושות כדי ללכוד תמונות באיכות גבוהות ביישומים שבם תא או תנועה מולקולרית הוא מהיר. ביצירת תוצאות הנציג, פרמטרים במערכת הכפולה פליטת המצלמה הפיצול, כולל הגדרות תוכנה והגדרות מצלמה, היו מותאמים כדי להשיג רצף תמונה ממוזג שבו מתגלגל ותאים חסיד היו מרחב ובזמן מיושר. צעד אופטימיזציה זו הוא קריטי, כמו חוסר יכול לגרום לתמונות שלא להעביר כראוי את התופעה הפיסית תחת חקירה, למשל תא בודד שנצפה לגלגל בשני הערוצים הירוקים ואדום יכול להופיע כשני תאים מתגלגלים בסביבת העבודה הממוזגת. יישור המרחבי צריך להיות מושגת בהתקנה של מערכת פיצול הכפולה המצלמה פליטה כאשר מצלמות פיזית מיושרות כמתואר בשלב 2.4 של הפרוטוקול. תיקונים דיגיטליים ליישור המרחבי של קפטן תמונותured ידי המצלמות יכולה להיות מיושם לאופקי, אנכי, או לקזז סיבוב (ים) דרך הגדרות יישור דיגיטליות בתוכנת ההדמיה (שלב 5.7 ואיור 5).

יישור זמני בין התמונות שנתפסו על ידי מצלמה 1 ומצלמת 2 יכול להיות מושגת על ידי התאמה "הגדרות חיות" של המצלמות: זמן חשיפה, אופסט, ורווח. רווח לקזז יכול להיות מותאם מבלי להשפיע על היישור הזמני של התמונות הממוזגות, אך סטיות בזמן חשיפה מוגדרת על ידי המשתמש בין מצלמות יכולות לגרום לחוסר תיאום. לכן רווח יכול להיות מותאם כדי לפצות על הבדלים בין זמני חשיפה המשמשים לאיסוף תמונות בכל מצלמה. באופן אידיאלי, יש לאפשר הבדלים בזמן החשיפה בין מצלמות רק כאשר התאמות רווח מופיעות להתפשר על איכות תמונה באופן משמעותי. לחלופין, ניתן לבצע ניסויי טיטרציה הנוגדן כדי לייעל את תיוג תא כדי לפצות על הבדלים בזמן חשיפה הנדרשים על ידי כל מצלמה (א) בשל מאפיינים הגלומים בכל fluorophore או (ב), בשל הבדלים ברמות הביטוי המולקולריים זוהו על ידי כל נוגדן / fluorophore. עם זאת, זה צריך להיות גם ציין כי ניסויי טיטרציה הנוגדנים הם שיטת העבודה מומלצת כדי למנוע חפצים לדמם דרך (צעד 5.4.5) 11.

למרות שמערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה שימשה לתמונה בו זמנית שתי מולקולות מטרה בערוצי פליטה נפרדות, טכנולוגיות חלופיות מסוגלים ללכוד תמונות בו זמנית בערוצי פליטה מרובים. מערכות הדמיה אלה נעים בין מצלמות בודדות צבע למיקרוסקופי confocal, וכל אחד יש יתרונות וחסרונות ביחס לאיכות תמונה, מהירות, ותעלינה 12-17. בפרט, מיקרוסקופים confocal סריקת לייזר המדינה-of-the-art המשלבים סורקי תהודה הם מערכות הדמיה רבת רפאים מרשימות מסוגלת לרכוש תמונות במאות פריימים לשניה. מערכות confocal אלה הן חזקות מאוד,אבל העלות שלהם עלולה להגביל את מספר החוקרים שיש להם גישה למערכות אלו באמצעות מתקני גרעין. סופו של דבר, לצרכים ולמשאבים המחקריים של כל תכתיב מעבדה שמערכת הדמיה רב ערוצים היא מתאימה ביותר.

השיטות שתוארו במסמך זה להסביר כיצד ניתן להשיג רצפי תמונה בזמן אמת בשני ערוצי פליטה באמצעות מערכת כפולה מצלמה פליטת פיצול ותוכנת הדמיה. יישור מרחב ובזמן של תמונות שנתפסו בשני ערוצי פליטה על ידי מצלמות דומות CCD מונוכרום הוא חיוני לייצור של רצפי תמונה התמזגה בזמן אמת באיכות גבוהה שבו זמנית לחשוף את מולקולות מטרה מרובות בתאים. יישומים עבור מערכת הפיצול הכפולה המצלמה הפליטה כוללים כל ניתוח תא חי בשני צבעים שדורש פתרון יוצא דופן אופטית וזמני של שדה מלא של נוף, כגון זרימת מבחני, טרנסלוקציה של מולקולות בתא שטח, שיפוץ cytoskeletal, תחבורת ועי, וחלקיקי 3D מעקב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לד"ר דאגלס גץ (מחלקה להנדסת כימית Biomolecular, אוניברסיטת אוהיו) וד"ר פביאן Benencia (מחלקה למדעים ביו, אוניברסיטת אוהיו) לדיונים מעמיקים וביקורת כתב יד. כמו כן אנו מודים לד"ר כריסטופר Huppenbauer לדיונים מועילים טכניים (W. Nuhsbaum Inc). עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (CBET-1,106,118) והמכונים הלאומיים לבריאות (1R15CA161830-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (9), e44529 (2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283, (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406, (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2, (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384, (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22, (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2, (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112, (4), 1091-1100 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics