Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Bioengineering

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Summary

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

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Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

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Abstract

Multi-Color-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, um bestimmte Moleküle in der Zellmembran erkennen kann, mit Parallelplattenlaufkammer Assays zu Mechanismen, die Zell-Adhäsion unter dynamischen Strömungsbedingungen zu untersuchen gekoppelt werden. Beispielsweise können Krebszellen mit mehreren Fluorophoren über eine möglicherweise reaktive Substrat zu modellieren Mechanismen der Krebsmetastasierung perfundiert werden. Allerdings, Multi-Channel einzelnen Kamera-Systeme und Farbkameras zeigen Mängel in der Bildaufnahme für die Echtzeit-Live-Zellanalyse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem verwendeten wir gleichzeitig erfassen Echtzeit-Bildsequenzen von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusskammer. Dual-Kamera-Systeme Emissionsspaltfilter definierten Wellenlängenbereichen in zwei monochrome CCD-Kameras, wodurch gleichzeitig erfassen zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifische Bilder. Anschließend werden psuedocolored Ein-Kanal-Bilder in einer einzigen kombiniertenEchtzeit-Sequenz zusammengeführt, die mehrere Zielmoleküle auf Zellen, die sich schnell über einen Bereich von Interesse offenbaren kann.

Introduction

Verfahren zur Analyse von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie z. B. Immunfärbung Sonden einzusetzen, die chemisch mit Fluorophoren konjugiert sind, was den Nachweis von Zielmolekülen. Live-Cell-Imaging-und hydrodynamischen Fluss-basierte Zelladhäsionsassays werden typischerweise mit monochromen CCD-Kameras entwickelt, um physiologische Prozesse auf zellulärer und / oder molekularer Ebene 1, 2 erfassen aufgezeichnet. Diese Kameras sind sehr empfindlich, liefern schnelle Bildraten (mehr als 30 Bilder pro Sekunde) und bieten außergewöhnliche zeitliche Auflösung (durch schnelle Bildraten und kurzen Belichtungszeiten). Allerdings kann nur Monochrom-Kameras erfassen einen einzigen Emissionskanal (Erfassung eines einzelnen Fluorophors), um Bilder zu sammeln. Einzelne Kamera Emissions Splitting-Systeme können integriert werden, um mehrere Emissionskanäle zu erfassen, aber oft reduzieren das Sichtfeld und benötigen die gleiche Belichtungszeit für die Abbildung aller Kanäle. Um das volle Farbspektrum von Zellen mit multip beschriftet erfassenle Fluorophore, eine Farbkamera kann als Alternative verwendet werden. Allerdings sind Farbkameras in der Regel nicht in der Lage, die für Live-Cell-Imaging in bestimmten Anwendungen gewünschten zeitlichen Auflösung. Eine weitere bildgebende Gerät ist für Anwendungen, bei denen es vorteilhaft ist, Bild lebenden Zellen bei mehreren Wellenlängen ist, unter Beibehaltung einer hohen zeitlichen Auflösung benötigt. Ein Hauptanwendungsgebiet ist die experimentelle Parallelplattenflusskammer Adhäsionstest, in denen Zellen in physiologisch relevanten Bedingungen über einen potentiell reaktive Substrat 1, 3 perfundiert. Zellen, die in Strömungs spezifische Zelloberflächenmoleküle exprimieren, haften und rollen auf dem Substrat, beispielsweise eine Zell-Monoschicht exprimieren Adhäsionsmoleküle oder Oberfläche adsorbiert extrazelluläre Matrixproteine, 4, 5. Rollzellen können Rotations-und Translationsbewegung in Bruchteilen einer Sekunde durchlaufen. Molekularen Eigenschaften auf Walzen und adhärente Zellen, wie Cluster von Zelloberflächenmolekülen, auch die Potentiometeral aktive Reorganisation auf der Zelloberfläche zu unterziehen. Somit muß Abbildungssysteme eine außergewöhnliche zeitliche Auflösung liefern (30 Frames pro Sekunde oder mehr und "nahe Null" Belichtungszeiten), um eine Bildfolge, die die Schritt-für-Schritt-Fortschreiten der Zelle Walzen 6, 7 veranschaulicht zu erzeugen. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme sind in der Lage, diese Anforderungen zu erfüllen für die Bildgebung von Zellen mit mehreren Fluorophoren markiert.

Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme aufgeteilt und Filterfluoreszenzkanäle in zwei ähnliche Kameras erfassen gleichzeitig zwei räumlich identisch, aber Fluorophor spezifische Bilder unter Beibehaltung der vollen Sichtfeld. Diese Technologie ermöglicht den direkten Vergleich der in Echtzeit in jedem Kanal aufgenommene Bild und ermöglicht dem Benutzer, schnell zwischen Kamera-Modelle wechseln mit verschiedenen Imaging-Funktionen. Diese Funktion ist nützlich, um Einstellungen für Bild-Capture-Einstellungen in eine Kamera, die besser damit das System zu erfassenFluorophore mit unterschiedlichen Intensitäten, Gültigkeitsdauer und Extinktionskoeffizienten 8. Gekoppelt mit Imaging-Software, Dual-Kamera-Emissionsspalt Systeme ermöglichen die Echtzeit-Aufzeichnung von Live-Cell-Imaging-Tests in mehreren Wellenlängen und kann in vitro-Assays, die Fluoreszenz zu verwenden, um das Verhalten der Zelle untersuchen zu verbessern.

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Protocol

1. Software-Installation

  1. Kaufen StreamPix 5 Multi-Kamera-Software mit SimulPix Modul oder andere Imaging-Software in der Lage, das Sammeln und Kombinieren von Bildern durch monochrome CCD-Kameras eingefangen.
  2. Mindestanforderungen für StreamPix 5 sind: Ein PC mit Core 2 Duo ausgestattet mit 2,4 GHz oder besser mit 2 GB RAM oder höher. Ein unterstützter IEEE digitale oder analoge Kamera und kompatible Framegrabber. Windows-XP/7/Vista 32 oder 64 Bit. Ein Monitor mit Auflösung 1024 x 768 oder höher. Eine Grafikkarte mit guter 2D-Leistung (OCU auszudrücken 16x oder besser wird empfohlen) und 7200-RPM-Festplattenlaufwerk für die Aufzeichnung mit RAID-O-Konfiguration.

2. Installation von Dual-Kamera-System, das Zwei-Farben-Simultan-Echtzeit-Imaging

  1. Schließen Sie das DC2 Photometrics Emissions Splitter oder ähnliche Doppelkamera Emissionstrenneinrichtung, an das Mikroskop, indem Sie den DC2 C-Mount-Adapter in den Videoanschluss des MICROscope so dass das Gehäuse des dichroitischen auf der Vorrichtung zugänglich ist.
  2. Legen Sie zwei monochrome CCD-Kameras in weibliche C-Mount-1 und weibliche C-Mount-2. Identische Kameras sind bevorzugt. Ähnliche Kameras verwendet werden, aber die Kompatibilität ist von internen Hardware, vor allem der CCD-Bildsensor.
  3. Verwenden Imaging-Software, um Bilder von beiden Kameras anzuzeigen. Die folgenden Schritte (2.3.1 - 2.3.4) gelten für StreamPix 5 mit SimulPix Modul und muss für andere Multi-Kamera-Imaging-Software angepasst werden.
    1. Offene StreamPix 5 und wählen Sie "Arbeitsplatz" in der Task-Band.
    2. Öffnen Sie "Arbeitsbereich-Manager" am rechten Bildschirmrand und wählen Sie "neuen Arbeitsbereich".
    3. Nach der Benennung eine Kamera, folgen Sie Software dazu aufgefordert, einen Grabber aus einem bereits besiedelten Liste auswählen. Wählen Sie den passenden Grabber das Kameramodell, und wiederholen Sie für die zweite Kamera Arbeitsbereich. Für die fusionierte Arbeitsbereich noch einmal wiederholen, aber "alle Kameras im Einsatz sind" Fehler message erscheint. Diese Meldung ist normal.
    4. Sobald die fusionierte Arbeitsbereich geladen wird, weisen Kameras aus dem Arbeitsbereich 1 und 2 Arbeitsbereich zu dem neuen Arbeitsbereich in der auf der rechten Seite des Bildschirm befindet Docking Panel.
  4. Richten Kameras in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem.
    1. Richten Kameras im Hellfeld oder Phasenkontrast mit dem Kalibrierungsgitter vom Hersteller mit einem PlanApo 40X-Objektiv (oder höher) zur Verfügung gestellt.
    2. Senden Licht in die Mikroskop-Okulare, legen Sie die mit metallischem Überzug Kalibrierungsgitter, die vom Hersteller auf dem Mikroskoptisch zur Verfügung gestellt wurde, und die Quadratur des Rasters auf dem Mikroskoptisch.
    3. Bringen Sie das Gitter in den Fokus.
    4. Verdrängen, aber nicht entfernen, den dichroitischen Gehäuse Kamera 1 (Bypass-Kamera) auszurichten. Zeigen Sie das Netz ohne Binning und ohne Autoskalierung. Stellen Sie das Bild mit dem Scharfstellknopf auf C-Mount-Anschluss ein.
    5. Schieben Sie das Gehäuse in die dichroitischen Dual channel Fassungseinrichtung vollständig, so dass das Bild durch den dichroitischen beiden Kameras aufgeteilt.
    6. Lösen Sie die drei 5/64 "Stellschrauben drehen und die zweite Kamera auf der weiblichen C-Mount-2, bis die Ausrichtung des Rasters ist in beiden Bildern identisch. Mit der Fokus-Einstellung Wahl auf C-Mount-Anschluss 2, bringen das Bild von der Kamera 2 in den Fokus.
    7. Schließen Sie die Ausrichtung mit dem kombinierten Bild in der zusammengeführten Arbeitsbereich der Bildbearbeitungssoftware. Dies erlaubt es, eine Echtzeit-Pseudoüberlagerung der beiden Bilder des Kalibrierungsgitter sehen. Anpassen der Bildpositionen kombiniert mit nur einem R / L-Knopf auf der rechten Seite des DC2. Stellen Sie diesen Regler, bis rechts / links vertikale Begrenzung der Bilder wird präzise ausgerichtet.
    8. Verwenden Sie die U / D-Regler, um den Auf / Ab-Ausrichtung des zweiten Bildes anpassen, bis die horizontalen Gitterstäbe richtig ausgerichtet sind.
    9. Wenn während der Auf / Ab-Ausrichtung eine leichte Drehung der Kamera auftritt, dieses Problem zu korrigieren, indem Sie die drei 5/64 "Zoll Eindrehenws zur Kamera 2 und zu drehen, bis das angezeigte Bild richtig ausgerichtet ist.

3. Herstellung von Krebszellen für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhäsionsassay

  1. Kultur BT-20-Brustkrebszellen in Minimum Essential Medium (MEM) ergänzt Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C und 5,0% CO 2, wie zuvor beschrieben 2 abzuschließen.
  2. Ernte Krebszellen mit einer verdünnten Trypsin-Behandlung und zählen Zellen mit einer Zählkammer.
  3. Wasch und Zellen zu suspendieren 10 7 Zellen / ml in 0,1% Albumin aus Rinderserum (BSA) in DPBS mit Calcium und Magnesium (DPBS +).
  4. Verdünnte primäre Antikörper, gereinigtes Maus-anti-Mensch-CD24 und gereinigte Ratten HECA-452 (Anti-sialofucosylated Antigene), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Zellen inkubieren 30 min 9, 10.
  5. Centrifuge Zellen bei 1.200 min um ein Zellpellet zu erhalten. AspiRate primärer Antikörper, und waschen die Zellen zweimal mit 0,1% BSA DBPs +.
  6. Verdünnte sekundäre Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568 (Emissions max, 603 nm) und Ziege-anti-Ratte-IgM AlexaFluor 488 (Emissions max, 519 nm), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Inkubieren Zellen für 30 min.
  7. Waschen der Zellen zweimal auszusetzen 0,1% BSA in DPBS + 10 6 Zellen / ml in 0,1% BSA-DPBS +.

4. Herstellung von Reaktiv Substrat für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhesion Assay

  1. Verbindung von zwei getrennten Rohrlängen zu den Einlass-und Auslassöffnungen der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb eines 35-mm-Gewebekulturschale passt. Ein Rohr wird in das Reservoir der markierten Zellen in 0,1% BSA-DPBS + und das andere an der Spritzenpumpe, die Flüssigkeit bei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit zurückzuziehen ausgesetzt verbinden.
  2. Schließen Sie eine Vakuumleitung zur Strömungskammer ein.
  3. Die Flusskammer Position über der 35 mm-Gewebekultur dish, das eine Monoschicht aus Ovarzellen des chinesischen Hamsters E-Selectin (CHO-E) exprimieren. CHO-E-Zellen wurden in MEM-Komplettmedium bei 37 ° C gezüchtet und 5,0% CO 2 2.
  4. Die Durchflusskammer und / oder Strömungskammer Dichtung einen angemessenen Vakuumdichtung 1 zu gewährleisten.
  5. Ziehen Flüssigkeit aus dem Behälter, die Überwachung der Durchflusskammer-Anordnung für die richtige Dichtung und ohne sichtbare Anzeichen von Luftblasenbildung ein.
  6. Zeigen Flusskammer Montage auf Mikroskop (Leica DMI 6000B) ein.

5. Zwei-Farben-Bildaufnahme

  1. Strom ein Leica EL-6000 kompakte Lichtquelle, oder ein ähnliches Gerät, um Licht mit hoher Intensität und Paar es in einen Lichtleiter zu erzeugen. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, dieses Licht durch eine Kombination Filterwürfel, dh G / R (grün / rot) Filterwürfel passieren, um Fluorophore einer gewünschten Farbe / Intensität zu erregen.
  2. Stellen Sie sicher, dichroitischen Gehäuse ist in der richtigen Arbeitsposition (depressiv) undnicht in den Bypass-Modus.
  3. Betreiben Sie in der Fluoreszenz-Mikroskop-Modus und wählen Sie das richtige Fluoreszenzfilterwürfel (grün / rot).
  4. Bestimmen Sie die Belichtungszeit und Gain-Kamera 1 (rot, 620 ± 60 nm) und die Kamera 2 (grün, 535 ± 40 nm).
    1. Drücken Sie den dichroitischen um Bilder sowohl in den roten und grünen Emissions Kanäle zu erhalten. Verwenden Sie eine Durchflusskammer-Assays mit Zellen nur mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert und erhalten ein Bild in den roten Kanal, indem die Belichtungszeit der Kamera 1 in "Live-Einstellungen" der Imaging-Software.
    2. Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera 2 auf die Belichtungszeit der Kamera ein. Wenn ein Bild in den grünen Kanal beobachtet, vorliegen Durchbluten Artefakte und die Belichtungszeit in beiden Kameras verringert werden muss.
    3. Halten der Belichtungszeitwert in der Kamera 1 und Kamera 2, die Belichtungszeit zu verringern, bis das Durchbluten Artefakt nicht mehr im grünen Kanal sichtbar. Stellen Sie die Verstärkung der Kamera ein Bild zu verbessern visibility im roten Kanal, falls erforderlich.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 - 5.4.3 mit Zellen nur mit dem grünen Fluorophor markiert, aber definieren Belichtungszeit mit der Kamera 2 Bildzellen im grünen Kanal ohne Durchbluten Artefakte im roten Kanal von Kamera 1 gesammelt.
    5. Retitrate Antikörper, wenn Durchbluten Artefakte nicht beseitigt werden 11, oder wenn Belichtungszeiten von Kamera 1 und Kamera 2 wesentlich sind solche, die zusammengeführt Bilder können zeitlich falsch ausgerichtet sein.
  5. Verwenden Imaging-Software, um Bilder gleichzeitig von zwei monochrome CCD-Kameras in der Flusskammer Experiment gefangen zu sehen.
  6. Merge Bilder von beiden Kameras mit dem SimulPix Modul StreamPix 5 oder eine alternative Software-Paket gesammelt.
  7. Verwenden digitalen Korrekturanpassungen in SimulPix oder alternative Software, um räumlich richten Sie die zusammengeführten Bilder, falls erforderlich. Bilder können mit dem Modul SimulPix für horizontale, vertikale korrigiert werdenUnd Dreheinstellungen.

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Representative Results

Eine Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay wurde verwendet, um eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, die gleichzeitig in zwei Emissionskanäle erfasst Echtzeit-Bildsequenzen (Abbildung 1) zu demonstrieren. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erkannt BT-20-Zellen, die mit Fluoreszenz-Anti-Human-CD24 und HECA-452 (Erkennung sialofucosylated Antigene) monoklonale Antikörper und entsprechenden Sekundärantikörper (Abbildung 2) markiert waren. Einige Roll Zellen angezeigt rote Signale (CD24) noch nicht nachweisbar grüne Signale (HECA-452), andere grüne Signale angezeigt und nicht nachweisbar rote Signale, und doch anderen Zellen angezeigt, die rote und grüne Signale (Abbildung 2). Fusioniert Emissionskanal offenbart die Verteilung und die Co-Lokalisation von CD24 und sialofucosylated Moleküle auf der Oberfläche von BT-20-Zellen Aufrollen und CHO-E-Monoschichten haften (Fig. 3 und 4). Die Dual-Kamera-Emissions splibenötigtem System ursprünglich eine geringe Bildausrichtungsfehler aufgrund der Ausrichtung der Kameras, aber dieser Fehler mit digitaler Einstellung (Fig. 5) mit der SimulPix Modul StreamPix 5 korrigiert. Insgesamt hat der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um zelluläre und molekulare Funktionen in Anwendungen wie Strömungskammer Adhäsions-Assays, bei denen Zellen bewegen sich schnell durch das Sichtfeld zu offenbaren.

Figur 1
Fig. 1 ist. Illustration von einem Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem zum Erfassen von Bildern in einem Parallelplattenlaufkammer Adhäsionsassay. Spritzenpumpe wird verwendet, um Zellen über Substrat in der Parallelplattenlaufkammer durchströmen. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop verbunden ist, verwendet einen dichroitischen mirror und Filterwürfel in zwei Kameras aufgeteilt und filtern Emissions Kanäle. Diese Kameras erfassen gleichzeitig zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifischen Bildsequenzen. Ein Computer mit Multi-Kamera-Imaging-Software ausgestattet ist, verwendet werden, um zusammenführen und aufzeichnen Bildsequenzen aus jeder Emissionskanal.

Figur 2
2. Ein Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem wurde für die Echtzeit gleichzeitige Abbildung eines Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay verwendet. BT-20-Zellen, die mit (1) Anti-Human-CD24-und Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568 (pseudocolored rot, max Emissions beschriftet, 603 nm; Kamera 1, 620 ± 60 nm) und (2) HECA-452 und Anti-Ratte-IgM AlexaFluor 488 (pseudocolored grünen Emissions max 519 nm; Kamera 2, 535 ± 40 nm) wurden in einem CHO-E Mono perfundiert bei Wandschubspannung = 1 dyn / cm 2. Dual-Kamera zusammengelegt iMagier offenbaren Heterogenität innerhalb einer Walzzellpopulation und können zur Walzverhalten basierend auf der Expression von Zelloberflächenmolekülen zu charakterisieren. Maßstabsbalken = 100 um. Bild mit einem 10X-Objektiv erworben.

Fig. 3
3. Eine zeitliche Abfolge der fusionierten Bilder von einem Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem zeigt BT-20-Zellen, die CD24 (pseudocolored rot) und sialofucosylated Moleküle (pseudocolored grün) Rollen auf einer CHO-E-Monoschicht an Wandschubspannung = 1 dyn / cm 2 eingefangen. Kameras erhalten die optischen und zeitlichen Auflösung die Zellfunktionen auf einem Zell Taumeln "end-over-end", wie es auf dem gewalzten reaktives Substrat in Strömungsrichtung zu verfolgen. Weiße Pfeile zeigen einen Raupen Cluster von Zelloberflächenmolekülen. Emissionssignale in jedem Kanal wurden pseudocolored und in der ich zusammengeführtmaging Software. Beachten Sie, dass colokalisiert Signale erscheinen gelb / orange. Standbilder wurden von Echtzeit-Bildsequenzen bei Zeitpunkten gezeigt exportiert. Maßstabsbalken = 10 um. Bilder mit einer 40X-Objektiv erworben.

Fig. 4
4. Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem zeigt Kolokalisation von CD24 (pseudocolored rot) und sialofucosylated Moleküle (pseudocolored grün) von einem Vertreter BT-20 Brustkrebszell Rollen auf einer CHO-E-Monoschicht ausgedrückt. Heterogene Expression von (A) CD24 und (B) sialofucosylated Moleküle auf der Zelloberfläche in jedem Bild hervorgehoben. (C) Kolokalisation von Molekülen erscheint als gelb / orange pseudocolored Flecken, wenn rote und grüne pseudocolored Emissions Kanäle zusammengeführt werden. Zellendurchmesser etwa 10 &mgr; m. Bilder erworben with ein 40X-Objektiv.

Figur 5
Abbildung 5.Adjustments auf die horizontale, vertikale und räumliche Dreh Einstellungen der Bilder in der Kamera 1 und Kamera 2 erfasst die räumliche Ausrichtung in der fusionierten Bild zu verbessern. Richtige Ausrichtung ist entscheidend, um genau darzustellen, wie Zellen anhaften und Walzen in der Adhäsionsassay . (A) Eine fusionierte Bild von einem einzigen BT-20-Zelle wird durch die Kamera-Positionierung falsch ausgerichtet. (B) Räumliche Ausrichtung wird mit Software-Anpassungen in der SimulPix Modul StreamPix 5 verbessert. (C) Weitere Software-Anpassungen zu erreichen nahezu perfekte Ausrichtung. Maßstabsbalken = 2 um. Bilder mit einer 40X-Objektiv erworben.

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Discussion

Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem hat die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um qualitativ hochwertige Bilder in Anwendungen, bei denen Zell-oder Molekularbewegung schnell ist zu erfassen. Bei der Erzeugung der repräsentative Ergebnisse, Parameter in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, einschließlich Software-Einstellungen und Kameraeinstellungen wurden optimiert, um eine zusammengeführte Bildfolge, in der Walz-und adhärenten Zellen waren zeitlich und räumlich ausgerichtet zu erhalten. Diese Optimierung Schritt ist wichtig, da Fehlausrichtung in Bildern, die nicht richtig vermitteln nicht das physikalische Phänomen untersucht, z. B. führen eine einzige beobachtet, sowohl in den grünen und roten Kanäle rollen Zelle als zwei Walz Zellen in der zusammengeführten Arbeitsbereich angezeigt. Räumliche Ausrichtung sollten in den Aufbau der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erreicht, wenn Kameras sind körperlich ausgerichtet, wie in Schritt 2.4 des Protokolls beschrieben. Digitale Korrekturen an der räumlichen Ausrichtung der Bilder captgemessen durch die Kameras für horizontale, vertikale oder Drehversatz (e) durch digitale Ausrichtungseinstellungen in der Bildgebungssoftware (Schritt 5.7 und Abbildung 5) aufgebracht werden.

Belichtungszeit, Offset und Verstärkung: Zeitliche Ausrichtung zwischen Bilder von Kamera 1 und Kamera 2 aufgenommen wurden, können durch die Anpassung der "live-Einstellungen" der Kameras erreicht werden. Verstärkungs-und Offset kann, ohne die zeitliche Ausrichtung der zusammengeführten Bilder eingestellt werden, aber Abweichungen in der benutzerdefinierten Belichtungszeit zwischen Kameras können zu einer Fehlausrichtung führen. Somit Verstärkung eingestellt werden kann, um Unterschiede zwischen den Belichtungszeiten verwendet werden, um Bilder in jeder Kamera sammeln kompensieren. Idealerweise sollten Unterschiede in der Belichtungszeit zwischen Kameras nur erlaubt werden, wenn Verstärkungseinstellungen erscheinen die Bildqualität erheblich beeinträchtigen. Alternativ können Antikörper-Titration durchgeführt, um Zellmarkierung zu optimieren, um Unterschiede in Belichtungszeit von jeder Kamera erforderlich kompensieren (a) aufgrund der inhärenten Eigenschaften der einzelnen Fluorophor oder (b) aufgrund der Unterschiede in der molekularen Expressionsniveaus von jedem Antikörper / Fluorophors detektiert. Es sollte jedoch auch darauf hingewiesen, dass eine Antikörper-Titration Experimente sind Best-Practice-zu Durchbluten Artefakte (Schritt 5.4.5) 11 zu verhindern.

Obwohl die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem wurde verwendet, um gleichzeitig zwei Bildzielmoleküle in separate Emissions Kanäle sind alternative Technologien in der Lage, gleichzeitig die Aufnahmen in mehrere Emissionskanäle. Diese Abbildungssysteme reichen von Einzel-Farbkameras konfokale Mikroskope, und jede hat Vor-und Nachteile in Bezug auf Bildqualität, Geschwindigkeit und Kosten 12-17. Insbesondere, state-of-the-art konfokaler Laser-Scanning-Mikroskope, die Resonanzscanner integrieren sind beeindruckend multispektrale Imaging-Systeme in der Lage, die Erfassung von Bildern in Hunderten von Bildern pro Sekunde. Diese konfokale Systeme sind extrem leistungsfähig,aber ihre Kosten kann die Anzahl von Forschern, die Zugang zu diesen Systemen durch Kerneinrichtungen haben zu begrenzen. Letztlich sind die experimentellen Bedürfnisse und der Mittel jedes Labor Diktat, die Multi-Channel-Imaging-System am geeignetsten ist.

Die hier beschriebenen Verfahren erklären, wie Echtzeit-Bildsequenzen in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem-und Imaging-Software zu erhalten. Räumliche und zeitliche Ausrichtung der Bilder in zwei Emissionskanäle durch ähnliche monochrome CCD-Kameras eingefangen ist wichtig für die Produktion von hochwertigen Echtzeit-Bildsequenzen zusammengeführt, die gleichzeitig zeigen, mehrere Zielmoleküle auf Zellen. Bewerbungen für den Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem gehören alle Zwei-Farben-Lebendzellanalyse, die außergewöhnliche optische und zeitliche Auflösung eines Vollbild, wie Flow Assays, die Translokation von Zelloberflächenmolekülen, Zytoskelett-Umbau, vesikulären Transport und 3D-Partikel verlangt Verfolgung.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Douglas Goetz (Institut für Chemische und Biomolekulare Ingenieurwissenschaften, Ohio University) und Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) für aufschlussreiche Diskussionen und Kritik Manuskript danken. Wir danken auch Dr. Christopher Huppenbauer für hilfreiche technische Diskussionen (W. Nuhsbaum Inc.). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der National Science Foundation (CBET-1106118) und der National Institutes of Health (1R15CA161830-01) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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