Isolamento e Caracterização química do lípido A de bactérias Gram-negativas

Chemistry

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Summary

Isolamento e caracterização do domínio de lípido A do lipopolissacárido (LPS) da bactéria gram-negativa proporciona uma visão sobre os mecanismos da superfície celular com base de resistência ao antibiótico, a sobrevivência das bactérias e forma, e como quimicamente lípido A diversidade de espécies moleculares diferencialmente hospedeiras modular respostas imunitárias inatas.

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Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

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Abstract

O lipopolissacárido (LPS) é a maior molécula da superfície celular de bactérias gram-negativas, depositado em monocamada externa da bicamada da membrana externa. LPS pode ser subdividida em três domínios: o distal O-polissacáridos, oligossacáridos um núcleo, e o lípido A domínio constituído por um lípido A espécie molecular e radicais de ácido 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (Kdo). O domínio de lípido A é o único componente essencial para a sobrevivência da célula bacteriana. Após a sua síntese, o lípido A é quimicamente modificado em resposta a tensões ambientais tais como o pH ou da temperatura, para promover a resistência a compostos antibióticos, e para evitar o reconhecimento por mediadores da resposta imune inata hospedeiro. O protocolo seguinte fornece detalhes sobre o isolamento em pequena e grande escala de lípido A de bactérias Gram-negativas. Isolado de material é, então, caracterizada quimicamente por cromatografia em camada fina (TLC) ou por espectrometria de massa (MS). Em adição à matriz assistida por laser de dessorção / ionização-tempo de fluz (MALDI-TOF) MS, que também descrevem em tandem protocolos MS para análise de lipídios A espécie molecular utilizando ionização por electrospray (ESI) acoplado a colisão induzida dissociação (CID) e fotodissociação ultravioleta recém-contratados (UVPD) métodos. Os nossos protocolos MS permitir a determinação inequívoca da estrutura química, fundamental para a caracterização de moléculas de um lípido que contêm modificações químicas únicas ou novos. Nós também descrevem a rotulagem radioisotópica, e posterior isolamento, de lipídios A partir de células bacterianas para análise por TLC. Em relação a protocolos baseados em MS, TLC fornece um método de caracterização mais económica e rápida, mas não pode ser utilizada para atribuir inequivocamente lípido A estrutura química, sem o uso de padrões de estrutura química conhecida. Ao longo das duas últimas décadas, o isolamento e caracterização de lípido A levou a numerosas descobertas interessantes que melhoraram a compreensão da fisiologia das bactérias gram-negativas, os mecanismos de resistência a antibióticoscia, a resposta imune inata humana, e forneceram muitos novos alvos para o desenvolvimento de compostos antibacterianos.

Introduction

O lipopolissacárido (LPS) é a maior molécula de superfície externa de praticamente todos os organismos gram-negativas e consiste de três domínios: um moleculares polissacáridos distal-O antigénio, um núcleo de oligossacáridos, e o lipídicas associadas à membrana Um domínio depositado no folheto exterior da exterior da membrana em bicamada 1,2. O lípido A domínio consiste em 3-desoxi-D-mano-oct-2-ulosonic (Kdo) e resíduos de um lípido A de espécies moleculares, em que o lípido A pode ser definido como a porção solúvel em clorofórmio de LPS durante a hidrólise com ácido fraco 1, 2. O lípido padrão A molécula pode ser quimicamente definido como uma espinha dorsal diglucosamine que é fosforilado e bis-acilado-hexa; consistente com as espécies principais lípido A observados no modelo de organismo de Escherichia coli (E. coli), 1,2. Nove genes expressos constitutivamente, conservadas ao longo de bactérias gram-negativas, são responsáveis ​​pela produção do lípido A do domínio (Figura 1) 1,2. A maioria das bactérias têm um conjunto adicional de genes, que variam em grau de conservação filogenética, que participam de uma nova modificação química de lipídios A 3. Desfosforilação, a remoção de cadeias de acilo, e a adição de porções químicas, tais como os açúcares (por exemplo, idos aminoarabinose) e / ou fosfoetanolamina são as actividades mais comumente observados (Figura 1). Muitas das enzimas responsáveis ​​pela modificação do lípido A são directamente accionados por sinais ambientais, tais como catiões divalentes, ou a sua expressão é regulada por dois sistemas de resposta de regulador do componente 3.

Reconhecimento de espécies de um lípido pelo sistema imune inato hospedeiro é mediada pelo receptor Toll-like factor de diferenciação 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Forças hidrofóbicas entre MD2 e o lípido A cadeias acilo, bem como entre TLR4 e dos grupos de fosfato 1 e 4 de lípido A promovem a forte associação do lábioUm ID com TLR4/MD2 4,5. As modificações que alteram estado acilação ou a carga negativa de lípido A de lípidos com base impacto TLR4/MD2 Um reconhecimento e a jusante da estimulação da resposta imune inata activadores do NF-kB e de mediadores da inflamação, tais como TNFa e IL-1-β 6,7. Modificações que mascarar a carga negativa de lípido A, também impedir que os péptidos antimicrobianos catiónicos bactericidas de ligação a bactérias gram-negativas superfícies celulares 3,8. Muitas modificações lipídico A são a hipótese de aumentar a aptidão de bactérias em condições ambientais específicas, como no interior do hospedeiro humano ou em um nicho ecológico. Por esta razão, muitas enzimas de modificação são alvos atraentes para o desenvolvimento racional de compostos antimicrobianos. A diversidade química das estruturas um lipídio, em relação ao organismo e / ou meio ambiente, e as implicações biológicas destas diversas estruturas fazer a caracterização estrutural de lipídios A um esforço importante em tele estudar de bactérias gram-negativas.

Isolamento de moléculas de um lípido de bactérias inteiras envolve a extracção de LPS a partir da superfície celular bacteriana, um passo hidrolítico para libertar o lípido A, seguido de um procedimento de purificação final 9-11. O procedimento de extração mais citados LPS é o procedimento de extracção de água quente-fenol, introduzido pela primeira vez por Westphal e Jann 10. Depois de toda a extracção de LPS é submetido a hidrólise com ácido fraco, o qual separa quimicamente Kdo do 6'-hidroxilo do açúcar glucosamina distal do lípido A (Figura 1). Existem numerosos perigos para o procedimento de água quente-fenol, incluindo o uso de um reagente de risco elevado, a necessidade de degradar os ácidos nucleicos extraídos de co-e proteínas, e vários dias são necessários para completar o protocolo de 10.

Nosso laboratório desenvolveu ainda mais a extração e isolamento de lipídio A como o primeiro desenvolvido pela Caroff e Raetz 12,13. Em comparação com os procedimentos de água quente-fenol, o método aqui apresentado é mais rápida e eficiente e acomoda uma larga gama de volumes de cultura de 5 ml para vários litros. Além disso, ao contrário de extrações de água quente-fenol, o nosso método não seleciona para ásperas ou lisas-tipos de LPS, proporcionando ótima recuperação de espécies um lipídio. No nosso protocolo de lise química de células bacterianas inteiras é realizada utilizando uma mistura de clorofórmio, metanol e água, onde LPS pode ser sedimentado por centrifugação. Uma combinação de hidrólise com ácido fraco e extracções com solvente (Bligh-Dyer) são usados ​​para libertar o lípido A de polissacárido covalentemente ligado. O método de Bligh e Dyer foi aplicada primeiramente para a extracção de lípidos de espécies a partir de uma variedade de animais e de tecidos vegetais 14, modificado aqui para separar polissacárido hidrolisada de lípido A. Nesta etapa final de separação, lípidos solúveis clorofórmio particionar selectivamente para a fase orgânica inferior fase. Para purificar ainda mais o lípido A, de fase inversa oucromatografia de coluna de troca aniónica pode ser usado 12.

Após o isolamento de espécies de um lípido de células completas, uma série de métodos analíticos pode ser utilizado para caracterizar a estrutura química do material isolado, tais como RMN, TLC e análise baseada em MS. RMN permite a elucidação estrutural não-destrutiva, e fornece detalhe estrutural relacionada com ligações glicosídicas, atribuição inequívoca de posições cadeia acil e atribuição de pontos de ligação para modificações um lipídio como aminoarabinose ou phosphoethanolamine 15-17. A análise de RMN de lípido A não é discutido no nosso protocolo, mas foi descrito em outro lugar adequadamente 15,16. Para a análise rápida TLC com base métodos são frequentemente utilizados, mas não fornecem informação directa sobre a estrutura química fina. Protocolos baseados MS são o método mais empregado para caracterizar estruturas um lipídio 18,19. Matriz associada a laser dessorção por ionização (MALDI)-MS é muitas vezes usado para examinar inicialmente espécies intactas lipídico A. Íons de carga única são gerados a partir do analito preparadas de acordo com os nossos procedimentos de extração. Como é necessária a análise estrutural mais fina, métodos baseados em MS / MS provar mais informativo do que MALDI-MS. Acoplado a ionização electrospray (ESI) lipídico isoladamente ou multiplicar cobrada uma íons precursores são ainda mais fragmentado por colisão induzida dissociação (CID) ou fotodissociação ultravioleta (UVPD), para gerar íons produtos estruturalmente informativos 18,20,21. Produtos da perda neutra do lipídio A íons precursores também são freqüentemente gerados durante ESI-MS fornecer uma camada adicional de informações estruturais.

Espectrometria de massa em tandem (MS / MS) provou ser um método indispensável e versátil para a elucidação da estrutura de um lípido. Durante a MS / MS, os iões são activados para proporcionar um padrão de fragmentação de diagnóstico que pode ser utilizado para elucidar a estrutura do ião precursor. O mais amplamente available método MS / MS é CID. Este método produz iões fragmento através de colisões ião precursor seleccionado com um gás inerte alvo, resultando em deposição de energia que leva à dissociação. CID provou uma ferramenta fundamental na atribuição de lípido A estrutura para uma ampla gama de espécies bacterianas 22-33.

Embora CID é o método MS / MS mais universalmente implementado, ele gera um conjunto limitado de íons de produtos. 193 nm UVPD é uma alternativa e complementar método MS / MS. Este método utiliza um laser para irradiar iões, e a absorção de fotões resulta na activação dos iões e dissociação subsequente. Esta maior energia técnica MS / MS produz um conjunto mais diversificado de íons produtos que CID e, portanto, fornece padrões de fragmentação mais informativas. Em particular, UVPD oferece informações sobre mudanças sutis em espécie um lipídio com base em clivagens no glicosídica, amina, acil e CC ligado títulos 18,21,34.

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Protocol

Todas as soluções devem ser preparadas com água ultrapura e HPLC metanol grau e clorofórmio. Soluções preparados que contêm solventes orgânicos tais como metanol, clorofórmio, ou de piridina e de ácidos ou bases concentrados devem ser preparados e utilizados sob uma coifa química. Todas as soluções podem ser armazenadas à temperatura ambiente. Os solventes devem ser medidos em um cilindro de vidro graduado e armazenado em garrafas de vidro de solvente com PTFE forrado caps. Para armazenamento a longo prazo solventes contendo clorofórmio deve ser armazenada em garrafas de vidro âmbar matizados para evitar a produção de fosgénio, um cloreto de ácido altamente reactivo. Tubos de centrífuga de PTFE e frascos de evaporador rotativo, devem ser lavados com metanol e clorofórmio antes da utilização. Siga os regulamentos federais, estaduais e / ou eliminação de resíduos institucionais necessárias ao descartar solventes e / ou resíduos radioactivos.

1. Grande Escala de lípido A de extracção (50 ml para 1,5 L)

  1. Prepare uma mistura monofásica Bligh-Dyer: clorofosfato forma-metanol-1X (PBS), pH 7,4 tamponada, 1:2:0,8 v / v). Combinar 200 mL de clorofórmio, 400 ml de metanol e 160 ml de PBS em 1 L de solvente garrafa. Cap garrafa e misturar por inversão (> 30x). Solte a tampa periodicamente durante a mistura para desabafar e armazenar selado.
  2. Prepara-se uma de duas fases de Bligh-Dyer mistura de clorofórmio-pré-equilibrada: metanol: água (2:2:1.8 v / v). Combinar 400 mL de clorofórmio, 400 ml de metanol e 180 ml de água em 1 L de solvente garrafa. Tampa do frasco e misturar por inversão, certificando-se para soltar cap periodicamente durante a mistura para desabafar. Vamos equilibrar O / N e armazenar selado.
  3. Preparar o tampão de hidrólise ácida moderada (acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, 1% de dodecil sulfato de sódio (SDS)). Para 500 ml de tampão de hidrólise ácida suave, pesar 2.05 g de acetato de sódio e transferir para um copo de 500 ml. Adicione a água a um volume de ~ 350 ml e misture, em seguida, adicione 50 ml de 10% SDS. Misturar e ajustar o pH para 4,5, transferir para uma proveta graduada, e adicione água até 500 ml.
  4. Prepararclorofórmio: metanol (4:1, v / v): Medir 100 mL de clorofórmio e transferir para o frasco de solvente. Medir 25 ml de metanol e misturam-se com clorofórmio. Armazene em frasco de vidro âmbar.
  5. Inocular 5 ml de mídia (caldo Luria ou outros) a partir de uma única colônia de bactérias. Grow O / N a 37 ° C, ou em ° C necessária para o crescimento. Um diagrama do processo de extracção é mostrada na Figura 2.
  6. No dia seguinte, a medida do OD 600 e utilizar a cultura de 5 ml O / N para inocular 200 ml de cultura para um OD 600 a partir de 0,05. Crescer as células até uma OD 600 de 0,8-1,0 seja atingido.
  7. Células colheita através de centrifugação a 10.000 xg durante 10 min. Longer gira pode ser necessária para cepas que pellet mal. Deitar fora o sobrenadante mídia.
  8. Lave o peletizado de células com 50 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS). Repetir a centrifugação para sedimentar as células. Deitar fora o sobrenadante e pellet loja célula a -20 ° C, ou vá para o passo 1.9.
  9. Suspenda as células em 40 mlde PBS 1x e dividir entre dois tubos de 250 ml (rendimento PTFE centrífuga de 20 ml de suspensão de células / tubo). Adicionar 25 ml de clorofórmio e 50 ml de metanol a cada tubo, de uma única fase de Bligh-Dyer (clorofórmio: metanol: água, 1:2:0,8 v / v) (Figura 2). Misturar por inversão e incubar à temperatura ambiente durante> 20 min para garantir lise celular completa.
  10. Centrifugar a mistura a 2.000 x g durante 20 min. LPS irá sedimentar junto com proteínas e ácidos nucleicos (Figura 2), no entanto, fosfolípidos, lípidos, isoprenilo e pequenas, péptidos hidrofóbicos permanecerão no sobrenadante. Desprezar o sobrenadante.
  11. Lave o pellet LPS com a mistura de ~ 100 ml monofásica Bligh-Dyer. Centrifugar a 2000 xg por 20 min. Elimine o sobrenadante. Ao isolar o lípido A de E. coli ou Salmonella, apenas uma lavagem é necessária, no entanto, podem ser necessários passos de lavagem adicionais para reduzir a contaminação de fosfolípido ao isolar o lípido A de alguns organismos.
  12. Adicionar 27 ml de mitampão de hidrólise ácida ld (acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, 1% SDS, ver passo 1.3) a LPS pelete e misturar por pipetagem para cima e para baixo até que apenas pequenas partículas permanecem. Sonicate para homogeneamente ressuspender pellet LPS em solução com ponta da sonda de ultra-sons em um ciclo constante de 20 segundos a saída de 50%. Repita sonicação de 2x de amostra (20 seg / estourar, ~ 5 segundos entre as rajadas).
  13. Amostras ferver em banho-maria por 30 min. Atenção: certifique-se as tampas são apertados, mas não totalmente selado. Alguns organismos, tais como Vibrio cholerae (V. cholerae) requerem tempos de incubação mais longos (1 hr) para aumentar o rendimento global do lípido A. Remover garrafas do banho de água e permitir que a amostra arrefecer até à temperatura ambiente antes de continuar.
  14. Para extrair os lípidos, após hidrólise, converter a solução de SDS para uma de duas fases de Bligh-Dyer (Figura 2) mistura por adição de 30 ml de clorofórmio e 30 ml de metanol, para uma mistura de clorofórmio: metanol: água (2:2:1.8, v / v) de mistura. Misturar por inversão e centrifuga-se a amostra durante 10 minutos a 2,000 x g. Extrai-se a fase inferior para um tubo de centrífuga de PTFE limpo, utilizando uma pipeta de vidro.
  15. Realize uma segunda extração, adicionando 30 ml de fase inferior de uma mistura de duas fases Bligh-Dyer pré-equilibrada (passo 1.2), para a fase superior do passo 1.14. Mix, em seguida, centrifugar a 2.000 xg por 10 min. Extrai-se a fase inferior, e reunir com a fase inferior extraído no passo 1.14.
  16. Lavar as fases inferiores combinadas (60 ml no total) por adição de 114 ml de pré-equilibrada duas fases Bligh-Dyer fase superior (passo 1.2), para criar uma mistura de duas fases de Bligh-Dyer (clorofórmio: metanol: água, 2:2: 1,8, v / v). Misture. Centrifugar a 2000 xg por 10 min.
  17. Remover a fase inferior para um balão de evaporador rotativo de vidro limpo e seco de amostra utilizando evaporação rotativa (figura 2).
  18. Adicionar 5 ml de clorofórmio: metanol (4:1, v / v) para o frasco rotativo, e banho-sonicado (> 30 seg) para auxiliar na suspensão de lípidos a partir dos lados do frasco. Use uma pipeta de vidro para transferência de lípides para a limpotubo de vidro (13 x 100 mm ou maior) cobertas com PTFE forrado tampas de rosca fenólicos. Amostra seca sob uma corrente de azoto, utilizando um secador de azoto.
  19. Ressuspender lípido seco em 1 ml de clorofórmio: metanol (4:1, v / v). Transferência para o frasco da amostra de vidro pequeno (12 x 32 mm) com uma base cónica para a ressuspensão mais quantitativa usando pequenos volumes (ver Tabela de Equipamentos / Reagentes). Seca-se utilizando um secador de azoto.
  20. Amostra seca pode ser armazenada a -20 ° C até posterior TLC (Protocolo 2) ou análise MS (Protocolo 3, 4, ou 5). (Nota: Quantidade de material isolado e utilizado em protocolos subsequentes é sugerido com base no que é suficiente para a maioria dos organismos A mesma amostra de lipídios pode ser usado em protocolos 2-5, tomando nota de material removido% Veja a discussão para mais detalhes...).

2. Visualization of Lipid uma espécie através de cromatografia em camada delgada

  1. Prepare o sistema de fase móvel solvente TLC (clorofórmio: piridina: ácido fórmico a 88%: água; 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml de clorofórmio, 200 ml de piridina, 64 ml de 88% de ácido fórmico, e 20 ml de água num frasco de 1 L de solvente. Cap garrafa, misture por inversão várias vezes, e desabafar.
  2. Usar um tanque de TLC que irá acomodar 20 x 20 cm placas. Linha tanque TLC com ~ papel de cromatografia 40 cm.
  3. Para tanque TLC adicionar 200 ml de clorofórmio: piridina: 88% de ácido fórmico: água (50:50:16:5, v / v) da mistura. Permitir tanque de pré-equilibrar durante> 3 horas, frequentemente S / N é o preferido e mais conveniente.
  4. Retirar amostras lipídicas secas do freezer (passo 1.20) e deixar quente para RT.
  5. Com uma máquina de barbear remove a sílica a partir da borda superior de uma placa de TLC de sílica gel de 60. Usando um lápis aborrecido, desenhar uma linha paralela à parte inferior da placa, a 2 cm do fundo. Esta linha é a origem para detectar amostras. Mark incrementa ao longo desta linha de referência para identificar as amostras 1 cm.
  6. Dissolver lípido seco do passo 2.4 em 200 ul de clorofórmio: metanol (4:1, v / v), vortex e sonicado (3x, ~ 15 segundos cada), os rendimentos de ~ 100 -500 ng / mL de lípido A, se extraiu a partir de E. coli.
  7. Usando uma pipeta de vidro microcapilar, detectar um décimo do volume (20 mL) sobre a placa de TLC tal como marcado na etapa 2.5. Deixar as amostras secarem naturalmente na placa TLC para ~ 15 min. (Nota: As amostras em frascos pequenos de vidro pode ser seco utilizando um secador de azoto e armazenada a -20 ° C para posterior utilização em protocolos de 3-5 Tomar nota do material removido%.).
  8. Coloque placa CCF contendo amostras manchadas para o tanque de pré-equilibrada. Assim que a frente de solvente atingir o topo da placa de TLC (~ 2,5-3 hr), remover a placa e ar seco (> 60 min). Uma pistola de ar frio pode ser utilizado para garantir a secura completa.
  9. Enquanto placa está secando, ligue placa quente a 250 ° C por carbonização.
  10. Em uma coifa química ventilado, preparar 10% de mistura de ácido sulfúrico-etanol para carbonizar lípidos resolvidos na placa de TLC de sílica (ácido sulfúrico concentrado: etanol 100%; 01:09 v / v). Medir 10 ml de ácido sulfúrico e adicionar lentamente a 90 ml de etanol a 100%. Cuidadomisturar completamente e transferir para um reagente atomizador cromatográfica de vidro.
  11. , Na hotte, usar um atomizador cromatográfica reagente de vidro para pulverizar a placa de TLC foi seca com 10% de mistura de ácido sulfúrico-etanol. Pulverize mistura uniformemente ao longo da placa.
  12. Coloque a placa de TLC na chapa quente 250 ° C até que as amostras de lipídios carbonizados aparecem como preto / manchas marrons (<1 min). Não exponha a placa, pois isso fará com que toda a placa para virar marrom e fazer a visualização de espécies de um lipídio difícil.

3. Caracterização estrutural de Lípido A através de MALDI-TOF de Espectrometria de Massa

  1. A partir do passo 1,20, (ou passo 2.7) remover lipídios Uma amostra do congelador e deixe quente para RT. Ressuspender lípido seco Uma amostra em ~ 20 mL de clorofórmio: metanol (4:1, v / v) e vortex para obter um ~ 1-5 mg / mL de lípido A solução extraiu-se a partir de E. coli. (Nota: 10% menos concentrado, se o material utilizado no passo 2.7).
  2. Prepare componentes da matriz ATT. Saturada 6-aza-2-tiotimina, em 50% de acetonitrilo: adicionar 500 mL de água e 500 mL de acetonitrilo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e, em seguida, adicionar> 10 mg de 6-aza-2-tiotimina, de modo que o acetonitrilo a 50% é super-saturada. Saturada tribasic solução de citrato de amônio: Adicionar> 1 mg para 500 mL de água, precipitar deve ser facilmente perceptível. Vortex e centrífuga soluções antes de usar; apenas sobrenadante saturado é usado.
  3. Prepare a mistura matriz ATT: citrato de amónio saturado tribásico-tiotimina 6-aza-2 em 50% de acetonitrilo, saturado (20:1, v / v). Misturar em conjunto os componentes da matriz por adição de 20 ul de solução de TCA a 1 ml de solução de citrato de amónio tribásico saturados em 500 ul tubo de microcentrífuga, vortex para misturar e centrifugar antes de se aplicar a placa de MALDI.
  4. Prepare a placa MALDI adicionando mistura calibrante 0,5 ul para a placa de MALDI em um local perto de onde as amostras serão depositados, para proporcionar os mais precisos de massa / carga determinação da razão.
  5. Deposite 0,5 mLde matriz ATT no prato MALDI em cada local onde lipídico A amostra será depositada.
  6. Depósito de 0,5 mL de amostra (2,5% do total da amostra) para o ponto de matriz ATT, a mistura na placa, e adquirir espectros por exemplo a verificação de sinais de iões óptimas (Figura 3). Nota: Valores para o sinal de MS mais ideal pode variar com o organismo e precisam ser determinados empiricamente. Para adicionar mais material pode-se detectar 0,5 mL várias vezes, permitindo mistura manchada para secar entre adição de mais amostras. Amostra também pode ser concentrada (seca e ressuspender em um volume menor) ou diluído, conforme necessário. Mais material de partida (de volume de cultura de células de partida) também pode ser utilizado (Ver discussão).

4. Ionização por Electrospray Mass Spectrometry e colisão dissociação induzida de Lípido A

  1. Preparar uma mistura de clorofórmio: metanol a mistura de solventes (1:1, v / v) através da mistura de um estoque de 200 mL de metanol de grau de HPLC, com 200 ml de clorofórmio de grau HPLC num sol de vidrodesabafar garrafa.
  2. Transferir 200 ul de clorofórmio: metanol a mistura de solvente para o frasco com o lípido A (por exemplo, a partir do passo 1.20, 2.7, ou seca após Protocolo 3) e sonicar o lípido numa solução durante 5 minutos, ou até todo o material estar dissolvido.
  3. Preparar o espectrómetro de massa para ionização negativa modo electrospray.
  4. Utilizando uma seringa de 250 ul e uma bomba de seringa, directamente infundir o lípido diluído Uma amostra com um caudal de 2,0-3,5 mL / min.
  5. Otimizar e melhorar a lipídico Um sinal de íon sintonizando a ótica de íons. Um espectro de massa completo pode agora ser recolhidos das espécies de lípido A (Figura 4).
  6. Isolar e ativar a meta lipídica A, selecionando CID como o método MS / MS.
  7. Aumentar a tensão CID (energia de colisão ou normalizada, NCE) até o lípido precursor A espécie é de cerca de 10% de abundância relativa em comparação com a maior ião do produto.
  8. Adquirir e espectros médio até que suficiente sinal-ruído é alcançada para poíons de produtos e. O número de análises necessárias é dependente da intensidade de sinal do precursor original e pode variar 3-300 scans (Figura 5A).

5. MS / MS em Lipid A por Ultravioleta fotodissociação

  1. Prepare amostra e espectrômetro de massa como nos passos 4,1-4,5.
  2. Ligue o laser interface com o espectrômetro de massa. O espectrómetro de massa foi equipado com um laser excimer de 193 nm e modificado para permitir a activação de UV na célula HCD do instrumento. Fotodissociação foi executado de uma forma semelhante à que se descreveu anteriormente 35. Usamos um colector de vácuo modificado com uma janela óptica CaF 2 para transmitir os fótons no mais energética C-armadilha de dissociação (HCD) celular. O laser é disparado durante MS / MS por uma lógica transistor-transistor (TTL) sinal do espectrômetro de massa para um gerador de pulso / delay.
  3. Configure o software do aparelho para que o laser irá acionar o excimer laser quando oíons de entrar na célula HCD. Isto requer uma alteração modesta do software.
  4. Ligue o gerador de impulsos de modo a que o laser é pulsado cada 2 ms (500 Hz).
  5. Isolar o lipídio A íon precursor seleccionando HCD como método MS / MS e ajustar a energia de colisão de 1% NCE. Isto permite o isolamento de iões precursores para a dissociação de raios ultravioleta no interior da célula HCD. Embora a célula HCD é usado, o software é modificado para executar UVPD durante este intervalo.
  6. Activar o lípido isolado Um ião aumentando a energia do laser e o ajuste do número de impulsos de laser. Um experimento UVPD típico será realizada utilizando dez ml 6 pulsos.
  7. Como no passo 4.8, adquirir e espectros médios até o ruído de sinal-suficiente é obtida para os íons produtos UVPD. O número de análises necessárias é dependente da intensidade de sinal do precursor original e pode variar 3-300 scans (Figura 5B).

6. 32 P-Labelingof Lipid A e subsequente isolamento

  1. Inocular 5 ml de meio (meio Luria ou outro meio) a partir de uma única colónia. Grow O / N a 37 ° C ou à temperatura necessária.
  2. No dia seguinte, a medida do OD 600 e utilizar a cultura D / N para inocular 7 ml de cultura para um OD 600 a partir de ~ 0,05, cultivadas em 20 x 150 mm padrão do tubo de cultura de vidro descartável. Adicionar 2,5 uCi / ml de inorgânico 32 P. Crescer as células até uma OD 600 de 0,8-1,0 seja atingido. Por favor, siga federal, estadual e / ou diretrizes institucionais para o manuseio seguro e adequado de materiais radioativos.
  3. Células colheita em 16 x 125 mm tubos de centrífuga de vidro com tampa de PTFE alinhado utilizando uma centrífuga clínica de ângulo fixo a 1.500 x g durante 10 min. Remover o sobrenadante em recipiente apropriado resíduos radioactivos. Todos os resíduos radioactivos (por exemplo, líquido, vidro, biohazard) gerado nas etapas subseqüentes devem ser eliminados de acordo com a legislação federal, estadual e / ou gui institucionalretrizes.
  4. Lave o peletizado de células com 5 ml de 1x tampão fosfato salino (PBS). Centrifugar durante 10 minutos a 1500 x g. Elimine o sobrenadante.
  5. Ressuspender as células em 5 ml de fase única mistura Bligh-Dyer (Figura 2) que consiste em clorofórmio: metanol: água (1:2:0,8, v / v). Vortex para misturar e incubar à temperatura ambiente durante> 20 min para garantir lise celular completa.
  6. Centrífuga em centrífuga clínica a 1500 xg por 20 min. Delicadamente despeje sobrenadante, que contém fosfolipídios e lipídios isoprenil.
  7. Ressuspender o sedimento em 1,8 ml de LPS de acetato de sódio 50 mM, pH 4,5, 1% de tampão de SDS por vórtex. Sonicar amostra utilizando um sonicador de banho até pelete é uniformemente dispersa (~ 30 seg.)
  8. Incubar amostra durante 30 minutos em banho de água a ferver. Certifique-se que as tampas são apertados, mas não selado.
  9. Remover do banho de água e permitir que a amostra arrefecer até à temperatura ambiente durante 5-10 min.
  10. Converter a solução numa mistura de duas fases de Bligh-Dyer por adição de 2 ml de clorofórmio e 2 ml demetanol, obtendo-se uma mistura de clorofórmio: metanol: solução aquosa de mistura (2:2:1.8 v / v). Vortex para misturar, e centrifuga-se durante 10 min em centrífuga clínica a 1.500 xg, para as fases separadas.
  11. Extrai-se a fase inferior para um tubo de centrífuga de vidro limpo, utilizando uma pipeta de vidro (primeira extracção).
  12. Realizar uma segunda extracção da amostra por adição de 2 ml de pré-equilibrada em duas fases Bligh-Dyer fase inferior (preparado como no passo 1.2) para a fase superior restante do passo 11. Vortex e centrifuga-se 10 min. Retirar fase inferior e combinam-se com a fase inferior da primeira extracção.
  13. Para a fase inferior reunidas (~ 4 ml de volume total), adicionar 7,6 ml de pré-equilibrada fase superior (passo 1.2), obtendo-se uma solução de Bligh-Dyer de duas fases (clorofórmio: metanol: água; 2:2:1.8, v / v). Vortex e centrifuga-se durante 10 min.
  14. Remover a fase inferior para um tubo de vidro limpo e seco com um secador de azoto. As amostras secas podem ser armazenadas à temperatura de -20 ° C até à sua utilização.

7. Visualização de 32 marcado com P Lípido A Espécies através de Cromatografia de Camada Fina

  1. Preparar 32 lípido marcado com P-se uma amostra, tanque de TLC, e as placas de TLC como descrito nos passos de 2,1-2,8.
  2. Dissolve-se 32 da amostra marcada com P, em 500 mL de clorofórmio-metanol 04:01 (v / v). Vortex e banho sonicate para dissolver completamente o material lipídico. Adicionar 5 mL de amostra para o frasco de cintilação contendo 5 ml de mistura de cintilação. Contagem em contador de cintilação e calcular a contagem total / min de amostra.
  3. Ao visualizar espécies de lípidos radiomarcadas, 10 x 20 cm ou 20 cm x 20 placas de TLC pode ser usado. Para 10x20 cm placas, as amostras devem ser vistos ao longo da origem marcado na etapa 2.5, de modo que a maior dimensão da placa é vertical (ou seja, amostras manchado na origem marcado 2 cm acima da borda 10 cm).
  4. Com uma pipeta microcapilar, spot 10.000-20.000 cpm / amostra na placa e permitem que os pontos para secar (> 15 min). As amostras podem precisar ser concentrado por secagem sobazoto e res suspenso num volume apropriado, para atingir 10.000-20.000 contagens / min / local (2 mL ou 2 mL de cada vez de <10 ul total).
  5. Coloque placa CCF contendo amostras radiomarcadas para o tanque de pré-equilibrada. Assim que a frente de solvente atingir o topo da placa de TLC (~ 3 horas), remover a placa e ar seco (> 60 min). Atenção: placas de TLC executados na presença de piridina, será necessário secar completamente em um exaustor química, como vestígios de piridina pode danificar telas phosphorimaging. Uma pistola de ar frio pode ser utilizado para garantir a secura completa.
  6. Enrole a placa em filme plástico e expor a tela phosphorimager em uma auto-radiografia cassete O / N. Na manhã seguinte, a varredura do ecrã para obter a imagem (Figura 6). Usando imagem de software análise de densitometria, este método permite a quantificação exata, relativa das espécies um lipídio.

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Representative Results

Lipídico Canonical A do E. coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium é um dissacárido acilado-hexa de glucosamina com os grupos de fosfato nas posições 1 - e 4 '-posições. Durante o crescimento em meios ricos (por exemplo, Luria Broth) uma porção do lípido A contém um grupo de pirofosfato na posição 1, obtendo-se um tris-fosforilada espécies 36 (Figura 1). Kdo (-D-mano-3-desoxi octulosonic ácido), está ligado na posição 6 '-hidroxilo, e serve como uma ponte de ligação de lípido A de hidratos de carbono para os domínios restantes (isto é, do núcleo de oligossacáridos e domínios de O-antigénio) de LPS. Embora as bactérias gram-negativas partes de uma via conservada para o lípido A biossíntese semelhante ao de E. coli K-12, existe uma grande quantidade de diversidade, em estruturas de um lípido. Esta diversidade surge a partir da ação de enzimas latentes que modificam o A estrutura lipídica, que são ativadas em resposta a estímulos ambientais. Para example, em S. enterica os grupos fosfato de lípido A pode ser modificado com o açúcar catiónico L-4-aminoarabinose (Figura 1; azul) ou com um resíduo fosfoetanolamina (Figura 1; magenta). No caso de Salmonella estas modificações são regulados por sistemas de resposta do regulador de dois componentes, adicionado em resposta à baixa [Mg 2 +], pH leve-ácida, e a presença de péptidos antimicrobianos catiónicos. Além disso, em Salmonella, palmitato pode ser adicionado para formar um hepta-acilado lípido A, o qual promove a resistência a péptidos antimicrobianos catiónicos (Figura 1; verde) 8. Outras modificações incluem, mas não estão limitados a, a remoção de grupos de fosfato e as cadeias de acilo, ou dioxigenase catalisada adição de um grupo hidroxilo na cadeia de acilo secundário ligado a 3'observado num número de organismos 1,3.

Isolamento de lípido A de células intactas inteiras por a modificação do método de Caroff e Raetz é descrita no protocolo 1 (Figura 2). Este método de isolamento foi utilizado para estimar que 10 6 moléculas de lípido A existir por célula bacteriana de E. coli 37. Seguintes protocolos 1 e 3, o íon MALDI-TOF espectro de massa negativo de lipídio A de E. coli K-12 (W3110) obtém-se o ião isoladamente desprotonado ([MH] -) para m / z 1,796.20 como as espécies majoritariamente observados (Figura 3). MALDI-TOF MS foi realizada no modo negativo reflectrão para melhorar a resolução espectral. Alternativamente, a mesma amostra submetida a lípido modo negativo nano-ESI (Protocolo 4) produz iões de lípido A predominantemente duplamente desprotonados a m / z 898,1 denotado por [M-2H] 2 - (Figura 4). Iões isoladamente desprotonados lípido A [MH] - para m / z 1,796.20 são observáveis, mas são de menor abundância relativa para [M-2H] 2 - iões (Figura 4). Espécies Multiply carregadas predominantementenate ao usar ESI. A fragmentação por CID (Figura 5A) ou 193 nm UVPD (Figura 5B) foi realizada sobre a [MH] - lípido A ião m / z 1,796.20. Estas técnicas podem ser utilizadas para melhorar a atribuir estruturas químicas, particularmente das espécies de lípido A contendo combinações complexas de alterações ou modificações químicas anteriormente descaracterizados. Perfis de fragmentação são mostrados com linhas tracejadas representam os locais de clivagem e são comparados com os valores de m / z abaixo de cada estrutura prevista (Figura 5). Os valores de m / z e sítios de clivagem em destaque na fonte vermelha representam íons únicos produtos associados UVPD.

Tal como descrito nos protocolos de 6 e 7, 32-P marcado com lípido A a partir de dois isolados de E. diferente coli K-12 estirpes foi analisada por TLC (Figura 6). W3110 contém maioritariamente bis-e tris-fosforilada lípido A (Figura 6;pista da esquerda), enquanto que um padrão mais complexo TLC é observada com 32 P-lípido A isolada a partir de E. coli WD101 (Figura 6; pista da direita) 38. WD101 produz lipídio A pesadamente modificado com aminoarabinose (L-Ara4N) e phosphoethanolamine (PETN). Uma vez que ambos 1 - e 4 '- fosfatos estão disponíveis para modificação, o lípido A partir WD101 pode ser descrito como isoladamente modificado, que contém apenas um L-Ara4N ou PETN ou em fosfato, ou duplamente modificado em que ambos os fosfatos são modificados de uma forma combinatória. Além disso a modificação nas posições 1 - e 4 '- fosfato, a adição de palmitato está também observados (ver Figura 1) e aumenta o valor de R f de espécies de um lípido neste sistema de solvente (Figura 6). Se for o caso, a análise de densitometria usando um phosphorimager, pode ser utilizado para estimar as quantidades relativas quantificável de espécies dentro de um lípido da mesma amostra.


Figura 1. Lipídios um representante estruturas de domínio de E. coli K-12 e S. enterica sorotipo Typhimurium. Modificações para o A estrutura lipídica conservada são mostrados (à direita), conforme descrito na resultados representativos. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Esquema de lipídio A isolamento procedimento. Esboço mostra lise química do pellet celular bacteriana usando monofásica mistura Bligh-Dyer, centrifugação de lisado para agregar LPS, leve-a cid hidrólise para liberar lipídico A partir de polissacarídeo em anexo, e purificação final de lipídio A utilização de duas fases de extração Bligh-Dyer. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3
Figura 3. A análise MALDI-MS de lípido A isolada a partir de E. coli K-12 (W3110). espectros obtidos a partir da média de> 300 disparos. Isoladamente carregada [MH] - lípido A é observada como o ião molecular a m / z 1.796,2, o que corresponde a uma espécie desprotonados da estrutura mostradas à direita.

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Figura 4. Análise de ESI-MS de lípido A isolada a partir de E. coli K-12 (W3110) Individualmente [MH] e duplamente carregado [M-2H] 2 -. espécies de um lípido são observados como iões moleculares de m / z 1.796,2 e m / z 898,1, respectivamente.

Figura 5
Figura 5. A análise por MS / MS de lípido A isolada a partir de E. coli K-12 (W3110). dissociação induzida por colisão (A) ou fotodissociação ultravioleta (B) foram utilizados para fragmentar o ião precursor de m / z 1.796,2. Íons UVPD de produtos específicos são indicados em vermelho. Um mapa fragmentação é fornecido (C), onde o preto linhas tracejadas indicam fragmentação associada tanto CID e UVPD e vermelho linhas tracejadas indicam UVPD SPEfragmentação cas. Os valores listados abaixo do mapa fragmentação correspondem a massas exatas de [MH] -. Íons produtos Clique aqui para ver maior figura .

Figura 6
Figura 6. Separação à base de TLC de espécies de um lípido isolado a partir de E. coli K-12 32 lípido marcado com P A, foi isolado a partir de W3110 (faixa da esquerda) ou WD101 (pista da direita) e separadas num sistema de solventes de TLC tanque contendo clorofórmio:. piridina: 88% de ácido fórmico: água (50:50:16 : 5 v / v).

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Discussion

Neste protocolo temos detalhou o isolamento de espécies de um lipídio a partir de células inteiras de bactérias, e descreveu TLC ou métodos analíticos baseados MS caracterizar quimicamente o material isolado. Espectrometria de massa em tandem é uma estratégia poderosa para de novo caracterização estrutural de compostos biológicos, e é de valor inestimável para a caracterização química da panóplia de moléculas de um lipídio observadas na natureza. CID e UVPD são dois métodos de ativação complementares que criam diferentes tipos de íons de produtos que fornecem impressões digitais-chave para as moléculas de um lipídio. Fragmentação MS / MS usando tanto CID e UVPD permite a elucidação das diferenças sutis de estruturas de um lipídio, fornecendo maiores detalhes para atribuições estrutura química. Os dados deste tipo são necessárias para estabelecer relações estrutura correlato / função precisos na biologia de lípido A espécie molecular. Também descreveram o procedimento para 32 espécies um lipídio-radiomarcaï P em sculturas bacterianas shopping escala, onde o padrão químico de 32 espécies P-lipídio A podem ser visualizadas usando TLC e auto-radiografia.

Há uma série de recursos para este protocolo que qualquer usuário deve estar ciente de. Para as preparações em larga escala do lípido A (protocolo 1), a proporção de solvente começando a quantidade de sedimento de bactérias pode ser optimizado para aumentar o rendimento global. No entanto, esta proporção pode ser determinada empiricamente. Os valores descritos neste protocolo representam um bom ponto de partida para a maioria das cepas bacterianas. Volumes de cultura para extração de lipídios A e isolamento também pode ser ajustado dependendo da estirpe bacteriana que você está trabalhando. Por exemplo, V. cholerae requer, pelo menos, 200 ml de cultura, a fim de obter espectros de massa de alta qualidade, no entanto, o volume de cultura de E. coli pode ser reduzida para 5 ml. Mais material de partida (volumes de cultura maiores) é necessário para algumas espécies de bactérias porque as hydrolysé o passo que libera o lípido A do LPS todo é menos eficiente. Por exemplo organismos contendo uma dioxigenase Kdo funcional ou Kdo quinase exposição diminuiu yields um lipídio depois leve-ácido hidrólise 39. Muitas vezes, os mutantes com estruturas A LPS / lipídico alterado ou uma espécie bacteriana particulares são muitas vezes difíceis de pelota durante a colheita de células. Por estas estirpes, a duração de centrifugação pode ser estendido para aumentar o rendimento. Também digno de nota, após a lise celular em uma fase única mistura e LPS Bligh-Dyer é peletizada (veja o passo 1.9), as etapas de lavagem adicionais podem ser necessárias para reduzir a contaminação de fosfolipídios. Ao isolar o lípido A de E. coli ou Salmonella, apenas uma lavagem é necessária. No entanto, se isolar o lípido A partir de outros organismos (por exemplo, V. cholerae ou Helicobacter pylori), as etapas de lavagem adicionais são necessários.

Após a hidrólise ácida suave em SDS, o rendimento da espécie lipídica com uma hidrofobicidade reduzida (ou seja, mais phogrupos sphate> 2 ou menos cadeias de acilo <5) pode ser melhorado utilizando uma extracção de Bligh-Dyer ácida. Para os volumes utilizados na secção de protocolo 1, adicionar 225 mL de HCl concentrado à solução de SDS contendo hidrolisado de lípido A, seguido por 30 ml de clorofórmio e 30 ml de metanol para uma mistura de duas fases de Bligh-Dyer de clorofórmio: metanol: HCl 0,1 M (2:2:1.8, v / v). Para os volumes utilizados no protocolo secção 6 adicionar 15 mL de ácido clorídrico concentrado à solução de SDS contendo hidrolisado de lípido A, seguido por 2 ml de clorofórmio e 2 ml de metanol obtendo-se uma mistura de clorofórmio: metanol: 0,1 M de HCl (2:2:1.8, v / v) de mistura. Após uma extracção de Bligh-Dyer ácida, a piridina pode ser adicionado às fases inferiores combinadas para neutralizar o ácido (1 gota de piridina / 2 ml de volume final da amostra). Este passo adicional deve ser realizada antes da secagem da amostra, numa hote química. Ter cuidado para não utilizar o excesso de piridina, que pode levar à remoção de ácidos gordos ligados a éster. Além disso, se o samp lipídicole é difícil de secar sob azoto, adicionar alguns mililitros de clorofórmio: metanol (4:1, v / v) para o balão e continuam a secar a amostra de conclusão.

A heterogeneidade química complexa de espécies um lipídio observados em alguns organismos (por exemplo, V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) às vezes pode tornar a análise baseada em MS TLC-ou difícil. A cromatografia em coluna pode ser utilizada a montante destas técnicas analíticas para pré-fraccionar espécies isoladas lípido A em misturas mais simples. Troca iônica com dietilaminoetil (DEAE)-celulose é mais comumente usado 40. Como orientação geral lipídico A modificação em uma ou outra posição fosfato, com grupos não-ácidos, como aminoarabinose ou phosphoethanolamine, elui antes de espécies de lipídios A não modificados 40. Similarmente tris-fosforilada lípido A elui bem após espécies bisphosphorylated não modificados 36,40. Cromatografia de fase reversa pode ser utilizado para fraccionar o lípido A espécies de diferentes graus de hidrofobicidade 41. A cromatografia de coluna, também é útil na remoção de SDS residual após hidrólise ácida suave e subsequente Bligh-Dyer lípido A passos de extracção. Altos níveis de SDS residual pode contribuir para a supressão do sinal no espectro obtido por nossos protocolos de ESI-MS sensíveis.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por subsídios AI064184 e AI76322 dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e por Grant 61789-MA-MUR do Army Research Office para MST A pesquisa também foi apoiado por Welch Foundation Grant F1155 e NIH conceder R01GM103655 a JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

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