محرك عانى من قطع الأعصاب والوقت الفاصل بين التصوير من السلوكيات الخلايا الغروية في اسماك الزرد لايف

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

على الرغم من أن الجهاز العصبي المحيطي (السندات الإذنية) قادرة على إصلاح كبيرة بعد الإصابة، لا يعرف إلا القليل عن الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم هذه الظاهرة. باستخدام الحية، الزرد المعدلة وراثيا واستنساخه العصبية مقايسة عانى من قطع، يمكننا أن دراسة ديناميكية سلوكيات الخلية الدبقية خلال تنكس الأعصاب والتجدد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish. J. Vis. Exp. (76), e50621, doi:10.3791/50621 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

غالبا ما يوصف الجهاز العصبي كمكون يصعب السلكية من الجسم على الرغم من أنه هو نظام الجهاز السوائل إلى حد كبير أن يتفاعل مع المؤثرات الخارجية بطريقة متسقة وبطريقة نمطية، مع الحفاظ على المرونة لا يصدق واللدونة. وخلافا للنظام العصبي المركزي (CNS)، النظام العصبي الطرفي (المحيطي) قادر على إصلاح كبيرة، ولكننا قد بدأت لتوها لفهم الآليات الخلوية والجزيئية التي تحكم هذه الظاهرة. باستخدام الزرد كنظام نموذج، لدينا فرصة غير مسبوقة لدراسات التجدد زوجين مع التصوير في الجسم الحي والتلاعب الجيني. وتتكون الأعصاب الطرفية من محاور عصبية محاطة بطبقات من الخلايا الدبقية والنسيج الضام. ومغمد محاور عصبية من قبل myelinating أو غير myelinating خلايا شوان، والتي هي بدورها ملفوفة في كراسة من قبل غمد الخلوية تسمى perineurium. اثر اصابة والأعصاب الطرفية الكبار لديها قدرة فائقة على ريمولقد تضررت الحطام المحاور والأهداف إعادة يعصب. للتحقيق في أدوار جميع الدبقية الطرفية في الجهاز العصبي المحيطي التجديد، وصفنا هنا مقايسة عانى من قطع محور عصبي يستخدم ليزر صبغ المتاحة تجاريا النيتروجين ضخها إلى axotomize الأعصاب الحركية في الزرد المعدلة وراثيا حية. نحن تصف مزيد من الطرق لزوجين هذه التجارب إلى الوقت الفاصل بين التصوير من الأعصاب الجرحى والسيطرة. هذا النموذج التجريبي يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط بالدور الذي تقوم به الخلايا الدبقية في تجديد العصبية، ولكن يمكن أيضا أن تكون منصة لتوضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في إصلاح الجهاز العصبي.

Introduction

وقد استخدمت على نطاق واسع الزرد لدراسة تطور الجهاز العصبي بسبب الشفافية البصرية الخاصة بهم وسهولة نقل الجينات، التي عندما يقترن، تسمح للتصوير مذهلة من السلوكيات خلية حيوية في جنين المعيشة. بالإضافة إلى ذلك، لأن الزرد والثدييات مشاركة ما يقرب من جميع الجينات اللازمة لتكوين الجهاز العصبي، والمعلومات الخلوية والجزيئية التي تم جمعها في هذا النموذج الحي هو relatable مباشرة على أنواع الفقاريات الأخرى. وعلى الرغم قوية بشكل لا يصدق للدراسات التنموية العصبية، والزرد وسمات فريدة من نوعها لديها القدرة أيضا لتوضيح الآليات التي تحافظ على وإعادة بناء الجهاز العصبي بعد الإصابة. اليرقات الزرد الحفاظ على شفافية بهم إلى مراحل اليرقات في وقت متأخر وتصبغ يمكن أن يكون قد تم حظره بشكل فعال مع إما استخدام مثبطات الدوائية من إنتاج الميلانين أو طفرات الجينية التي تفتقر الخلايا الصبغية. وهكذا، وذلك باستخدام هذا النموذج الحي لدراسة الإصابات وregeneratايون في الحيوانات الأكبر سنا هو ممكن ويوفر فرصة فريدة للتحقيق مباشرة الآليات الخلوية والجزيئية التي إعادة بناء الجهاز العصبي. في هذا المخطوط، ونحن تصف كيفية تجرح بكفاءة وبتكاثر الأعصاب في الجهاز العصبي المحيطي من اليرقات الزرد. هذا النموذج إصابة يفسح المجال لدراسة انحطاط فحسب، بل أيضا ردود الدبقية الطرفية والخلايا المناعية وكذلك التفاعلات بين هؤلاء السكان خلال تجديد.

الجهاز العصبي المحيطي هو عبارة عن شبكة معقدة من الأعصاب الحسية الحركية وما هو ضروري لتمرير المعلومات بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) والجلد والأجهزة والعضلات من الجسم، مما يسمح للكائن الحي للتفاعل مع بيئته والبقاء على قيد الحياة. على طول هذه الأعصاب، الدبقية المحيطية، بما في ذلك myelinating وغير myelinating خلايا شوان والدبقية ظهارة الحزمة العصبية، وكذلك النسيج الضام، يغلف محاور عصبية وتشكل في نهاية المطاف العصب ناضجة. إصابة هذه الأعصاب يبدأ عملية Known كما ولري تنكس 10. هذه الآلية من تجزئة محور عصبي، والتوظيف المناعة، وإزالة الحطام والتجديد هو نمطي جدا ومنظم وراثيا 1. وقد وصفت دراسات السابقة في نظم الثدييات أدوار خلايا شوان خلال تنكس الأعصاب وتجديد 1، 2، 6، 8. في هذه الدراسات من الأنسجة الثابتة أو زراعة الخلايا، وخلايا شوان تجنيدهم ليس فقط الضامة إلى موقع الإصابة للمساعدة في إزالة الحطام، ولكن ساعد أيضا في المايلين البلعمة أنفسهم. في حين كانت هذه الدراسات لا يصدق مفيدة، لدينا أبدا من قبل الاستجابات الدبقية تصور للإصابة محوار الطرفية في الجسم الحي في الوقت الحقيقي، وحققت توجد دراسات أخرى العلاقة بين فئات مختلفة من الخلايا الدبقية الطرفية خلال هذه الأحداث.

في الآونة الأخيرة، حققت عدة مختبرات wallerian انحطاط باستخدام الزرد وإصابة اكسون الليزر بوساطة مماثلة إلى ما وصفنا هنا 4، 5، 9. في دراسة أخرى، والتي هي مشابهة جدا لمنطقتنا، ومقطوع محاور عصبية حادة داخل العصب المحرك بطني في اليرقات البالغة من العمر 5 أيام باستخدام نظام التذرية الليزر المتاحة تجاريا 7. في كل من هذه التجارب مجموعة عمليات، كان التركيز على wallerian انحطاط وكلا محاور عصبية وخلايا مناعية تم تصوير. التوسع في هذه الدراسات، ونحن تصف إصابة المحاور الحركية في اليرقات الأكبر سنا مع أكثر نضجا والأعصاب العصبي وفحص مدى استجابة كل الدبقية الأعصاب الطرفية المرتبطة خلال انحطاط والتجدد.

للقيام بذلك، ونحن القطع الأعصاب الحركية في 6 و 7 أيام الإخصاب آخر (DPF) يرقات وتصور استجابات السكان الدبقية الفردية، وكذلك التحقيق في التفاعلات بين هؤلاء السكان على طول محاور عصبية المصاب. باستخدام هيئة تنظيم الاتصالات المزدوجة والثلاثيةخطوط nsgenic أن تسمية الخلايا الدبقية المحيطية، بما في ذلك خلايا شوان والدبقية ظهارة الحزمة العصبية، فضلا عن علامة للحصول على محاور عصبية، ونحن نستخدم نظام التذرية الليزر المتاحة تجاريا يتكون من النيتروجين ضخ صبغة الليزر (الطول الموجي 435 نانومتر) تعلق على نظام القرص الغزل مبائر لإنشاء transections محور عصبي. هذا التجريبية انشاء يتيح لنا أن تصور الحية، الزرد اليرقات، تجرح الطرفية مساحات محوار موتور محددة والصورة الوقت الفاصل بين استجابات السكان الدبقية متميزة للإصابة محور عصبي وعلاقتها مع بعضها البعض. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لخلق مزيد من الإصابات العصبية في الزرد من مختلف الأعمار، مع خطوط المعدلة وراثيا مختلفة أو طفرات وراثية لمعالجة المسائل العلمية المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وتركيب الأجنة الزرد لتذرية وتصوير لايف

  1. إعداد مخزون من 0.8٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في الماء البيض. قسامة إلى 13X 100 ملم أنابيب القابل للتصرف ثقافة وتخزينها في 4 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
  2. الزرد الكبار الصليب تحتوي على الجينات المحورة ثابت متكاملة لتسمية fluorescently الخلايا العصبية الحركية وأنواع الخلايا الدبقية من الفائدة. جمع الأجنة الزرد في الماء البيض ووضعه في 28.5 درجة مئوية حاضنة للانطلاق الصحيح في وقت لاحق 3.
  3. وفي حوالي 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، إزالة الماء البيض وإضافة 0.002٪ 1-2-فينيل ثيوريا (PTU) في الماء البيض. عودة الأجنة إلى الحاضنة.
  4. بين 24 و 96 HPF، يجب فحص الأجنة لوجود الجينات المحورة المطلوب على نطاق تشريح فلوري. وضع الأجنة المختارة في المياه العذبة البيض PTU والعودة إلى الحاضنة.
  5. عندما وصلت إلى يرقات 6 أيام آخر الإخصاب (DPF) (أو السن المطلوب)، بإزالتها من الحاضنة، حدد اليرقات قليلة للتركيب، ونقلها إلى طبق أصغر.
  6. إزالة الماء من الطبق واستبدالها فورا مع ما يقرب من 0.02٪ Tricane في PTU المياه البيض. تسمح اليرقات على الجلوس في مخدر حوالي 5 دقائق.
  7. وضع قسامة من 0.8٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في كوب مع ماء الصنبور والميكروويف لمدة 30 ثانية، أو حتى ذاب الاغاروز. تسمح الدورق ليبرد حتى الاغاروز في أنبوب الثقافة يشعر فاتر لمسة (لا ساخنة).
  8. حدد اليرقة تخدير وتحويلها إلى 35 مم طبق أسفل الزجاج واحدة أو متعددة أيضا. إزالة أي المياه التي تم نقلها مع يرقة، ثم يغطى فورا اليرقة مع ما يكفي من الاغاروز الحارة لملء جزء الزجاج ذات قاع الطبق ولكن ليس إنشاء قبة كبيرة.
  9. كما يصلب الاغاروز، استخدام إبرة تشريح لوضع اليرقة على جانبها في قاع الطبق، ثم إمالة اليرقة فقط قليلا على ظهرها. لا بد للإصابة والتصوير لاحقة، أناليرقة التي شنت أن لمس الزجاج على الجزء السفلي من الطبق. استخدام إبرة تشريح للحفاظ على يرقة في هذا الموقف حتى يتم عززت agarose ويجمد اليرقة.
  10. بمجرد تصلب الاغاروز تماما، ماصة ببطء المياه Tricane بما فيه الكفاية (وهذا يمكن أن يكون هو نفسه Tricane تستخدم للتخدير) في طبق لتغطية كامل الاغاروز واليرقة.

2. معايرة الليزر واختبار

  1. تشغيل جميع الأجهزة متحد البؤر المجهر، وأشعة الليزر الصمام الثنائي المناسب لالجينات المحورة الزرد مثيرة، والنيتروجين ضخ ليزر الصبغة. تأكد من أن شعاع "على بياض" الخائن هو في مكان، والمخفف ليزر مفتوح تماما، ونانومتر الكومارين خلية الصبغة 435 هو في مكان. على الكمبيوتر، فتح برامج التصوير.
  2. نقل 63X 1.2NA الهدف الغمر بالماء في الموقف وتطبيق قطرة صغيرة من الغمر المتوسطة لتحقيق أهداف الماء على الهدف. وسيكون الهدف 63X تسمح للخير ليزر دقة الاجتثاث، والمياه طmmersion يسمح لمسافة عمل أكبر، وهو أمر ضروري عند العمل مع 6-7 DPF اليرقات الزرد.
  3. الحصول على شريحة زجاجية مع جانب واحد معكوسة لاستخدامها لمعايرة من الليزر. ضع الشريحة، مرآة جانبية أسفل، على خشبة المسرح المجهر.
  4. باستخدام العدسة تحت إضاءة brightfield، والعثور على وتركز على خدش أو حفر في المرآة. ضوء brightfield سيتم ساطع يسقط على شريحة زجاجية، ولكن لن يمر إلا من خلال لهدف في الأماكن التي تم خدش المرآة أو محفورا بعيدا، مما تسبب في المرآة لتبدو سوداء من خلال العدسة، وختوم لتبدو وكأنها بقع أو خطوط من الضوء.
  5. عرض وتركيز ختوم على شاشة الكمبيوتر باستخدام برامج التصوير. فتح النافذة التي تسيطر على معايرة الليزر وإعدادات الطاقة. تعيين عدد النبضات إلى "1" و لوحة توهين إلى "3" انتقال٪. عدد نبضات يمثل عدد المرات فإن الليزر اطلاق النار داخل كل منطقة من الفائدة (ROI) وانتقال٪ يمثل قوة الليزر. تأكد من تحديد الإعداد المعايرة الصحيحة لل63X 1.2NA الهدف الغمر بالماء.
  6. حدد أداة القطع الناقص من شريط الأدوات الرئيسية، وانقر على الصورة على شاشة الكمبيوتر لإنشاء ROI دائري واحد. هل هذا 3 مرات أكثر حتى هناك 4 رويس دائرية متباعدة بشكل عشوائي فوق الصورة.
  7. ويمكن أن تشمل بعض النظم ميزة السلامة التي لن تسمح ليزر لاطلاق النار إذا كان مسار الضوء إلى خلال oculars مفتوح. إذا كان هذا هو الحال، يدويا إغلاق مسار الضوء إلى خلال oculars في هذا الوقت.
  8. إطلاق الليزر. هذا سيخلق 4 ختوم بقعة صغيرة، 1 ضمن كل ROI دائرية. إذا لا يتم إطلاق الليزر، وتحقق للتأكد من تشغيل الليزر على ومتصلة بشكل صحيح، وأنه تم إغلاق مسار الضوء إلى خلال oculars. إذا رأيت حرائق الليزر ولكن لا الحفر، تحقق للتأكد من أن "على بياض" شعاع الفاصل هو في مكان. إذا كان كل شيء في مكانه، وزيادة قوة الليزر و"FRAP" حتى ختوم عه مرئية. إذا طاقة الليزر وضع أكبر من 10 ضروري لحفر الزجاج، وهذا قد يشير إلى خرطوشة بلازما الليزر يحتاج إلى استبداله.
  9. إذا ظهرت بقع محفورا تركزت داخل رويس المحددة، لا المعايرة ضروري (المضي قدما إلى 2.12). إذا لم يتم توسيط البقع، يحتاج إلى تحديث الإعداد المعايرة.
  10. لمعايرة، انقر فوق التحديث الإعداد المعايرة. سوف الليزر اطلاق النار وسوف تظهر صورة تحتوي على نقطة واحدة المحفور. إذا لم يظهر نقطة، إلغاء المعايرة، وزيادة قوة الليزر، وبدء المعايرة مرة أخرى.
  11. انقر في وسط بقعة. سوف الليزر إطلاق النار مرة أخرى، وسوف تظهر نقطة أخرى. انقر فوق هذه النقطة، وتكرار هذه العملية حتى اكتمال المعايرة وتظهر بقع 9 بطريقة الشبكة. كرر الخطوات من 2،6-2،9 للتأكد من أن المعايرة كانت ناجحة.
  12. إزالة شريحة زجاجية من مرحلة المجهر وتنظيف الهدف. فتح مسار الضوء إلى مكتب تعزيز الوحدةلارس، واستبدال "على بياض" الخائن شعاع مع "بنسبة 100٪ ILL" الخائن شعاع.

3. عانى من قطع العصب عن طريق تذرية الليزر والوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر من السلوكيات الخلايا الغروية

  1. إزالة مرحلة تستخدم لعقد الشريحة الزجاجية واستبدالها مع مرحلة مناسبة لعقد 35 ملم الأطباق الزجاجية القاع. الاستمرار في استخدام 63X 1.2NA الهدف الغمر بالماء.
  2. ضع قطرة صغيرة من متوسطة غمر المياه لهذا الهدف، ووضع الطبق مع اليرقة التي شنت على خشبة المسرح. تحقيق الاستقرار في طبق مع لقطات.
  3. باستخدام العدسة والإضاءة widefield، والتركيز اليرقة وتحديد الأعصاب الحركية. مسح الأعصاب في hemisegments 10-20 وتحديد العصب المحرك للعانى من قطع.
  4. إحضار الحية بالنظر إلى العصب على شاشة الكمبيوتر باستخدام برامج التصوير. اختر Z-الطائرات والحصول على صورة من محاور عصبية وخلايا الدبقية من العصب لم يصب.
  5. إعداد إعدادات الوقت الفاصل بين التصوير في برامج التصوير لالتقاطZ-التوقعات من جميع أنواع الخلايا في فترات دقيقة 5-30، اعتمادا على التجربة. فمن الأفضل لتهيئة جميع الإعدادات اللازمة لمرور الوقت قبل تنفيذ الاجتثاث، حتى لا يكون هناك أي تأخير في بدء الفاصل بين وقت وقوع الضرر مرة واحدة كاملة.
  6. إزالة "بنسبة 100٪ ILL" الخائن شعاع واستبدال "على بياض". إغلاق مسار الضوء إلى خلال oculars.
  7. العودة إلى طريقة العرض الحية من العصب. استخدام قناة الفلورسنت المناسب لعرض المحاور التي سيتم مقطوع.
  8. باستخدام أداة القطع الناقص، إنشاء ROI بيضاوي الشكل رقيقة في المنطقة ليكون ذاب، ثم خلق رويس أصغر داخل المنطقة المحددة.
  9. في النافذة التي تسيطر على إعدادات الليزر، وتعيين عدد النبضات إلى "2" ولوحة توهين إلى "18" نقل٪. اطلاق النار ليزر داخل رويس المحددة. إذا كان لا يزال مضان داخل رويس، وزيادة قوة الليزر، وانتظر حوالي 10 ثانية، واطلاق النار ليزر مرة أخرى. القيام بذلك حتى تصل إلى الإعداد الذي يسبب fluorescenCE لتختفي داخل رويس.
  10. انتظر 10 ثانية أو أكثر والتحقق من منطقة ذاب مرة أخرى لمضان. حذار أن العائد على الاستثمار قد يبدو في البداية ذاب، عندما هو في الواقع photobleached. في حالة عودة مضان، وزيادة قوة الليزر واطلاق النار ليزر مرة أخرى. كرر هذا حتى الإزهار يختفي داخل رويس ولا العودة في غضون 10 ثانية. فمن الأفضل أن تبدأ مع قوة الليزر أقل وزيادة في الطاقة اللازمة. قد تختلف قوة الليزر اللازمة استنادا إلى الأنظمة الفردية المجهري، عمر صبغ الكومارين، عينة تصاعد مستمر، وعمر اليرقات، وسمك الأنسجة. مرة واحدة وقد تم إنشاء قوة الليزر مثالية، ويمكن استخدام هذا الإعداد الطاقة مرة أخرى على الأعصاب اللاحقة في التجربة نفسها.
  11. بمجرد الانتهاء من الاجتثاث، وتبدأ الوقت الفاصل بين التصوير.
  12. عندما الفاصل بين وقت اكتمال، واستخدام برامج التصوير لتجميع البيانات وخلق لون مركب Z-التوقعات لكل نقطة زمنية. خلق فيلم كويك تايم لتحليل السلوكمن محاور عصبية وخلايا الدبقية في وقت واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مقايسة الموصوفة هنا يمكن استخدامها لتقييم مدى استجابة الخلايا الدبقية وغيرهم من السكان الخلايا العصبية المرتبطة إلى إصابة محور عصبي في الجسم الحي. الفيلم 1 يبين مثالا لإصابة العصب التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطريقة واستجابة الخلايا الدبقية المحيطة. تم إجراء هذه التجربة في تيراغرام (nkx2.2a: megfp)؛ تيراغرام (olig2: dsred) الزرد، التي الدبقية ظهارة الحزمة العصبية تعبر عن غشاء استهدفت DSRed EGFP والخلايا العصبية الحركية صريحة عصاري خلوي. وقدم الإصابة على طول الإسقاط منقاري من العصب المحرك الجذع في الزرد الحية 6 DPF، وكان العصب بعد ذلك الوقت الفاصل بين تصويرها في كل من EGFP وقنوات DSRed. هذا التصور في وقت واحد المسموح به من محور عصبي والسلوكيات الخلية الدبقية مباشرة بعد الإصابة.

ويبين الشكل 1 لا تزال صور ساكنة الوقت نقاط مأخوذة من الفيلم 1. يبين القطع الناقص منقط العائد على الاستثمار الذي تم ذاب باستخدام الليزر. دقيقة واحدةآخر عانى من قطع (MPT)، تفتقر المنطقة ذاب مضان وقياس منطقة إصابة ما يقرب من 3.5 أم من الداني إلى الجدعة البعيدة. ويمكن التأكد من نجاح الذي عانى من قطع طريق التصوير الجدعة العصب القاصي ويبحث عن علامات انحطاط ولري، بما في ذلك القاصي تجزئة محور عصبي والتخليص السريع. غياب مضان محور عصبي على طول الجدعة البعيدة في الشكل 1 في 120 MPT تشير هذه المحاور قد خضعت بالفعل wallerian انحطاط وكان عانى من قطع ناجحة.

تعديل قوة الليزر إلى بيئة مثالية أمر بالغ الأهمية عند تنفيذ التجارب التذرية الليزر. سوف المثالي إعدادات الطاقة الليزر يجتذ نظيفة العصب فقط داخل ROI المحدد، وسوف إعدادات الطاقة الليزر التي إما أن تكون منخفضة جدا أو مرتفعة جدا تؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل. يبين الشكل 2A الاصابة التي أجريت مع قوة الليزر التي كانت منخفضة جدا. ظلت مضان داخل ROI بعد اطلاق النار ليزر، مما أسفر عن ناقصة 2B عانى من قطع. يبين الشكل الاصابة التي أجريت مع قوة الليزر التي كانت مرتفعة جدا، مما أدى إلى الاجتثاث كبيرة للغاية.

الفيلم 1. موتور عانى من قطع العصب ومتحد البؤر الوقت الفاصل بين التصوير من ظهارة الحزمة العصبية سلوك الخلية الدبقية. يظهر الفيلم العصب المحرك الجذع قبل الإصابة، تليها صورة أخذت 1 MPT، والصور كل 10 دقيقة ليصبح المجموع 190 دقيقة. تم تنفيذ إصابة في حي 6 DPF تيراغرام (nkx2.2a: megfp)؛ تيراغرام (olig2: dsred). اليرقة الزرد مزودة الأمامي إلى اليسار وظهري إلى الأعلى اضغط هنا لمشاهدة الفيلم .

الشكل 1
الشكل 1. محرك عانى من قطع العصب والصور الثابتةمن سلوك الخلية الدبقية. لوحات هي الصور مأخوذة من فيلم 1 لا يزال. يمثل منطقة بيضاوي الشكل المنقط العائد على الاستثمار الذي تم ذاب، وخلق اصابة عانى من قطع الرمز بواسطة خط منقط. نشير إلى رؤوس سهام مضان محور عصبي التي موجود في 10 MPT، ولكن ليس على 120 MPT، مشيرا تدهورت محاور عصبية البعيدة. شريط النطاق، 10 ميكرومتر.

الشكل 2
الشكل 2. دون المستوى الأمثل إعدادات الطاقة الليزر يؤدي إلى نتائج غير مرغوب فيها. (أ) محاولة الاجتثاث يؤديها مع طاقة الليزر الذي هو منخفض جدا. القطع الناقص منقط يدل على العائد على الاستثمار المحددة. 1 MPT كانت منطقة photobleached قليلا وليس مقطوع (رأس السهم). (ب) الاجتثاث يؤديها مع طاقة الليزر التي هي مرتفعة جدا. القطع الناقص منقط تدل على ROI اختيارها. 1 MPT للمنطقة ذاب هو أكبر بكثير من العائد على الاستثمار اختيارها (الخط المنقط). وتتخذ جميع الصور من الحي 6 DPF تيراغرام (nkx2.2a: megfp)؛ تيراغرام (olig2: dsred) اليرقات الزرد مع الأمامي إلى اليسار وظهري إلى الأعلى. شريط النطاق، 10 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية من هذا التصميم التجريبي هي: 1) بشكل صحيح اليرقات المتزايدة للإصابة واللاحقة في الجسم الحي التصوير و2) معايرة الليزر واختيار إعدادات الطاقة الصحيح من أجل خلق الذي عانى من قطع العصب نظيفة ينتج عنه أضرار طفيفة خارج الأنسجة . للمساعدة في ضمان axotomy ناجحة لفي الجسم الحي التصوير والتحليل اللاحق، جبل اليرقات متعددة إما في أسفل الزجاج أطباق فردية أو في طبق زجاجي القاع مع فواصل. بعد معايرة ليزر، ونحن ننصح باختبار إعدادات الطاقة المختلفة على يرقة اختبار لتحديد أفضل المعايير لعانى من قطع العصب. هذه الإعدادات وعادة ما تكون متسقة إلى حد ما بين التجارب، ولكن يمكن أن يتغير إذا: تستخدم 1) لا شنت اليرقات بشكل صحيح، 2) اليرقات من مختلف الأعمار، 3) لا يتم معايرة الليزر بشكل صحيح، 4) ليزر يحتاج صيانة أو 5) إذا كانت موجودة الأعصاب في مختلف جدا مواقف الأمامي الخلفي الذي من شأنه أن يؤديفي الفرق في سمك الأنسجة. ومن شأن عانى من قطع العصب الأمثل خلق إصابة على طول العصب الذي هو بين 2 و 5 ميكرومتر ولا يزعج الأنسجة المجاورة.

عند تحليل استجابة من أي نوع من الخلايا إلى إصابة الجهاز العصبي، فإننا نقترح إجراء لا يقل عن 2 أنواع من عناصر التحكم. الأول هو اختيار المنطقة لتجرح التي هي على الفور بجانب العصب من الفائدة، ولكن لم يتم لمس أي نوع من الأنسجة العصبية. هذا سيسمح لك لتحديد ما إذا هي الاستجابات الخلوية ترى بسبب تلف في العام، أو إلى إصابة محاور عصبية. عنصر التحكم الثاني هو على صورة العصب لم يصب في نفس السمك التي قمت بإنشائها الاصابة. هذا النوع من التحكم يلغي اليرقة إلى يرقة تقلب بسبب المعلمات التدريج والتصوير، بما في ذلك التعرض مرات متحد البؤر للتصوير، الخ

في هذا البروتوكول ونحن أيضا وصف السيناريوهات التي تخلق الإصابات التي هي صغيرة جدا أو كبيرة جدا لدراساتنا خاصة. Depenقرع بشأن مسألة تجريبية، وهذه الأنواع من الإصابات يمكن استخدامها لتحليل. فإن القيود الرئيسية لهذا النوع من الإجراء أن تكون الأهداف المتاحة لإنشاء الإصابة واللاحقة الوقت الفاصل بين التصوير. كبار السن اليرقة التي تستخدمها، والهدف مسافة أطول العمل المطلوبة.

البروتوكول وصفنا هنا يسمح للمستخدم لإنشاء transections العصب التنسيق على طول الأعصاب العميقة في يرقات ناضجة. نحن زوجين هذه التكنولوجيا لفي الجسم الحي، الوقت الفاصل بين التصوير واستخدام نظام التذرية الليزر المتاحة تجاريا التي تخلق بتكاثر إصابات محوار التنسيق. هذه التكنولوجيا يمكن تغييرها لاستخدام خطوط المعدلة وراثيا مختلفة أو يرقات متحولة لاختبار فرضيات مختلفة حول الآليات التي إعادة بناء الجهاز العصبي بعد الإصابة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر مختبر Kucenas لإجراء مناقشات قيمة وتقنيات النصاب القانوني، وشركة للحصول على الدعم الفني رائع. وأيد هذا العمل من قبل صندوق أوفا للتميز في العلوم والتكنولوجيا (فيست) (SK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phenylthiourea Sigma P7629-100G
Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 Argent Chemical C-FINQ-UE-100G
Low melting point agarose Sigma A9414-10G
Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One VWR/Greiner 89125-444
Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick Willco Wells GWSt-3512
MicroPoint Laser System with all components Andor Technology - purchased through Quorum Technologies, Inc. 2203-SYS
MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) Andor Technology MP-27-435-DYE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
  2. Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
  3. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  4. Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
  5. O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
  6. Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
  7. Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
  8. Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
  9. Villegas, R., Martin, S. M., O'Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
  10. Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 423-429 (1849).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics