Одновременно Захват изображения в реальном времени в двух выбросов каналов Использование Разделение системы двойной камеры выбросов: Заявки на клеточной адгезии

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Двойная камера выбросов системы расщепления для двухцветной флуоресцентной микроскопии генерировать в реальном времени последовательности изображений с исключительной оптической и временным разрешением, требования некоторых живых клеток анализов в том числе параллельных Проточная камера пластина адгезии анализов. Когда программное обеспечение используется для объединения изображений с одновременно приобретенных каналов выбросов, псевдоцветной последовательности изображений производятся.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Многоцветный иммунофлюоресценции микроскопии для обнаружения специфических молекул в мембране клетки могут быть связаны с параллельными камерных поток пластина анализов для исследования механизмов, регулирующих клеточную адгезию в динамических условиях потока. Например, раковые клетки, меченные нескольких флуорофорами можно перфузии над потенциально реактивной субстрат для моделирования механизмов раковых метастаз. Тем не менее, многоканальные системы одной камеры и цветные камеры проявляют недостатки в получения изображений для анализа в реальном времени живых клеток. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы использовали двойной камеры выбросов систему расщепления одновременно захватить в режиме реального времени изображения последовательности флюоресцентно меченых клеток в камере потока. Выбросов системы расщепления двойной камеры фильтр определен диапазонов длин волн на две монохромный ПЗС-камер, тем самым одновременно захватив два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных изображений. Впоследствии psuedocolored изображения одноканальные объединены в одинв режиме реального времени последовательность, которая может выявить несколько молекул-мишеней на клетки быстро движется по интересующей области объединены.

Introduction

Методы анализа молекул на поверхности клеток, таких как иммунным окрашиванием, использовать зонды, которые химически конъюгированных с флуорофоров, что позволяет обнаруживать молекул-мишеней. Живая клетка изображений и гидродинамического потока на основе клеточной адгезии анализы обычно записываются с монохромными ПЗС-камер, предназначенных для захвата физиологические процессы на клеточном и / или молекулярном уровне 1, 2. Эти камеры обладают высокой чувствительностью, доставить высокую частоту кадров (более 30 кадров в секунду), и обеспечивают исключительную временное разрешение (в связи с высокой частотой смены кадров и коротким временем воздействия). Тем не менее, черно-белых камер можно только захватить один канал эмиссии (обнаружения одного флуорофора) для сбора изображений. Холост системы расщепления выбросов камера может быть включена, чтобы захватить несколько каналов выбросов, но часто уменьшить поле зрения и требуют такого же времени экспозиции для визуализации всех каналов. Для захвата полный цветовой спектр из клеток, меченных MULTIPле флуорофоры, цветная камера может использоваться в качестве альтернативы. Тем не менее, цветные камеры обычно не способны обеспечить требуемую временное разрешение для живого изображения клетки в определенных приложениях. Другое устройство формирования изображения необходим для приложений, в которых целесообразно изображений живых клеток на множественных длинах волн, сохраняя высокое временное разрешение. Ярким экспериментальный приложение является параллельной проточной камеры пластина адгезия анализ, в котором клетки перфузии в физиологически соответствующих условий в течение потенциально реакционноспособного подложки 1, 3. Клетки, которые экспрессируют потока специфические молекулы клеточной поверхности могут прилипать и рулон на подложке, такой как клеточный монослой экспрессии молекул адгезии или поверхностно-адсорбированный белки внеклеточного матрикса 4, 5. Прокатные клетки могут пройти вращения и поступательное движение в доли секунды. Молекулярные особенности на прокатки и адгезивных клеток, таких как кластеры молекул клеточной поверхности, также имеют потенциометраль пройти активное реорганизации на поверхности клетки. Таким образом, системы визуализации должны предоставить исключительное временное разрешение (30 кадров в секунду или более и "около нуля" время экспозиции) для создания последовательности изображений, которая иллюстрирует шаг за шагом прогрессирование клеток прокатки 6, 7. Системы расщепления выбросов Двойная камера способна удовлетворить эти требования для работы с изображениями клетки помечены с несколькими флуорофорами.

Системы расщепления выбросов Двойная камера разделена и флуоресценции фильтр каналов в двух аналогичных камер одновременно захватить два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных изображений, сохраняя при этом полный обзор. Эта технология позволяет прямое сравнение изображения, снятого в режиме реального времени в каждом канале и позволяет пользователю быстро переключаться между моделями камер с различными возможностями визуализации. Эта функция полезна для внесения изменений в настройки захвата изображения в одной камере, что лучше позволить системе, чтобы захватитьфлуорофоры с разной интенсивностью, жизни и коэффициентов экстинкции 8. В сочетании с ПО для обработки изображений, двойные выбросов системы расщепления камеры позволяют в режиме реального времени записи живых анализов изображений клеток в нескольких длинах волн и может повысить анализов в пробирке, которые используют флуоресценцию изучать поведение клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Установка программного обеспечения

  1. Покупка StreamPix 5 программное обеспечение Multi-Camera с модулем SimulPix или другого ПО для обработки изображений, способной сбора и объединения изображений, полученных монохромный ПЗС-камер.
  2. Минимальные требования к StreamPix 5 включают в себя: ПК, оснащенный Core 2 Duo с частотой 2,4 ГГц или лучше с 2 Гб оперативной памяти или выше. Поддерживается IEEE цифровой или аналоговой камеры и совместимо захвата кадров. Окна XP/7/Vista 32 или 64 бит. Монитор с поддержкой разрешения 1024 х 768 или выше. Графический адаптер с хорошим 2D производительности (OCU выразить 16x или выше рекомендуется) и 7200 оборотов в минуту жесткий диск для записи с конфигурацией RAID-вывода.

2. Установка двойной системой камера, способная двухцветный Одновременная реального времени изображений

  1. Подключите сплиттер DC2 Фотометрия выбросов, или подобный расщепления выбросов двойная камера устройства, к микроскопом, сдвинув адаптер DC2 C-Mount в видео порту микрoscope таким образом, что корпус из дихроичного на устройстве доступен.
  2. Вставьте две монохромный ПЗС камеры в женской C-Mount 1 и женщина С-крепление 2. Идентичные камеры являются предпочтительными. Подобные камеры могут быть использованы, но совместимость зависит от внутренней аппаратных средств, что наиболее важно матрицы ПЗС.
  3. Используйте для обработки изображений для отображения изображения с обеих камер. Следующие шаги (2.3.1 - 2.3.4) применяются к StreamPix 5 с модулем SimulPix и должны быть адаптированы для других программ визуализации нескольких камер.
    1. Открыть StreamPix 5 и выберите пункт "рабочее пространство" на ленте задач.
    2. Открыть "Workspace Manager" расположен в правой части экрана и выберите пункт "новое рабочее пространство".
    3. После присвоения камеру, следуйте программа предложит выбрать граббер от предварительно населенном списка. Выберите граббер, соответствующую модель камеры и повторите для второго камеры рабочего пространства. Для объединенной рабочей области еще раз повторить, но "все камеры находятся в использовании" ошибка мessage появится. Это сообщение является нормальным.
    4. После того, как объединенная рабочая загружается, назначить камеры от рабочей области 1 и рабочей области 2 к объединенной рабочей в док-панели, расположенной на правой стороне экрана просмотра.
  4. Совместите камеры в двойной камеры выбросов системы расщепления.
    1. Совместите камеры в светлом поле или фазового контраста с калибровочной сетки, представленной изготовителем с использованием цели Planapo 40X (или больше).
    2. Отправить свет микроскопа окуляров, поместите металлическую покрытием калибровочной сетки, которая была предоставлена ​​производителем на столик микроскопа и квадрат сетки на столик микроскопа.
    3. Принесите сетку в фокусе.
    4. Свернуть, но не снимайте, дихроичного жилье для выравнивания камеры 1 (байпас камеры). Отобразите сетку без биннинга и без авто-масштабирования. Сфокусируйтесь на изображении с помощью регулировки фокуса диск на С-горе порта 1.
    5. Нажмите дихроичное жилье в двойной каналл приобретение устройство полностью, так что изображение делится на дихроичного в обеих камерах.
    6. Ослабить три 5/64 "установочные винты и повернуть второй камеры на женской C-Mount 2 до тех пор, ориентация сетки не идентичен в обоих изображений. Использование регулировки фокуса диск на C-Mount порт 2, довести изображение с камеры 2 в фокус.
    7. Завершение выравнивание с использованием комбинированного изображения в объединенной рабочей области обработки изображений. Это позволяет видеть в режиме реального времени псевдо наложения двух изображений калибровочной сетки. Регулировка объединенные положение изображения, используя только R / L ручку на правой стороне DC2. Отрегулируйте этот регулятор, пока правая / левая вертикальная граница изображений не точно выровнены.
    8. Используйте U / D регулятором вверх / вниз выравнивание втором изображении, пока турники сетки не были должным образом увязаны.
    9. Если во время вверх / вниз выравнивания небольшое вращение камеры происходит, правильно этот вопрос, ослабив три 5/64 "дюймовые ScreWS для камеры 2 и вращать, пока изображение на экране не будет выровнен.

3. Подготовка раковых клеток для параллельных пластин проточной камеры адгезии Пробирной

  1. Культура BT-20 клетки рака молочной железы в минимальной необходимой среде (MEM), дополненной в полной среде с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина при 37 ° С и 5,0% CO 2, как описано выше 2.
  2. Урожай раковые клетки с обработкой разбавленной трипсина и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.
  3. Мытье и приостановить клеток в 10 7 клеток / мл в 0,1% альбумина бычьей сыворотки из (BSA) в DPBS с кальцием и магнием (DPBS +).
  4. Развести первичных антител, очищенного мышиного антитела против человеческого CD24 и очищают крысы HECA-452 (анти-sialofucosylated антигены), до заданной оптимальной концентрации в 0,1% BSA DPBS +. Инкубируйте клетки в течение 30 мин 9, 10.
  5. Центрифуга клетки при 1200 оборотах в минуту, чтобы получить осадок клеток. Аспиоценить первичное антитело, и мыть клетки дважды с 0,1% BSA ППД +.
  6. Развести вторичные антитела, антимышиного IgG AlexaFluor 568 (эмиссия макс, 603 нм), а также козы против крыс IgM AlexaFluor 488 (эмиссия макс, 519 нм), с заданной оптимальной концентрации в 0,1% BSA DPBS +. Инкубируйте клетки в течение 30 мин.
  7. Вымойте клетки дважды и приостановить в 0,1% BSA DPBS + на 10 6 клеток / мл в 0,1% BSA DPBS +.

4. Подготовка реактивной субстрата для параллельных пластин проточной камеры адгезии Пробирной

  1. Соединение двух отдельных отрезков трубы с входным и выходным портами камеры параллельного потока пластина, которая соответствует внутри 35 мм блюдо культуры ткани. Один труба соединяется с резервуаром меченых клеток, суспендированных в 0,1% BSA DPBS +, а другой шприцевой насос, который будет удалени жидкости с заданной скоростью потока.
  2. Подключите вакуумную линию к проточной камеры 1.
  3. Расположите проточную камеру над 35 мм культуры ткани диш содержащие монослой клеток яичника китайского хомячка, выразив E-селектин (СНО-E). CHO-E клетки выращивали в полной среде MEM при 37 ° С и 5,0% CO 2 2.
  4. Отрегулируйте проточную камеру и / или проточной камеры прокладку для обеспечения адекватного вакуумное уплотнение 1.
  5. Вывод жидкости из резервуара, мониторинг проточной камеры в сборе для надлежащего уплотнения и без визуального доказательства формирования пузырьков воздуха 1.
  6. Наведите камеру сборку потока на микроскопе (Leica DMI 6000B) 1.

5. Двухцветный Приобретение изображения

  1. Мощность Leica EL-6000 источник компактный свет, или аналогичное устройство, генерировать света высокой интенсивности и пару его в световод. Используйте инвертированного микроскопа, чтобы пройти этот свет через комбинированный фильтр куба, то есть G / R (зеленый / красный) фильтр куба, чтобы возбудить флуорофоры желательного цвета / интенсивности.
  2. Убедитесь дихроичное жилья находится в правильном рабочем положении (депрессии) ине находится в режиме байпаса.
  3. Эксплуатация микроскопа в режиме флуоресценции и выберите правильный куб флуоресценции фильтра (зеленый / красный).
  4. Определить время экспозиции и усиления в камеры 1 (красный; 620 ± 60 нм) и камера 2 (зеленый; 535 ± 40 нм).
    1. Нажмите Дихроичное для получения изображения как в красных и зеленых каналов выбросов. Используйте камеру поток анализа с клетками, меченных только красной флуорофором, и получить изображение в красном канале, регулируя время экспозиции камеры 1 в "живых настройки" программного обеспечения визуализации.
    2. Подходим время экспозиции камеры 2 к времени экспозиции камеры 1. Если изображение наблюдается в зеленом канале, проступание артефакты присутствуют и время экспозиции в обеих камер необходимо уменьшить.
    3. Ведение время экспозиции эквивалент в камеру 1 и камеры 2, не уменьшить время экспозиции до проступание артефакт больше не видно в зеленом канале. Отрегулируйте усиление камеры 1 для улучшения изображения visibilitу в красном канале в случае необходимости.
    4. Повторите шаги 5.4.1 - 5.4.3 с клетками, меченных только зеленой флуорофором, но определить время экспозиции с камерой 2 для изображения клеток в зеленом канале без проступание артефактов в красном канале, собранной камеры 1.
    5. Retitrate антитела, если проступание артефакты не могут быть устранены 11, или если время экспозиции из камеры 1 и камеры 2 существенно отличаются, так что объединены изображения могут быть временно смещена.
  5. Используйте для обработки изображений для просмотра изображений одновременно захваченных из двух монохромный ПЗС-камер в эксперименте камеры поток.
  6. Слияние изображений собранных с обеих камер, использующих модуль SimulPix из Streampix 5 или альтернативного пакета программного обеспечения.
  7. Используйте цифровые коррективы коррекции в SimulPix или альтернативного программного обеспечения для пространственного выравнивания объединенные изображения, если это необходимо. Изображения могут быть исправлены с помощью модуля SimulPix для горизонтальных, вертикальныхи вращательные корректировки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Параллельный Проточная камера пластины сцепления анализ использовали для демонстрации двойную выбросов камера системы расщепления, что одновременно захваченное изображение последовательности в режиме реального времени в двух каналах выбросов (рис. 1). Двойная камера выбросов система расщепления обнаружены BT-20 клетки, которые были флуоресцентно меченных анти-CD24 человека и HECA-452 (обнаружения sialofucosylated антигены) моноклональных антител и соответствующих вторичных антител (рис. 2). Некоторые прокатные клетки отображается красные сигналы (CD24) но необнаруживаемые зеленые сигналы (HECA-452), другие отображается зеленые сигналы и обнаружить красные сигналы, и все же другие клетки отображается как красный и зеленый сигналы (рис. 2). Объединенные каналы выбросов показал распределение и колокализации CD24 и sialofucosylated молекул на поверхности BT-20 ячеек (4 рисунках 3 и) катание на и придерживаясь СНО-E монослоев. Двойственная spli выбросов камерыСистема Приступая первоначально был небольшой изображения ошибку выравнивания за счет выравнивания камер, но эта ошибка была исправлена ​​с цифровыми корректировок (рис. 5) с помощью модуля SimulPix из StreamPix 5. В целом, двойная камера выбросов система расщепления имеет пространственное, временное, и оптическое разрешение, необходимое для выявления клеточных и молекулярных особенностей в таких приложениях, как камеры поток адгезии анализов, в которых клетки быстро перемещаются через поле зрения.

Рисунок 1
Рисунок 1. Иллюстрация двойной камеры выбросов расщепления системы получения изображений в параллельной проточной камеры пластины сцепления анализа. Шприцевой насос используется для заливать клетки над подложкой в камере параллельного потока пластина. Двойственная выбросов камеры системы расщепления подключен к перевернутой эпифлуоресцентной микроскопом использует дихроичное мirror и фильтр кубики Сплит и фильтровать каналы выбросов в двух камер. Эти камеры одновременно захватить два пространственно одинаковые, но флуорофорные конкретных последовательностей изображений. Компьютер, оборудованный для обработки изображений нескольких камер используется для объединения и записывать последовательности изображений из каждого канала эмиссии.

Рисунок 2
Рисунок 2. Двойная камера выбросов система расщепления был использован в режиме реального времени одновременно визуализации параллельной камеры поток пластины сцепления анализа. BT-20 клетки, меченные (1) против человеческого CD24 и анти-мыши IgG AlexaFluor 568 (псевдоцветной красный, выбросов макс, 603 нм; камера 1, 620 ± 60 нм) и (2) HECA-452 и анти-IgM крысы AlexaFluor 488 (псевдоцветной зеленый, макс излучение 519 нм; камера 2, 535 ± 40 нм) перфузии в течение CHO-E монослоя на напряжения сдвига стенки = 1 дин / см 2. Двойная камера объединены Iмаги показывают гетерогенность в пределах прокатного популяции клеток и могут быть использованы для характеристики поведения прокатки на основе экспрессии молекул клеточной поверхности. Шкала бар = 100 мкм. Изображение приобрел с целью 10X.

Рисунок 3
Рисунок 3. Временная последовательность объединенных изображений, захваченных двойной эмиссии камера расщепления системы показывая BT-20 клеток, экспрессирующих CD24 (псевдоцветной красный) и sialofucosylated молекулы (псевдоцветной зеленый) катание на СНО-E монослоя на напряжения сдвига стенки = 1 дин / см 2. Камеры поддерживают оптическую и временное разрешение для отслеживания особенностей клеток на ячейку барабанном "конец над концом", как его проката на реактивном подложки в направлении потока. Белые стрелки указывают на гусеничный кластер молекул клеточной поверхности. Сигналы выбросов в каждом канале были псевдоцветной и объединены в Imaging программного обеспечения. Обратите внимание, что локализуется сигналы появляются желтый / оранжевый. Стоп-кадры были экспортированы из последовательности изображений в режиме реального времени в моменты времени показано на рисунке. Шкала бар = 10 мкм. Изображения, полученные с целью 40Х.

Рисунок 4
Рисунок 4. Система расщепления выбросов Двойная камера показывает колокализации CD24 (псевдоцветной красный) и sialofucosylated молекулы (псевдоцветной зеленый), выраженные представителем BT-20 клеток рака молочной железы подвижного на СНО-E монослоя. Гетерогенных экспрессия (A) CD24 и (B) sialofucosylated молекулы на поверхности клетки подчеркивается в каждом изображении. (С) колокализации молекул появляется как желтый / оранжевый псевдоцветной пятна, когда красные и зеленые псевдоцветной каналы выбросов объединяются. Диаметр Сотовый составляет около 10 мкм. Изображения приобрела шго на цели 40X.

Рисунок 5
Фигура 5.Adjustments в горизонтальных, вертикальных и вращательных пространственных параметрах изображения, снятые камерой 1 и камеры 2 может улучшить пространственное выравнивание в объединенном изображении. Правильное выравнивание имеет решающее значение для точно изобразить как клетки придерживаются и прокатки в адгезии анализа . (А) объединенный образ одной BT-20 ячейки смещаются под позиционирования камеры. (В) Пространственное выравнивание улучшается с корректировками программного обеспечения в модуле SimulPix из StreamPix 5. (С) Дальнейшие корректировки программного обеспечения достичь почти идеального выравнивания. Шкала бар = 2 мкм. Изображения, полученные с целью 40Х.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Двойная камера выбросов система расщепления имеет пространственное, временное, и оптическое разрешение, необходимое для захвата изображений высокого качества в приложениях, где клетки или молекулярный движение быстро. В генерации репрезентативные результаты, параметры в двойной эмиссии камера расщепления системы, в том числе программных настроек и настроек фотокамеры, были оптимизированы, чтобы получить объединенный последовательность изображений, в которых прокатки и прилипшие клетки в пространстве и времени выровнены. Этот шаг оптимизация имеет решающее значение, так как смещение может привести к изображениям, которые не должным образом доводят физическое явление под следствием, например одна ячейка наблюдается катиться как в зеленых и красных каналов может появиться в виде двух прокатных клеток в объединенной рабочей области. Пространственное выравнивание должно быть достигнуто в установке двойного камеры выбросов системы расщепления, когда камеры физически выравнивается так, как описано в шаге 2.4 протокола. Цифровые поправки к пространственной выравнивания изображений КапUred камерами могут быть применены для горизонтальных, вертикальных или вращения смещения (ы) с помощью цифровых параметры выравнивания в ПО для обработки изображений (шаг 5.7 и рисунок 5).

Временное выравнивание между изображений, захваченных камерой 1 и камеры 2 может быть достигнуто путем корректировки "живые настройки" из камер: Время выдержки, смещение и усиление. Значения можно отрегулировать, не влияя на временную выравнивание присоединяемых изображений, но отклонения в определенной пользователем времени экспозиции между камерами может привести к несоосности. Таким образом прибыль может быть скорректирована для компенсации разницы между временем экспозиции, используемых для сбора фотографий в каждой камеры. В идеале, различия во времени экспозиции между камерами должно быть разрешено только тогда, когда корректировки усиления по всей видимости, значительно угрозу качество изображения. Кроме того, антитела титрования эксперименты могут быть выполнены, чтобы оптимизировать маркировки клеток для компенсации разницы в времени экспозиции, необходимых каждой камеры (а) в связи с присущими свойствами каждого флуорофора или (б) в связи с различиями в уровнях молекулярных экспрессии обнаруженных каждым антител / флуорофором. Однако, это также следует отметить, что антитела титрования эксперименты лучшей практики для предотвращения проступание артефакты (этап 5.4.5) 11.

Хотя двойная камера выбросов система расщепления использовали одновременно изображение двух молекул-мишеней в отдельных каналах выбросов, альтернативные технологии способны одновременно захватывать изображения в нескольких каналах выбросов. Эти системы визуализации диапазоне от одной цветных камер в конфокальной микроскопов, и каждый из них имеет свои преимущества и недостатки по отношению к качеству изображения, скорости, и стоить 12-17. В частности, государство-оф-арт-лазерной сканирующей конфокальной микроскопы, которые включают резонансные сканеры впечатляющие системы многоспектральная визуализации, способные принимать изображения в сотни кадров в секунду. Эти конфокальные системы чрезвычайно мощный,но их стоимость может ограничить количество исследователей, которые имеют доступ к этим системам через основных средств. В конечном счете, исследуемые потребностей и ресурсов каждой лаборатории диктата, который система визуализации многоканальный наиболее подходящий.

Описанные здесь способы объяснить, как получить последовательности изображений в режиме реального времени в двух каналах выбросов с использованием двойной камеры выбросов систему расщепления и обработки изображений. Пространственное и временное выравнивание изображений, полученных в двух каналах выбросов подобными монохромный ПЗС-камер имеет важное значение для производства высококачественных реального времени объединены последовательности изображений, которые одновременно показывают несколько молекул-мишеней на клетки. Заявки на двойной камеры выбросов системы расщепления включать в себя любое двухцветную анализ живых клеток, что требует исключительного оптического и временное разрешение полного поля зрения, например, анализов потока, транслокации молекул клеточной поверхности, цитоскелета ремонт, везикулярного транспорта и 3D частицы отслеживание.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Дугласа Гетц (кафедры химической и биомолекулярных инженерия, Университет Огайо) и д-р Фабиан Benencia (отдел медико-биологических наук, Университет Огайо) для проницательных дискуссий и рецензированию рукописей. Мы также благодарим доктора Кристофера Huppenbauer за полезные обсуждения технических вопросов (У. Nuhsbaum Inc.) Эта работа была поддержана грантами от Национального научного фонда (CBet-1106118) и Национального института здоровья (1R15CA161830-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (9), e44529 (2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283, (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406, (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2, (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384, (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22, (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2, (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112, (4), 1091-1100 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics