Permeabilisierung der anhaftenden Zellen mit einem Inertgas Jet

1Chemical Engineering, McGill University, 2Montreal Heart Institute
Published 9/04/2013
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Bioengineering

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die vorübergehende Permeabilisierung der adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl. Diese Technik erleichtert die Übertragung von genetischem Material und Biomolekülen in adhärente Säugetierzellen durch die Verwendung von mechanischen Kräften, um die Plasmamembran zu stören.

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Cooper, S., Jonak, P., Chouinard-Pelletier, G., Coulombe, S., Jones, E., Leask, R. L. Permeabilization of Adhered Cells Using an Inert Gas Jet. J. Vis. Exp. (79), e50612, doi:10.3791/50612 (2013).

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Abstract

Verschiedene Zell Transfektion Techniken existieren und diese können bis zu drei Kategorien unterteilt werden: Virus-, chemische und mechanische. Dieses Protokoll beschreibt ein mechanisches Verfahren zur zeitlich permeabilisiert adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl, der die Übertragung von in der Regel nicht durchlässig Makromolekülen in Zellen erleichtern können. Wir glauben, dass diese Technik durch Verleihen von Scherkräften an der Plasmamembran von adhärenten Zellen, was die temporäre Bildung von Mikroporen. Wenn diese Poren erzeugt werden, werden die Zellen dann durchlässig genetische Material und anderen Biomolekülen. Die beteiligten mechanischen Kräfte nicht Gefahr laufen, dauerhaft beschädigen oder Ablösen Zellen von ihrem Substrat. Es ist daher ein enger Bereich des inerten Gasdynamik in denen die Technik effektiv ist. Eine inerte Gasstrahl hat bei permeabilisierenden verschiedenen adhärenten Zelllinien, einschließlich HeLa, HEK293 und menschlichen Bauchaorta-Endothelzellen effizient erwiesen. Dieses Protokoll für die p angemessenermeabilization von adhärenten Zellen in vitro und, wie wir gezeigt haben, in vivo, welche es für die Forschung und möglicherweise in zukünftige klinische Anwendungen verwendet werden. Es hat auch den Vorteil, permeabilisierenden Zellen in einem räumlich restriktiv, was beweisen könnte, um ein wertvolles Forschungsinstrument sein.

Introduction

Mit der Entwicklung der Biomedizin und das Verständnis der Zellmechanik, die Lieferung von Biomolekülen in Zellen ist unerlässlich geworden, um viele Forschungsfelder und medizinische Therapien. Verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Fremdmolekülen durch die Plasmamembran und in das Zell-Cytosol einzuführen. Virale, chemische oder mechanische Techniken: Diese können in der Regel entweder als klassifiziert werden. Viral Techniken genetisches Material wie DNA und RNA mittels viraler Vektoren 1 transfizieren. Viral-Techniken sind in der Regel hohe Wirkungsgrade in bestimmten Zelllinien haben, aber sie haben das Potenzial für Immun-und Entzündungsreaktionen 2. Allgemeine chemische Transfektion Methoden gehören Fällung mit Calciumphosphat 3, bakterielle Exotoxine 4 und 5 Lipofektion. Diese Techniken haben sich als wirksam erwiesen, jedoch ergeben sich gewisse Probleme wie Zelltoxizität und Nicht-Spezifität. Weiterhin Techniken wie Calciumphosphate Niederschlag gefunden Transfektion Wirkungsgrade bis zu 70%, aber nur in bestimmten Zelllinien, primären Zellen selten in 6. Dies ist bemerkenswert, da zunehmende Forschungsanstrengungen werden in primären Zellen, insbesondere bei der Gestaltung verschiedene Behandlungen für die klinische Anwendung und die Untersuchung der DNA-Funktion setzen.

Zeitliche Unterbrechung der Zellmembran durch mechanische Reize ist eine Alternative zur Einführung von Fremdmolekülen in die Zellen. Techniken umfassen: Mikroinjektion von Molekülen 7, Elektroporation unter Verwendung eines elektrischen Feldes, um die Membran 8,9 stören Sonoporation mit Ultraschallwellen, um die Zellmembran 10-12, Partikelbeschuss stören, wie durch das "Gen-Kanone", die Teilchen gebunden schießt nachgewiesen Gene in der Zelle 13, und in jüngster Zeit die Anwendung von Schubspannung, die gezeigt worden ist, zeitlich permeabilisiert Säugerzellen 14,15. Obwohl Mechanikeral Methoden vermeiden einige der oben genannten Probleme, werden sie in der Regel durch geringere Wirkungsgrade und sehr komplexen und spezialisierten Setups begleitet. Ein Atmosphärendruck-Glimmentladung Brenner (APGD-t) wurde an der McGill mit dem anfänglichen Ziel der Funktionalisierung von Oberflächen-und Abnahme adhärenten Zellen in vitro 16 entwickelt. Serendipitously wurde entdeckt, dass eine lebend / tot-Färbung verwendet wurde, irgendwie in die von Zellen ohne Permeabilisierung Mittel versetzt entnommen. Außerdem schien dies nur in eingeschränkten Bereichen der Vertiefungen, die mit der Fackel Pfad übereinstimmen passiert aufgetreten. Untersuchung der Permeabilisierung Fähigkeiten des APGD-t fortgesetzt und in Kontrollstudien wurde festgestellt, daß die Träger inerten Gasstrahl des Plasma ohne Anregung war auch in der Lage, Zellen zu permeabilisieren. Dies wider die anfängliche Hypothese, dass die durch den Plasmastrahl reaktiven Spezies vorübergehend das Membranfunktion beeinträchtigt und schlug vor, einfach die mechanischeschen Kräfte waren ausreichend, um Zellpermeabilisierung verursachen. Von hier, in unserem Labor weiter Studien zu versuchen und zu quantifizieren und charakterisieren die Permeabilisierung Effizienz eines inerten Gasstrahl sowie Blick auf seine Fähigkeiten Transfektion 16.

Durch diese Untersuchungen wurde gefunden, dass Mikroporen in der Tat in Form der Plasmamembran, und diese Poren neigen dazu, innerhalb von etwa 5 Sekunden 15 verschließen. Wir haben Nützlichkeit der Technik der in vitro und in vivo in der Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos zeigten.

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Protocol

1. Entwicklung von LabVIEW-Programm

  1. Ein Massendurchflussregler (MKS M100B Masse-Flo-Controller) mit dem Heliumgasleitung angebracht, um eine präzise Gasflussrate zu gewährleisten. Diese Einheit wird von einer Eingangsspannung gesteuert wird, die zwischen 0 und 5 V. Eine Steuerschleife in der LabVIEW-Programm bestimmt die erforderliche Spannung zu einem bestimmten Zeitpunkt. Schnittstelle zwischen dem Computer und der Mengendurchflusssteuerung wird durch eine Datenerfassungseinrichtung (NI USB-6009) durchgeführt und eine 12-V-Stromversorgung versorgt den Massendurchflussregler.
  2. Zwei Positionierungslinearführungen werden verwendet, um die Bewegung der Platte mit 6 Vertiefungen, einer für jede Richtung zu steuern. Jede Einheit besteht aus einer MA15-Serie Velmex Unislide Versammlung gekoppelt mit einem Schrittmotor und die beiden Baugruppen werden von einem einzigen Velmex VXM Schrittmotor-Controller gesteuert. Der Controller ermöglicht die manuelle Joggen jedes Motors oder akzeptiert eine Reihe von externen seriellen Befehle, deren Kombination ermöglicht gezielte Bewegung patterns. Mehrere Muster können in die LabView-Programm programmiert werden, dass der Benutzer nur die gewünschte Brennergeschwindigkeit sowie die Pfad Abmessungen liefern.

2. Vorbereitung der Ausrüstung

  1. Öffnen Sie sowohl die Helium-Flasche und Atemregler.
  2. Schalten Sie den Motor-Controller.
  3. Öffnen Sie das LabView Programm und alle Bedingungen zu überprüfen.
  4. Achten Sie darauf, die Plattform zentriert ist. Um zu überprüfen, sehen sich an Motorstufe und sicherstellen, dass jeder Wagen ist entweder nicht in der Nähe der Bühne Ende. Entweder haben das Programm Mitte die Wagen oder manuell, indem Sie die Jogging-Bedienelemente auf der Vorderseite der Motorsteuerung anpassen.
  5. Wenn dies der erste Lauf des Tages, ist es empfehlenswert, das Programm einmal ohne Zellen laufen, um sicherzustellen, das Setup richtig funktioniert.

3. Herstellung des Gasstrahls Kapillardüse Höhe

  1. Entfernen Sie die Kapillare aus der Halterung und die Höhe Null Zifferblatt.
  2. Legen Sie die 6-Well-Platte on die Plattform.
  3. Ersetzen und senken den Gasstrahl Kapillare auf den Grund des Brunnens, bis es das Deckglas trifft. Sichern Sie die Kapillare in die Halterung.
  4. Über die Höhe Zifferblatt, erhöhen die Kapillare 3 mm. Markieren Sie diese Höhe auf der Kapillare Basis.
  5. Heben Sie die Kapillare auf eine sichere Höhe und dann die 6-Well-Platte.

4. Zellpermeabilisierung Protokoll

  1. Kultur adhärenten Zelllinie, auf Glasabdeckung Konfluenz rutscht in einer 6-Well-Platte mit Standard-Kulturtechniken. Für HeLa-Zellen, Samen Platten mit 6 Vertiefungen mit 2 × 10 5 Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 48 h vor der Behandlung.
  2. Bereiten Sie entsprechende Volumen der Lösung, die das gewünschte Vektor. Für hrGFPII-1, eine Konzentration von 50 ng / ul in 1x PBS bietet eine starke Fluoreszenzsignal in HeLa-Zellen 24 Stunden nach der Transfektion. Für Dextran Studien wird 80 pg / ml 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran empfohlen. Von nun an wird diese Lösung zu einer bezeichnets "Vektor-Lösung."
  3. Entfernen von Zellkulturmedien von gut und spülen dreimal mit 1x PBS.
  4. Pipettieren 1370 ul Vektor Lösung in Schritt 4.2 in gut vorbereitet. Dies sollte in einer Flüssigkeitstiefe von ca. 1,3 mm führen.
  5. Zeigen die auch den Vektor enthaltenden Lösung in der Mitte der Plattform. Senken Sie den Gasstrahl Düse auf die zuvor markierten Ebene einen Düsenhöhe von 3 mm über der Folie angezeigt wird.
  6. Stellen Helium Strömungsgeschwindigkeit in der LabView-Programm und wählen Sie die gewünschte Bewegungsmuster verwendet werden. Wählen Sie "Ausführen", wenn Sie bereit sind, um die Permeabilisierung Protokoll beginnen. Es wird eine anfängliche Verzögerungszeit, während der die Massenstrom-Steuer bereitet die notwendige Strömungsgeschwindigkeit bereitzustellen. Sobald die entsprechende Durchflussmenge erreicht ist, wird der LabView-Programm die Schrittmotoren zu aktivieren, die auch in der gewünschten Permeabilisierung Muster zu bewegen. Sobald die Plattform angehalten hat, warten Sie etwa 30 Sekunden und entfernen Sie den Vektor-Lösung.Hinweis: Optimale Permeabilisierung erfolgt an einem Staudruck von 100 bis 200 Pa am Düsenaustritt je nach Durchmesser der Kapillare.
  7. Gut mit 1x PBS waschen dreimal.
  8. Füllen gut mit frischem Kulturmedium.
  9. Wiederholen Sie die Schritte von 4,3 bis 4,6 für die gewünschte Anzahl von Experimenten. Hinweis: Achten Sie darauf, Kontrollproben, die von Brunnen, die mit dem Vektor-Lösung ohne den Gasstrahl wird über sie laufen bestehen gefüllt sind. Die Lösung ist in den Kontrollvertiefungen für ca. 1 min dann zu den Schritten 4.5 und 4.6 gehen.
  10. Arbeiten Sie mit einem hrGFP Transfektionsexperiment, kehren 6-Well-Platte für 24 Stunden Inkubator, damit transfizierten Material von den Zellen transkribiert werden. Wenn Sie mit einem Dextran Permeabilisierung Experiment zurück 6-Well-Platte für 15 min Inkubator.

5. Cell Imaging

  1. Wenn gewünscht, unmittelbar vor der Bildgebung, Kontrastfärbung mit entsprechenden Live / Dead-Färbung, um den Zelltod zu evaluieren.
  2. Bild Zellen mit angemesriate Mikroskop der Transfektion / Permeabilisierung Wirksamkeit zu untersuchen.

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Representative Results

Permeabilisierung von HeLa-Zellen mit 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran mit einem Heliumgasstrahl mit einem Innendurchmesser von 0,86 mm Kapillare ist in Fig. 1 gezeigt. Die Zellen wurden unmittelbar nach Permeabilisierung mit 2 ul / ml EthD-1-Lösung (LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit), um den Zelltod zu visualisieren gegengefärbt. Unmittelbar nach Gegenfärbung wurden die Deckgläser angebracht und abgebildet. Diese Figur zeigt Ergebnisse der Ausführung des Heliumgasstrahl auf drei verschiedenen Ausgangsdrücke im Vergleich zu einer Kontrollprobe. Beachten Sie, dass die Permeabilisierung der Spurbreite und die Effizienz erhöht mit einem höheren dynamischen Druck und Zelltod zeigte nur eine leichte Steigerung (A und B). Allerdings, wenn ein hoher Staudruck erreicht war, HeLa-Zellen wurden aus den Deckgläsern ausgezogen und sehr wenig Peripherie Permeabilisierung aufgetreten. Eine detailliertere Analyse der Zell Abisolieren und Transfektionseffizienz wurde zuvor durch Chouinard geführt-Pelletier et al. 15

Durch rasterelektronenmikroskopische Studien wurden die Mikroporen in der Zellmembran (Fig. 2) beobachtet. Permeabilisierung der HeLa-Zellen wurde unter Verwendung eines Helium-Gasstrahl mit 0,86 mm Innendurchmesser Kapillare an einen Ausgangsdruck von 300 Pa Nach der Permeabilisierung Protokoll wurden die Zellen sofort mit einer 1% Paraformaldehydlösung in 1x PBS fixiert.

Figur 1
Fig. 1 ist. Permeabilisierung von HeLa-Zellen mit 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran mit einem Heliumgasstrahl mit einer Kapillardüse Innendurchmesser von 0,86 mm. Dextran leuchtet grün und tote Zellen rot fluoreszieren. A) Dynamische Druck von 100 Pa, B) von 135 Pa, und C ) von 175 Pa D) Control mit Dextran but keine Engagements in Heliumgasstrahl.

Figur 2
2. REM-Aufnahmen bei einer Vergrößerung von 50.000 X der Oberfläche von HeLa-Zellen nach Permeabilisierung Gasstrahl bei 300 Pa) Kontrollprobe eine glatte Zelloberfläche aufweisen. B) Oberfläche der permeabilisierten Zelle, die eine Pore mit einem 84 nm Durchmesser. Klicken Sie hier, um Bild vergrößern Bild .

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Discussion

Schutzgasstrahl Permeabilisierung ist eine nützliche Technik für adhärenten Zell Transfektion. Es bietet die Möglichkeit, Biomoleküle in Zellen unter Verwendung von mechanischen Kräften, die die Notwendigkeit einer potentiell schädlichen Chemikalien oder virale Vektoren beseitigt übertragen. Die Technik könnte möglicherweise geben Forscher und Kliniker eine effiziente und relativ einfache Möglichkeit, genau Transfektion von Zellen. Die Selektivität der Permeabilisierung ist auch einzigartig so dass die Forscher nur bestimmte Zellen zu behandeln in einer einzelnen Kolonie, die nützlich in vielen Anwendungen sein könnte.

Mehrere Parameter können für einzelne Experimente wie Kapillardüse Durchmesser und Winkel, Gasströmungsrate und Flüssigkeitshöhe Kapillare, Zelllinie, Ziel-Biomolekül verwendet werden, und die Art von Inertgas eingestellt werden. Ein Satz Füllstand und kapillare Höhe in dem Verfahren beschrieben worden, und diese Werte wurden gewählt, um die Anzahl der Variablen im experime zu minimierennts. Derzeit sind wir die Modellierung der experimentellen Strömungssystem mit Visualisierung und Computational Fluid Dynamics. Dies gibt uns ein besseres Verständnis für die auf die Zellen vermittelten Kräfte, so dass wir die Permeabilisierung die Abhängigkeit von Variablen wie die flüssigen Eigenschaften zu bestimmen.

Es ist wichtig zu beachten, der maximale dynamische Druck, unter dem die Zellen überleben können, zu nehmen. Es wurde gefunden, dass, wenn dynamische Drücke genähert 200 Pa für eine Gasstrahldüsenhöhe von 3 mm, wurde wahrscheinlich HeLa-Zell Strippen. Dies stimmt mit anderen Studien wie Lu et al. NR 6, die WT-Fibroblasten-Zellablösung bei 200 bis 265 Pa 17 beobachtet. Wenn große Mengen an Strippen auftreten, sollte eine niedrigere Gasdurchsatz dieses Problem zu lindern. Ebenso führen hohe Durchflussraten in Zelltod und falsch-positive Ergebnisse Permeabilisierung. Sobald Zellen abgestorben sind sie durchlässig werden, um Moleküle und damit abgestorbene Zellen können verwechselt permeabilisiert lebenden Zellen sein. Eswird daher empfohlen, eine Live / Dead-Test durchzuführen, um sicherzustellen, dass die permeabilisierten Zellen sind in der Tat noch am Leben. Tod steigt mit zunehmendem Druck und unserem Labor festgestellt, dass bei 390 Pa die Mehrheit der permeabilisierten HeLa-Zellen tot waren 15. Lebensfähigkeit der Zellen über einen längeren Zeitraum ist ebenfalls untersucht worden, mit hrGFPII-1-Expression, während bis zu 72 Stunden nach der Permeabilisierung (Daten nicht gezeigt) beobachtet. Weitere Studien werden derzeit durchgeführt, um die Lebensfähigkeit zu noch mehr Zeitpunkten zu untersuchen.

Unsere Hypothese ist, dass die Fluid-Scherbelastungen der Zellen, die durch den Gasstrahl und der Verschiebung der Medien zu vorübergehenden Störung der Zellplasmamembran. Dies ist der gleiche Mechanismus für die andere, komplexere physikalische Methoden, wie Mikroblasenkollaps und Sonoporation 18 vorgeschlagen. Die Betriebsbedingungen für dieses Verfahren von der Art der Zellen, die Befestigung an dem Substrat, der mechanischen Eigenschaften der Zelleund Zellwand-, Molekül von Interesse, die Eigenschaften der Flüssigkeit und des Gases, und die physikalischen Abmessungen der Einrichtung. Durch Größenausschluss-Studien haben wir gefunden, daß Dextran-Moleküle größer ist als 40 kDa sehr geringe Effizienz und Permeabilisierung, dass eine optimale Größe Dextran 10 kDa für Experimente 15. Dies ist wichtig, da sie die Größe der Moleküle, die in Zellen unter Verwendung dieses Protokolls durchlässig gemacht werden können, begrenzt. Bisher haben wir nur untersuchten die Eigenschaften der Transfektion von Plasmiden. Weitere Studien werden ob größere Stücke von genetischem Material, das unter Verwendung dieser Technik transfiziert sind.

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Disclosures

Die Autoren erklären, sie haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgements

Die Autoren möchten die folgenden Finanzierungsquellen haben: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vitality hrGFPII-1 Agilent Technologies Canada 240143-57 Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable Life Technologies Inc. D22910 dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Life Technologies Inc. L3224 for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent Invitrogen P36930 for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium Praxair Canada Inc. HE 5.0UH-T  
Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml Thermo Scientific SH30022.01 for HeLa cells
Fetal Bovine Serum Invitrogen 26140079 For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid Invitrogen 15140-122 For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x Produced in lab
  Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates Corning 3506  
#1 22 x 22 Coverslips Fisher 12-542B  
Glass Capillaries World Precision Instruments WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller MKS M100B01314CS1BV Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device National Instruments 779026-01  
UniSlide Assembly with stepping motor and controller Velmex Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
  Table 2. List of required equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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