Samtidigt Fånga bilder i realtid i två Utsläpps Kanaler Med hjälp av en Dual Camera Emission Splitting System: Ansökningar till Cell Adhesion

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dubbla kamera delningssystem för tvåfärgad fluorescensmikroskopi utsläpps generera realtidsbildsekvenser med exceptionell optisk och tidsmässig upplösning, ett krav för vissa levande cellanalyser inklusive parallella platta flöde kammare vidhäftningsanalyser. När programvaran används för att sammanfoga bilder samtidigt förvärvade utsläppskanaler, är pseudocolored bildsekvenser produceras.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Carlson, G. E., Martin, E. W., Burdick, M. M. Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion. J. Vis. Exp. (79), e50604, doi:10.3791/50604 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Multi-color immunfluorescensmikroskopi för att detektera specifika molekyler i cellmembranet kan kopplas med parallella plattflödeskammare analyser för att undersöka mekanismerna som reglerar cellvidhäftning under dynamiska flödesbetingelser. Till exempel kan cancerceller märkta med multipla fluoroforer perfuseras över en potentiellt reaktiva substrat för att modellera mekanismen av cancermetastaser. Men flera kanaler enda kamerasystem och färgkameror uppvisar brister i bild förvärv för realtids levande cell analys. För att övervinna dessa begränsningar, använde vi en dubbel kamera utsläpp splitsystem att samtidigt fånga realtidsbildsekvenser av fluorescerande celler i flödet kammaren. Dubbla kamera delningssystem utsläppsfilter definierade våglängdsområden i två monokrom CCD-kameror, och därmed samtidigt fånga två rumsligt identiska men fluoroforenheter specifika bilder. Därefter psuedocolored en kana bilderna kombineras till en endarealtid fusione sekvens som kan avslöja flera målmolekyler på celler som rör sig snabbt över en region av intresse.

Introduction

Metoder för analys av molekyler på cellytan, såsom immunfärgning, använda prober som är kemiskt konjugerade med fluoroforer, vilket möjliggör detektion av målmolekyler. Levande cell imaging och hydrodynamiska flödesbaserad celladhesionsanalyser är vanligtvis spelas med monokrom CCD-kameror är utformade för att fånga fysiologiska processer på cellulär och / eller molekylär nivå 1, 2. Dessa kameror är mycket känsliga, levererar snabb bildhastighet (mer än 30 bilder per sekund), och ger exceptionell tidsupplösning (på grund av snabb bildhastighet och korta exponeringstider). Däremot kan monokroma kameror bara fånga en enda utsläppskanal (upptäcka en enda fluorofor) för att samla in bilder. Enstaka kamera utsläpp delningssystem kan införlivas för att fånga flera utsläppskanaler men ofta minska synfältet och kräver samma exponeringstid för avbildning alla kanaler. För att fånga den fulla färgspektrum från celler märkta med multiple fluoroforer, en färgkamera kan användas som ett alternativ. Emellertid färgkameror är i allmänhet inte i stånd att tillhandahålla den temporala upplösningen som önskas för levande cell imaging i vissa applikationer. En annan bildenhet behövs för tillämpningar där det är fördelaktigt att bilden levande celler vid flera våglängder samtidigt behålla en hög tidsupplösning. Ett främsta experimentell tillämpning är den parallella plattflödeskammaren vidhäftningsanalys, där celler perfunderades vid fysiologiskt relevanta förhållanden under en potentiellt reaktiva substrat 1, 3. Celler i flödet som uttrycker specifika molekyler på cellytan kan vidhäfta och rulle på substratet, såsom en cellmonoskikt som uttrycker adhesionsmolekyler eller yt-adsorberat extracellulära matrisproteiner 4, 5. Rullande celler kan genomgå roterande och translationsrörelse i bråkdelar av en sekund. Molekylära funktionerna hos valsning och vidhäftande celler, såsom kluster av molekyler på cellytan, har också den potentioal genomgå aktiv omorganisation på cellytan. Således måste bildsystem ger en exceptionell tidsupplösning (30 bilder per sekund eller mer och "nära noll" exponeringstider) för att generera en bildsekvens som illustrerar steg-för-steg progression av cell rullande 6, 7. Delningssystem Dubbla kamera utsläpp kan uppfylla dessa krav för att avbilda celler märkta med flera fluoroforer.

Delningssystem Dubbla kamera utsläpps split och filter fluorescens-kanaler i två liknande kameror att samtidigt fånga två rumsligt identiska men fluoroforenheter specifika bilder och samtidigt behålla hela synfältet. Denna teknik möjliggör direkt jämförelse av bilden fångas i realtid i varje kanal och gör det möjligt för användaren att snabbt växla mellan olika kameramodeller med olika bildfunktioner. Denna funktion är användbart för att göra justeringar av bildimportkonfigurationer i en kamera som bättre tillåta systemet att fångafluoroforer med olika intensitet, livslängder och extinktionskoefficienterna 8. Tillsammans med bildbehandlingsprogram, dubbla kamera delningssystem utsläpps tillåter realtidsinspelning av levande cell imaging analyser i flera våglängder och kan öka in vitro-analyser som använder fluorescens för att studera cellens beteende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Installation av programvara

  1. Köp StreamPix 5 Multi-kamera programvara med SimulPix modul eller annat bildbehandlingsprogram kan samla och kombinera bilder som tagits med monokroma CCD-kameror.
  2. Minimikrav för StreamPix 5 är: En dator utrustad med Core 2 Duo med 2,4 GHz eller bättre med 2 GB RAM eller mer. En som stöds IEEE digital eller analog kamera och kompatibel frame grabber. Windows XP/7/Vista 32 eller 64 bit. En bildskärm som stöder upplösningen 1024 x 768 eller högre. Ett grafikkort med bra 2D prestanda (OCU express 16x eller bättre rekommenderas) och 7200 RPM hårddisk för inspelning med RAID-O-konfiguration.

2. Installation av dubbla kamerasystem Kan Two Color Samtidig realtid avbildning

  1. Anslut DC2 Photometrics utsläpp splitter, eller liknande dubbla kamera dela utsläppsenhet, till mikroskop genom att skjuta DC2 C-fäste adaptern till videoporten på MICRoscope så att höljet av den dikroiska på enheten är åtkomlig.
  2. Sätt i två monokrom CCD-kameror i kvinnliga C-mount 1 och kvinnliga C-fäste 2. Identiska kameror är att föredra. Liknande kameror kan användas, men kompatibiliteten är beroende av intern maskinvara, viktigast CCD bildsensor.
  3. Använd bildbehandlingsprogram för att visa bilder från båda kamerorna. Följande steg (2.3.1 - 2.3.4) gäller för StreamPix 5 med SimulPix modul och måste anpassas för andra flerkamera bildbehandlingsprogram.
    1. Öppna StreamPix 5 och välj "arbetsyta" i aktivitetsband.
    2. Öppna "arbetsyta manager" som ligger på långt till höger på skärmen och välj "ny arbetsyta".
    3. Efter att namnge en kamera, följer programvara uppmanas att välja en grabber från en förifylld lista. Välj grip matchar kameramodell och upprepa för den andra kameran arbetsytan. För det sammanslagna arbetsyta, upprepa en gång till men "alla kameror är i bruk" fel message visas. Detta meddelande är normalt.
    4. När det sammanslagna arbetsytan är laddad, tilldela kameror från arbetsyta 1 och arbetsyta 2 till den sammanslagna arbetsyta i dockningspanel placerad på höger sida av bildskärmen.
  4. Rikta kameror i dubbla kamera emissionssplitsystem.
    1. Rikta kameror i starkt fält eller fas kontrast med kalibreringsnätet tillhandahålls av tillverkaren med hjälp av en PlanApo 40X mål (eller högre).
    2. Skicka ljus till mikroskop okular, placera metallbelagda kalibreringsnätet som tillhandahålls av tillverkaren på mikroskop scenen, och fyrkantiga gallret på mikroskop scenen.
    3. Ta gallret i fokus.
    4. Förskjutning, men ta inte bort, den dikroiska bostäder att rikta kameran 1 (bypass-kamera). Visa rutmönstret utan binning och utan automatisk skalning. Fokusera bilden med hjälp av fokusjustering ratten på C-mount-port 1.
    5. Skjut dikroiska bostäder i dual channel förvärvs enhet helt, så att bilden delas av dichroic till båda kamerorna.
    6. Lossa de tre 5/64 "ställskruvar och rotera den andra kameran på den kvinnliga C-fäste 2 till orienteringen av nätet är identisk i båda bilderna. Med hjälp av fokusjustering ratten på C-mount-port 2, ta med bilden från kameran 2 i fokus.
    7. Slutföra anpassningen med den kombinerade bilden i det sammanslagna arbetsyta av bildprogram. Detta gör att man kan se en realtidspseudoöverlagring av de två bilderna av kalibreringsnätet. Justera de kombinerade bildlägen enbart med hjälp av R / L ratten på höger sida av DC2. Justera ratten tills höger / vänster vertikala gränsen av bilderna är exakt i linje.
    8. Använd U / D-ratten för att justera upp / ned inriktning av den andra bilden tills de horisontella gallerstänger är rätt inriktade.
    9. Om det under upp / ned inriktning en liten kamera rotation uppstår, åtgärda problemet genom att lossa de tre 5/64 "tums SCREws för kamera 2 och vrid tills den visade bilden är korrekt inställd.

3. Framställning av cancerceller för Parallel Plate flödeskammare Adhesion Assay

  1. Kultur BT-20-bröstcancerceller i minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med komplett medium med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C och 5,0% CO2 såsom tidigare beskrivits 2.
  2. Harvest cancerceller med en utspädd trypsin behandling och räkna celler med en hemocytometer.
  3. Tvätta och suspendera cellerna vid 10 7 celler / ml i 0,1% albumin från nötkreatursserum (BSA) i DPBS med kalcium och magnesium (DPBS +).
  4. Späd primära antikroppar, renad mus-anti-human CD24 och renat råtta HECA-452 (anti-sialofucosylated antigener) till en förutbestämd optimal koncentration i 0,1% BSA-DPBS +. Inkubera cellerna i 30 min 9, 10.
  5. Centrifugera cellerna vid 1200 rpm för att erhålla en cellpellet. Aspigradera primär antikropp och tvätta cellerna två gånger med 0,1% BSA DBPs +.
  6. Späd sekundära antikroppar, get-anti-mus-IgG Alexafluor 568 (emission max, 603 nm), och get-anti-rått-IgM Alexafluor 488 (emission max, 519 nm), till en förutbestämd optimal koncentration i 0,1% BSA-DPBS +. Inkubera cellerna i 30 min.
  7. Tvätta cellerna två gånger och suspendera i 0,1% BSA DPBS + kl 10 6 celler / ml i 0,1% BSA DPBS +.

4. Framställning av reaktivt substrat för parallella plattflödeskammare Adhesion Assay

  1. Anslut två separata slanglängder på in-och utlopp i den parallella plattflödeskammare som passar i en 35 mm vävnadsodlingsskål. Ett rör ansluter till reservoar av märkta celler, suspenderade i 0,1% BSA-DPBS + och den andra sprutpumpen, som kommer att dra in fluid vid en specificerad flödeshastighet.
  2. Anslut en vakuumledning till flödeskammaren 1.
  3. Placera flödet kammaren över 35 mm vävnadskultur dish innehållande ett monoskikt av ovarieceller från kinesisk hamster som uttrycker E-selektin (CHO-E). CHO-E-celler odlades i MEM komplett medium vid 37 ° C och 5,0% CO2 2.
  4. Justera flödeskammaren och / eller flödeskammare packning för att säkerställa en tillräcklig vakuumtätning 1.
  5. Ta ut vätska från reservoaren, övervaka flödet kammarenhet för korrekt tätning och inga visuella tecken på luftbubbelbildning 1.
  6. Placera flödeskammare montering på mikroskop (Leica DMI 6000B) 1.

5. Tvåfärgad Image Acquisition

  1. Ström en Leica EL-6000 kompakt ljuskälla, eller liknande anordning, för att generera ljus med hög intensitet och par den in i en ljusledare. Använd ett inverterat mikroskop för att passera detta ljus genom en kombinationsfilter kub, dvs G / R (grön / röd) filter kub, att excitera fluoroforer av en önskad färg / intensitet.
  2. Säker dichroic bostäder är i rätt driftläge (nedtryckt) ochinte är i bypass-läge.
  3. Kör mikroskop i fluorescens-läge och väljer lämplig fluorescens filter kub (grön / röd).
  4. Bestäm exponeringstiden och vinst i kamera 1 (röd, 620 ± 60 nm) och kamera 2 (grön, 535 ± 40 nm).
    1. Tryck ner dichroic att få bilder i både röda och gröna utsläppskanaler. Använd en flödeskammare analys med celler märkta med endast den röda fluoroforen, och få en bild på den röda kanalen genom att justera exponeringstiden för kameran 1 i "live-inställningar" i bildprogram.
    2. Matcha exponeringstid av kamera 2 till exponeringstiden för kameran 1. Om en bild observeras i den gröna kanalen, blöder igenom artefakter är närvarande och exponeringstid i båda kamerorna måste minskas.
    3. Att hålla exponeringstiden motsvarande i kamera 1 och kamera 2, minska exponeringstiden tills genomblödning artefakt är inte längre syns i den gröna kanalen. Justera förstärkningen av kameran 1 för att förbättra bild visibility i den röda kanalen vid behov.
    4. Upprepa steg 5.4.1 - 5.4.3 med celler märkta med endast den gröna fluoroforen, men definiera exponeringstid med kamera 2 till bildceller i den gröna kanalen utan genomblödning artefakter i den röda kanalen samlas in av kameran 1.
    5. Retitrate antikroppar om genomblödning artefakter inte kan elimineras 11, eller om exponeringstider för kamera 1 och kamera 2 är väsentligen olika sådana att sammanslagna bilderna kan vara tidsmässigt dåligt.
  5. Använd bildbehandlingsprogram för att visa bilder samtidigt tagna från två monokrom CCD-kameror i flödet kammaren experimentet.
  6. Sammanfoga bilder som samlats in från båda kamerorna använder SimulPix modulen av Streampix 5 eller ett alternativt programpaket.
  7. Använd digitala korrigerings justeringar i SimulPix eller alternativ programvara för att rumsligt rikta in de sammanslagna bilderna om det behövs. Bilder kan korrigeras med SimulPix modul för vågrät, lodrätoch rotationsjusteringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En parallell platta flöde kammare vidhäftnings analys användes för att demonstrera en dubbel delning systemkamera utsläpp som samtidigt fångade realtidsbildsekvenser i två utsläppskanalerna (figur 1). Den dubbla kamera utsläpp splitsystem upptäckt BT-20 celler som fluorescerande med anti-humant CD24 och HECA-452 (upptäcka sialofucosylated antigener) monoklonala antikroppar och lämpliga sekundära antikroppar (Figur 2). Vissa rullande celler uppvisade röda signaler (CD24) ännu ej detekterbara gröna signaler (HECA-452), medan andra visas gröna signaler och undetectable röda signaler, och ytterligare andra celler visas både röda och gröna signaler (fig 2). Sammanfogade utsläppskanaler avslöjade fördelningen och samlokalisering av CD24 och sialofucosylated molekyler på ytan av BT-20-celler som rullar på och vidhäfta till CHO-E-monoskikt (fig 3 och 4). Den dubbla kamera spli utsläppmma systemet hade ursprungligen en liten bildjustering fel på grund av anpassningen av kamerorna, men detta fel korrigerades med digitala justeringar (Figur 5) med hjälp av SimulPix modulen av StreamPix 5. Sammantaget har den dubbla kamera emissionssplitsystem den rumsliga, tidsmässiga, och optisk upplösning som behövs för att avslöja cellulära och molekylära funktioner i applikationer såsom flödeskammarvidhäftningsanalyser, i vilka celler rör sig snabbt genom synfältet.

Figur 1
Figur 1. Illustration av en dubbel kamera utsläppssplitsystem för inhämtning av bilder i en parallell plattflödeskammare vidhäftningsanalys. En sprutpump användes för att begjuta celler över substratet i den parallella plattflödeskammaren. Den dubbla delning systemkamera utsläpp anslutet till ett inverterat epifluorescensmikroskop använder en dikromatisk mirror och filter kuber att dela och filtrera utsläppskanaler i två kameror. Dessa kameror samtidigt fånga två rumsligt identiska men fluoroforenheter specifika bildsekvenser. En dator utrustad med flera kameror imaging programvara används för att sammanfoga och spela in bildsekvenser från varje kanal utsläpp.

Figur 2
Figur 2. En dual kamera utsläppssplitsystem användes för realtids samtidig avbildning av en parallell plattflödeskammare vidhäftningsanalys. BT-20-celler märkta med (1) anti-human CD24 och anti-mus IgG Alexafluor 568 (pseudocolored röd, max utsläpp, 603 nm, kamera 1, 620 ± 60 nm) och (2) HECA-452 och anti-råtta IgM Alexafluor 488 (pseudocolored grönt, max utsläpp 519 nm, kamera 2, 535 ± 40 nm) var perfusion över en CHO-E monolager vid vägg skjuvspänning = 1 dyn / cm 2. Dubbla kamera slås samman iMages avslöjar heterogenitet inom en rullande cellpopulation och kan användas för att karakterisera rullande beteende baserat på expressionen av cellytmolekyler. Scale bar = 100 | im. Bild förvärvats med en 10X mål.

Figur 3
Figur 3. En tidssekvens sammanslagna bilder som tagits med en dubbel kamera utsläpp splitsystem visar BT-20 celler som uttrycker CD24 (pseudocolored röd) och sialofucosylated molekyler (pseudocolored grön) rullar på en CHO-E monolager vid vägg skjuvspänning = 1 dyn / cm 2. Kameror bibehålls de optiska och temporal upplösning för att spåra cellfunktioner på en cell tumlande "end över end" som det rullade på det reaktiva substratet i flödesriktningen. Vita pilar indikerar en band kluster av molekyler på cellytan. Utsläpps signaler i varje kanal var pseudocolored och slås samman i den i:maging programvara. Observera att samlokaliserades signaler verkar gul / orange. Stillbilder exporterades från realtidsbildsekvenser vid tidpunkter som visas. Scale bar = 10 | im. Bilder som förvärvats med en 40X mål.

Figur 4
Figur 4. Dubbla kamera utsläpp splitsystemet avslöjar colocalization av CD24 (pseudocolored röd) och sialofucosylated molekyler (pseudocolored grön) som uttrycks av en representant för BT-20 bröstcancercell rullar på en CHO-E monolager. Heterogena uttryck av (A) CD24 och (B) sialofucosylated molekyler på cellytan framhävs i varje bild. (C) colocalization av molekyler visas som gul / orange pseudocolored fläckar när röda och gröna pseudocolored utsläpps kanaler är sammanslagna. Celldiametern är ungefär 10 | im. Bilder förvärvade with en 40X mål.

Figur 5
Figur 5.Adjustments till de horisontella, vertikala och roterande rumsliga inställningar för bilder som tagits i kamera 1 och kamera 2 kan förbättra den rumsliga inriktningen i den sammanslagna bilden. Korrekt placering är avgörande för att exakt beskriva hur celler ansluter sig och rullar i vidhäftningsanalysen . (A) en sammanslagna bilden av ett enda BT-20 cell är felinriktad på grund av kamera positionering. (B) Spatial anpassning förbättras med justeringar av programvara i SimulPix modulen av StreamPix 5. (C) Ytterligare anpassningar av programvara uppnå nästan perfekt anpassning. Scale bar = 2 jim. Bilder som förvärvats med en 40X mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den dubbla kamera utsläpp splitsystemet har den rumsliga, tidsmässiga, och optisk upplösning som behövs för att fånga bilder av hög kvalitet i applikationer där cell-eller molekylär rörelse är snabb. I generera representativa resultat, parametrar i dubbla dela systemkamera utsläpp, inklusive mjukvaruinställningar och kamerainställningar, har optimerats för att få en sammanslagna bildsekvens där valsning och vidhäftande celler var rumsligt och tidsmässigt linje. Denna optimering steg är kritisk, eftersom felaktig inriktning kan resultera i bilder som inte riktigt förmedla den fysiska fenomen under utredning, t.ex. en enda cell observeras att rulla i både den gröna och röda kanalerna kan visas som två rullande celler i det sammanslagna arbetsytan. Spatial inriktning bör uppnås i installationen av den dubbla kamera emissions dela systemet när kamerorna fysiskt inriktade enligt beskrivningen i steg 2.4 i protokollet. Digitala korrigeringar av den rumsliga inriktning av bilder captmätt från kamerorna kan användas för horisontell, vertikal eller rotationsoffset (er) genom digitala justeringsinställningar i bildprogram (steg 5.7 och Figur 5).

Temporal anpassning mellan bilder som tagits med kamera 1 och kamera 2 kan åstadkommas genom att de "levande inställningar" för kamerorna: exponeringstid, offset och förstärkning. Förstärkning och offset kan justeras utan att påverka den tidsmässiga anpassningen av de fusionerade bilder, ännu avvikelser i exponeringstid användardefinierad mellan kameror kan resultera i felaktig inriktning. Sålunda förstärkning kan justeras för att kompensera för skillnader mellan exponeringstider som används för att samla in bilder i varje kamera. Helst bör skillnader i exponeringstiden mellan kamerorna bara tillåtas när förstärkningsjusteringar verkar betydligt kompromissa bildkvalitet. Alternativt kan antikroppen titrering experiment utföras för att optimera cellmärkning för att kompensera för skillnader i exponeringstid som krävs av varje kamera (a) på grund av inneboende egenskaper för varje fluorofor, eller (b) på grund av skillnaden i molekylexpressionsnivåer som detekteras av varje antikropp / fluorofor. Det bör också noteras att antikropps titreringsexperiment är bästa praxis för att förhindra genomblödning artefakter (steg 5.4.5) 11.

Även om den dubbla kamera emissionssplitsystem användes för att samtidigt bild två målmolekyler i separata utsläppskanaler, alternativa tekniker har möjlighet att samtidigt ta bilder i flera utsläppskanaler. Dessa bildsystem sträcker sig från enstaka färgkameror till konfokala mikroskop, och alla har fördelar och nackdelar i förhållande till bildkvalitet, snabbhet, och kostar 12-17. Speciellt state-of-the-art laserskanning konfokala mikroskop som innehåller resonans skannrar är imponerande multispektrala bildsystem som kan skaffa bilder på hundratals bilder per sekund. Dessa konfokala system är extremt kraftfull,men deras kostnader kan begränsa antalet forskare som har tillgång till dessa system genom kärnanläggningar. Ytterst prövnings behov och resurser i varje labb diktera vilka flerkanalsbildsystem är lämpligast.

De metoder som beskrivs här förklarar hur du får realtidsbildsekvenser i två utsläppskanaler med dubbla kamera utsläpp splitsystem och bildprogram. Rumslig och tidsmässig anpassning av bilder som tagits i två utsläppskanaler med liknande monokroma CCD-kameror är nödvändig för produktion av hög kvalitet i realtid sammanslagna bildsekvenser som samtidigt avslöjar flera målmolekyler på celler. Ansökningar om dubbla kamera emissionssplitsystem inkludera någon tvåfärgad levande cell analys som kräver exceptionell optisk och tidsmässig upplösning av en fullt synfält, till exempel flödesanalyser, förflyttning av molekyler på cellytan, cytoskeletal ombyggnad, vesikulär transport, och 3D-partikel spårningssystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Dr Douglas Goetz (Institutionen för kemi-och biomolekylär Engineering, Ohio University) och Dr Fabian Benencia (Institutionen för biomedicin, Ohio University) för insiktsfulla diskussioner och manuskript översyn. Vi tackar också Dr Christopher Huppenbauer för hjälp tekniska diskussioner (W. Nuhsbaum Inc.). Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science Foundation (CBET-1.106.118) och National Institutes of Health (1R15CA161830-01).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
BT-20 cells ATCC HTB-19
CHO-E cells Gift from Dr. R. Sackstein (Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School)
MEM Thermo Scientific SH30024.01
FBS Thermo Scientific SH30396.03
Penicillin-streptomycin Thermo Scientific SV30010
0.25% Trypsin / 0.1% EDTA Thermo Scientific SV30031.01
DPBS Thermo Scientific SH30028.02
DPBS+ Life Technologies 14080-055
BSA Sigma A9647
HECA-452 monoclonal antibody BD Biosciences 555946
Anti-human CD24 monoclonal antibody BD Biosciences 555426
Anti-rat IgM AlexaFluor 488 Invitrogen A21212
Anti-mouse IgG AlexaFluor 568 Invitrogen A11004
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera Q Imaging EXI-BLU-R-F-M-14-C
Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera Q Imaging RET-EXi-F-M-12-C
DC2 Emission Splitter Photometrics DC2
Inverted Fluorescence Microscope Leica DMI6000 B
Streampix 5 software Norpix

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
  2. Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. Mac-2 binding protein is a novel e-selectin ligand expressed by breast cancer cells. PLoS One. 7, (9), e44529 (2012).
  3. Burdick, M. M., McCaffery, J. M., Kim, Y. S., Bochner, B. S., Colon Konstantopoulos, K. carcinoma cell glycolipids, integrins, and other glycoproteins mediate adhesion to HUVECs under flow. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, (4), C977-C987 (2003).
  4. Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions. J. Biol. Chem. 283, (23), 15816-15824 (2008).
  5. Shirure, V. S., Henson, K. A., Schnaar, R. L., Nimrichter, L., Burdick, M. M. Gangliosides expressed on breast cancer cells are E-selectin ligands. Biochem Biophys. Res. Commun. 406, (3), 423-429 (2011).
  6. Tees, D. F., Goetz, D. J. Leukocyte adhesion: an exquisite balance of hydrodynamic and molecular forces. News Physiol. Sci. 18, 186-190 (2003).
  7. Chang, K. C., Tees, D. F., Hammer, D. A. The state diagram for cell adhesion under flow: leukocyte rolling and firm adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, (21), 11262-11267 (2000).
  8. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nat. Methods. 2, (12), 910-919 (2005).
  9. Kummitha, C. M., Shirure, V. S., Delgadillo, L. F., Deosarkar, S. P., Tees, D. F., Burdick, M. M., Goetz, D. J. HECA-452 is a non-function blocking antibody for isolated sialyl Lewis x adhesion to endothelial expressed E-selectin under flow conditions. J. Immunol. Methods. 384, (1-2), 43-50 (2012).
  10. Burdick, M. M., Henson, K. A., Delgadillo, L. F., Choi, Y. E., Goetz, D. J., Tees, D. F., Benencia, F. Expression of E-selectin ligands on circulating tumor cells: cross-regulation with cancer stem cell regulatory pathways? Front. Oncol. 2, 103 (2012).
  11. Hoffman, G. E., Le, W. W., Sita, L. V. The Importance of Titrating Antibodies for Immunocytochemical Methods. Current Protocols in Neuroscience. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Weinberg, S., Lipke, E. A., Tung, L. In vitro electrophysiological mapping of stem cells. Methods Mol. Biol. 660, 215-237 (2010).
  13. Kong, K. V., Leong, W. K., Lim, L. H. Osmium carbonyl clusters containing labile ligands hyperstabilize microtubules. Chem. Res. Toxicol. 22, (6), 1116-1122 (2009).
  14. Vermot, J., Fraser, S. E., Liebling, M. Fast fluorescence microscopy for imaging the dynamics of embryonic development. HFSP J. 2, (3), 143-155 (2008).
  15. Bullen, A., Friedman, R. S., Krummel, M. F. Two-photon imaging of the immune system: a custom technology platform for high-speed, multicolor tissue imaging of immune responses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 334, 1-29 (2009).
  16. Worth, D. C., Parsons, M. Advances in imaging cell-matrix adhesions. J. Cell Sci. 123, 3629-3638 (2010).
  17. Xiao, Z., Visentin, G. P., Dayananda, K. M., Neelamegham, S. Immune complexes formed following the binding of anti-platelet factor 4 (CXCL4) antibodies to CXCL4 stimulate human neutrophil activation and cell adhesion. Blood. 112, (4), 1091-1100 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics