Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Chemistry

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Summary

Isolamento e caratterizzazione del lipide Un dominio di lipopolisaccaride (LPS) da batteri gram-negativi fornisce comprensione dei meccanismi cellulari di superficie a base di antibiotico-resistenza, la sopravvivenza dei batteri e fitness, e come chimicamente lipidi varia Una specie molecolari differenziale modulano la risposta immunitaria innata.

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Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

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Abstract

Lipopolisaccaride (LPS) è il principale molecola di superficie cellulare di batteri gram-negativi, depositato sul foglietto esterno della membrana a doppio strato esterno. LPS possono essere suddivise in tre domini: l'O-distale polisaccaridi, oligosaccaridi un nucleo, e il lipide A dominio costituito da un lipide una specie molecolare e residui di acido 3-desossi-D-manno-ott-2-ulosonic (Kdo). Il dominio lipide A è l'unico componente essenziale per la sopravvivenza delle cellule batteriche. Dopo la sua sintesi, lipide A viene modificato chimicamente in risposta a stress ambientali come il pH o temperatura, per favorire la resistenza a composti antibiotici, e di eludere riconoscimento da mediatori della risposta immunitaria innata ospitante. Dettagli Il protocollo segue l'isolamento piccola e larga scala di lipide A da batteri gram-negativi. Isolato materiale viene poi caratterizzato chimicamente per cromatografia su strato sottile (TLC) o spettrometria di massa (MS). Oltre a matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di fluce (MALDI-TOF) MS, abbiamo anche descrivono i protocolli MS tandem per l'analisi dei lipidi Una specie molecolari utilizzando la ionizzazione electrospray (ESI) accoppiato a collisione indotta dissociazione (CID) e fotodissociazione ultravioletti neoassunto (UVPD) metodi. I nostri protocolli di MS consentono la determinazione inequivocabile della struttura chimica, di primaria importanza per la caratterizzazione di molecole di un lipide che contengono modifiche chimiche uniche o romanzo. Abbiamo anche descrivono l'etichettatura radioiso e successivo isolamento, di lipide A da cellule batteriche per l'analisi mediante TLC. Confrontate protocolli basati su MS, TLC fornisce un metodo di caratterizzazione più economico e rapido, ma non può essere utilizzata per assegnare inequivocabilmente lipide A strutture chimiche senza l'utilizzo di standard noti struttura chimica. Negli ultimi due decenni, l'isolamento e la caratterizzazione di lipide A ha portato a numerose scoperte emozionanti che hanno migliorato la nostra comprensione della fisiologia dei batteri gram-negativi, meccanismi di resistenza antibioticaza, la risposta immunitaria innata umana, e hanno fornito molti nuovi bersagli per lo sviluppo di composti antibatterici.

Introduction

Lipopolisaccaride (LPS) è il principale molecola superficie esterna di quasi tutti gli organismi gram-negativi e costituito da tre domini molecolari: un polisaccaride distale O-antigene, un oligosaccaride nucleo, e la lipidi associata alla membrana Un dominio depositato sul foglietto esterno della esterno membrana a doppio strato 1,2. Il lipide Un dominio è costituito da 3-deossi-D-manno-ottobre-2-ulosonic (Kdo) residui e un lipide una specie molecolare, dove lipide A può essere definita come la porzione solubile in cloroformio di LPS su idrolisi acida lieve-1, 2. Il lipide standard A molecola può essere chimicamente definito come un backbone diglucosamine che è esa-acilato e bis-fosforilato; coerente con le principali specie lipide A osservati nel modello organismo Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nove geni espressi costitutivamente, conservati in tutta batteri gram-negativi, sono responsabili della produzione del lipide A dominio (Figura 1) 1,2. La maggior parte dei batteri hanno un ulteriore insieme di geni, che variano in grado di conservazione filogenetica, che partecipano ulteriore modificazione chimica del lipide A 3. Defosforilazione, rimozione di catene acile, e l'aggiunta di parti chimiche come zuccheri amminoacidi (es aminoarabinose) e / o fosfoetanolamina sono le attività più comunemente osservati (Figura 1). Molti degli enzimi responsabili lipide A modifica sono direttamente attivati ​​da segnali ambientali, quali cationi bivalenti, o la loro espressione è regolata da due sistemi di reazione-regolatore dei componenti 3.

Riconoscimento di specie un lipide da parte del sistema immunitario innato ospite è mediato dal recettore Toll-like fattore di differenziazione 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-recettore 4. Forze idrofobiche tra MD2 e il lipide A catene acile, nonché tra TLR4 e gruppi fosfato 1 e 4 'di lipide A promuovere la forte associazione di labbroid A con TLR4/MD2 4,5. Le modifiche che alterano stato acilazione o la carica negativa del lipide A lipidico basata impatto TLR4/MD2 Un riconoscimento e stimolazione a valle della risposta immunitaria innata attivatori NF-kB e mediatori dell'infiammazione come TNFa e IL1-β 6,7. Modifiche che mascherano la carica negativa del lipide A impediscono anche battericida peptidi antimicrobici cationici di legarsi al gram-negativi superficie delle cellule 3,8. Molte modifiche lipide A sono ipotizzati per aumentare la forma batterica in determinate condizioni ambientali, come all'interno dell'ospite umano o in una nicchia ecologica. Per questo motivo molti enzimi di modificazione sono obiettivi attraenti per lo sviluppo razionale di composti antimicrobici. La diversità chimica delle strutture un lipide, rispetto al microrganismo e / o l'ambiente, e le implicazioni biologiche di queste strutture diverse rendono la caratterizzazione strutturale di lipide A uno sforzo importante in tegli studio di batteri gram-negativi.

L'isolamento di una molecole lipidiche da batteri interi coinvolge l'estrazione di LPS dalla superficie della cellula batterica, una fase idrolitica per liberare lipide A, seguita da una procedura di purificazione finale 9-11. La procedura di estrazione più frequentemente citata LPS è la procedura di estrazione di acqua calda-fenolo, introdotto da Westphal e Jann 10. Dopo estrazione intero LPS è sottoposto ad idrolisi lieve-acido, che separa chimicamente Kdo dalla 6'-idrossile dello zucchero glucosamina distale del lipide A (Figura 1). Esistono numerose difficoltà per la procedura di acqua calda-fenolo compreso l'uso di un reagente alta pericolosità, la necessità di degradare acidi coestratti nucleici e proteine, e più giorni sono necessari per completare il protocollo 10.

Il nostro laboratorio ha ulteriormente sviluppato l'estrazione e l'isolamento di lipide A come primo sviluppato da Caroff e Raetz 12,13. Rispetto alle procedure acqua calda-fenolo, il metodo qui presentato è più rapida ed efficiente e ospita una vasta gamma di volumi di coltura da 5 ml a più litri. Inoltre, a differenza estrazioni acqua calda-fenolo, il nostro metodo non seleziona per-ruvide o lisce tipi di LPS, garantendo il recupero ottimale della specie A lipidiche. Nel nostro protocollo, lisi chimica delle cellule batteriche intere viene eseguita utilizzando una miscela di cloroformio, metanolo e acqua, dove LPS possono essere pellet per centrifugazione. Una combinazione di idrolisi lieve-acida e estrazioni solvente (Bligh-Dyer) vengono utilizzati per liberare lipide A da polisaccaride covalentemente. Il metodo di Bligh e Dyer è stato applicato prima alla estrazione di specie lipidiche da una varietà di animali e piante dei tessuti 14, modificato qui per separare polisaccaride idrolizzato dal lipide A. In questa fase di separazione finale, lipidi solubili cloroformio partizionare selettivamente nella organica inferiore fase. Per purificare ulteriormente lipide A, reverse-fase oanionico cromatografia su colonna di scambio può essere utilizzato 12.

Dopo l'isolamento del lipide A specie di cellule intere, un certo numero di metodi analitici possono essere utilizzati per caratterizzare la struttura chimica del materiale isolato come NMR, TLC, e analisi MS. NMR permette di non distruttivo delucidazione strutturale, e fornisce dettagli strutturali relativi a legami glucosidi, l'assegnazione inequivocabile delle posizioni catena acilica, e l'assegnazione dei siti di attacco per A modificazioni dei lipidi come aminoarabinose o fosfoetanolamina 15-17. Analisi NMR del lipide A non viene discusso all'interno del nostro protocollo, ma è stata descritta adeguatamente altrove 15,16. Per l'analisi rapida TLC basano metodi sono utilizzati di frequente, ma non riescono a fornire informazioni dirette riguardanti fine struttura chimica. Protocolli basati SM sono il metodo più frequentemente impiegato per caratterizzare le strutture un lipide 18,19. Matrice associata desorbimento laser ionizzazione (MALDI)-MS viene spesso utilizzato per rilevare inizialmente intatte specie lipidico A. Ioni Singolarmente cariche sono generati da analiti preparati secondo le nostre procedure di estrazione. Poiché è necessaria più fine analisi strutturale, metodi basati MS / MS rivelarsi più informativo di MALDI-MS. Abbinato a ionizzazione electrospray (ESI) lipidi carica singolarmente o moltiplicare A ioni precursori sono ulteriormente frammentati dalla collisione indotta dissociazione (CID) o fotodissociazione ultravioletta (UVPD), per generare ioni prodotto strutturalmente informativi 18,20,21. Prodotti per la perdita neutre lipide A ioni precursori sono anche spesso generate durante ESI-MS fornisce un ulteriore livello di informazioni strutturali.

Spettrometria di massa tandem (MS / MS) ha dimostrato di essere un metodo indispensabile e versatile per la delucidazione delle strutture un lipide. Durante MS / MS, ioni vengono attivati ​​per produrre un pattern di frammentazione diagnostico che può essere utilizzata per delucidare la struttura dello ione precursore. Il più diffuso avaOTTIMIZZARE LE OPPORTUNITÀ metodo MS / MS è CID. Questo metodo produce frammenti di ioni attraverso collisioni dello ione precursore selezionato con un gas inerte bersaglio, con conseguente deposizione di energia che porta alla dissociazione. CID è dimostrato uno strumento fondamentale nell'assegnazione di una struttura lipidica per una vasta gamma di specie batteriche 22-33.

Sebbene CID è il metodo MS / MS più universalmente attuato, genera una matrice limitato di ioni prodotto. 193 nm UVPD è una alternativa e complementare metodo MS / MS. Questo metodo utilizza un laser per irradiare ioni, e l'assorbimento di fotoni provoca energizzazione degli ioni e la successiva dissociazione. Questa energia superiore tecnica MS / MS produce una gamma più diversificata di ioni prodotto di CID e quindi fornisce modelli più informativi frammentazione. In particolare, UVPD offre informazioni sui cambiamenti sottili nella specie un lipide sulla base delle spaccature a glicosidica, ammine, acile e CC obbligazioni legate 18,21,34.

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Protocol

Tutte le soluzioni devono essere preparate con acqua ultrapura e metanolo per HPLC e cloroformio. Soluzioni preparate contenenti solventi organici come il metanolo, cloroformio, o piridina e acidi o basi concentrati devono essere preparati e utilizzati sotto una cappa. Tutte le soluzioni possono essere conservati a temperatura ambiente. I solventi devono essere misurati in un cilindro di vetro graduato e conservati in vetro bottiglie di solvente con PTFE rivestito tappi. Per la conservazione a lungo termine solventi-cloroformio contenente devono essere conservati in bottiglie di vetro ambrato colorate per evitare la produzione di fosgene, un cloruro acido altamente reattivo. Tubi PTFE centrifuga e fiaschi evaporatore rotante devono essere sciacquati con metanolo e cloroformio prima dell'utilizzo. Seguire le norme federali, statali e / o smaltimento dei rifiuti istituzionale necessarie per lo smaltimento di solventi e / o residui radioattivi.

1. Large Scale lipide A Estrazione (50 ml a 1,5 L)

  1. Preparare un monofase miscela di Bligh-Dyer: cloroforma-metanolo-1X tampone fosfato salino (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Unire 200 ml di cloroformio, 400 ml di metanolo e 160 ml di PBS in 1 L flacone solvente. Bottiglia tappo e mescolare per inversione (> 30x). Allentare il tappo periodicamente durante la miscelazione per sfogare e memorizzare sigillato.
  2. Preparare una pre-equilibrata bifase Bligh-Dyer miscela-cloroformio: metanolo: acqua (2:2:1.8 v / v). Unire 400 ml di cloroformio, 400 ml di metanolo e 180 ml di acqua in 1 L flacone solvente. Tappo della bottiglia e mescolare per inversione, facendo in modo di allentare cap periodicamente durante la miscelazione di sfogo. Lasciare equilibrare O / N e conservare sigillato.
  3. Preparare il tampone acido idrolisi lieve (acetato di sodio 50 mM, pH 4.5, 1% sodio dodecil solfato (SDS)). Per 500 ml di tampone acido idrolisi mite, pesare 2,05 g di acetato di sodio e versare in un becher da 500 ml. Aggiungere acqua fino ad un volume di circa 350 ml e mescolare, quindi si aggiungono 50 ml di 10% SDS. Mescolare e aggiustare il pH a 4.5, trasferire in un cilindro graduato e aggiungere acqua fino a 500 ml.
  4. Prepararecloroformio: metanolo (4:1, v / v): Misurare 100 ml di cloroformio e trasferire al solvente bottiglia. Misurare 25 ml di metanolo e mescolare con cloroformio. Conservare in bottiglia di vetro ambra.
  5. Inoculare 5 ml di media (Luria brodo o altro) da una singola colonia batterica. Grow O / N a 37 ° C, oa richiesta ° C per la crescita. Un diagramma della procedura di estrazione è mostrato nella Figura 2.
  6. Il giorno successivo, misurare il diametro esterno 600 e utilizzare la cultura 5 ml O / N per inoculare 200 ml di coltura per un OD di partenza 600 di 0,05. Crescere le cellule fino a quando un OD 600 di 0.8-1.0 è raggiunto.
  7. Celle di raccolta mediante centrifugazione a 10.000 xg per 10 min. Gira più lungo può essere richiesto per ceppi che PELLET male. Versare i media surnatante.
  8. Lavare pellet con 50 ml di 1x tampone fosfato (PBS). Ripetere la centrifugazione a pellet cellule. Versare il surnatante e pellet cellulare conservare a -20 ° C, o procedere al punto 1.9.
  9. Risospendere le cellule in 40 mldi 1x PBS e dividere tra due 250 ml tubi in PTFE centrifuga (rendimento 20 ml di sospensione cellulare / tube). Aggiungere 25 ml di cloroformio e 50 ml di metanolo a ciascuna provetta, per una fase Bligh-Dyer (cloroformio: metanolo: acqua; 1:2:0.8 v / v) (Figura 2). Miscelare per inversione e incubare a temperatura ambiente per> 20 min per assicurare la lisi cellulare completo.
  10. Centrifugare la miscela a 2.000 xg per 20 min. LPS saranno pellet con proteine ​​e acidi nucleici (Figura 2), tuttavia, fosfolipidi, lipidi isoprenyl e piccoli peptidi idrofobici rimarranno nel supernatante. Scartare il surnatante.
  11. Lavare il pellet LPS con la miscela ~ 100 ml monofase Bligh-Dyer. Centrifugare a 2000 xg per 20 min. Scartare il surnatante. Quando si isola lipide A di E. coli o Salmonella, è necessario solo un lavaggio, tuttavia, potrebbero essere necessarie ulteriori fasi di lavaggio per ridurre la contaminazione fosfolipide quando isolare lipide A da parte di alcuni organismi.
  12. Aggiungere 27 ml di mitampone di idrolisi acida ld (acetato di sodio 50 mM, pH 4,5, 1% SDS; vedi passo 1.3) per LPS pellet, e mescolare pipettando su e giù fino a quando rimangono solo piccole particelle. Ultrasuoni per risospendere omogeneo LPS pellet in soluzione con la punta della sonda sonicatore a un ciclo di lavoro costante per 20 sec in uscita il 50%. Ripetere sonicazione di 2x campione (20 sec / scoppio, ~ 5 sec tra burst).
  13. Campioni bollire in un bagno d'acqua per 30 minuti. Attenzione: assicurarsi che i tappi sono stretti, ma non completamente sigillato. Alcuni organismi, come il Vibrio cholerae (V. cholerae) richiedono tempi di incubazione più lungo (1 ora) per aumentare il rendimento complessivo del lipide A. Togliere bottiglie dal bagnomaria e lasciare raffreddare campione a temperatura ambiente prima di procedere.
  14. Per estrarre lipidi dopo idrolisi, convertire la soluzione di SDS in due fasi Bligh-Dyer (Figura 2) miscela aggiungendo 30 ml di cloroformio e 30 ml di metanolo, per una cloroformio: metanolo: acqua (2:2:1.8, v / v) della miscela. Miscelare per inversione e centrifugare il campione per 10 minuti a 2,000 x g. Estrarre la fase inferiore in una provetta da centrifuga PTFE pulita utilizzando una pipetta di vetro.
  15. Effettuare una seconda estrazione aggiungendo 30 ml di fase inferiore da un pre-equilibrata bifase Bligh-Dyer miscela (passo 1.2), la fase superiore dal punto 1.14. Mix, quindi si centrifuga a 2000 g per 10 min. Estrarre la fase inferiore, e la piscina con la fase inferiore estratta nel passaggio 1.14.
  16. Lavare le fasi inferiori aggregati (60 ml in totale) aggiungendo 114 ml di pre-equilibrata bifase Bligh-Dyer fase superiore (fase 1.2) per creare un bifase Bligh-Dyer miscela (cloroformio: metanolo: acqua; 02:02: 1,8, v / v). Mix. Centrifugare a 2000 xg per 10 min.
  17. Rimuovere la fase inferiore in un pallone evaporatore rotante vetro pulito e secco per campione usando evaporazione rotante (Figura 2).
  18. Aggiungere 5 ml di cloroformio: metanolo (4:1, v / v) al pallone rotante e vasca ultrasuoni (> 30 sec) per aiutare nella sospensione dei lipidi dai lati del pallone. Utilizzare una pipetta di vetro per il trasferimento dei lipidi per un ambiente pulitotubo di vetro (13 x 100 mm o maggiore) ricoperto in PTFE rivestito tappi a vite fenolici. Campione secco sotto flusso di azoto utilizzando un essiccatore azoto.
  19. Risospendere lipidi essiccati in 1 ml di cloroformio: metanolo (4:1, v / v). Trasferimento a piccola fiala campione di vetro (12 x 32 mm) con una base conica per risospensione più quantitativa utilizzando piccoli volumi (vedi Tabella delle attrezzature / reagenti). Asciugare con un essiccatore di azoto.
  20. Campione essiccato può essere conservato a -20 ° C fino ad ulteriore TLC (protocollo 2) o analisi MS (protocollo 3, 4, o 5). (Nota: La quantità di materia isolata e utilizzato nei protocolli successivi viene suggerito in base a ciò che è sufficiente per la maggior parte degli organismi Lo stesso campione di lipidi può essere utilizzato in protocolli 2-5, prendendo atto del materiale rimosso% Vedere Consigli per maggiori dettagli...).

2. Visualization of Lipid specie tramite cromatografia su strato sottile

  1. Preparare il sistema TLC fase mobile solvente (cloroformio: piridina: 88% acido formico: acqua, 50:50:16:5 v / v). CombinE 200 ml di cloroformio, 200 ml di piridina, 64 ml di 88% di acido formico, e 20 ml di acqua in un flacone solvente 1 L. Tappo di bottiglia, mescolare per inversione più volte, e di sfiato.
  2. Utilizzare un serbatoio di TLC che ospiterà 20 x 20 piatti cm. Linea serbatoio TLC con ~ carta cromatografica 40 cm.
  3. Per serbatoio TLC aggiungere 200 ml di cloroformio: piridina: 88% di acido formico: acqua (50:50:16:5, v / v) della miscela. Lasciare serbatoio di pre-equilibrare per> 3 ore, spesso O / N è preferibile e più conveniente.
  4. Rimuovere i campioni di lipidi secche freezer (punto 1.20) e lasciar caldo per RT.
  5. Con un rasoio rimuovere la silice dal bordo superiore di una piastra di gel di silice 60 TLC. Con una matita sordo, disegnare una linea parallela al fondo della piastra, 2 cm dal fondo. Questa linea è l'origine per individuare i campioni. Mark incrementa lungo questa linea di riferimento per individuare campioni 1 cm l'uno dall'altro.
  6. Sciogliere lipidi essiccati dal punto 2.4 in 200 ml di cloroformio: metanolo (4:1, v / v), vortice e sonicare (3x, ~ 15 sec ciascuno), i rendimenti ~ 100 -500 ng / ml lipide A se estratto da E. coli.
  7. Usando una pipetta di vetro microcapillare, individuare un decimo del volume (20 microlitri) sulla piastra TLC come indicato al punto 2.5. Lasciare i campioni di aria secca sulla piastra TLC per ~ 15 min. (Nota: i campioni in fiale piccolo vetro possono essere asciugati con un essiccatore azoto e conservati a -20 ° C per il successivo impiego in protocolli 3-5 Prendere nota del materiale% rimosso.).
  8. Posizionare la piastra TLC contenente campioni macchiati nel serbatoio pre-equilibrata. Una volta davanti solvente raggiunge la parte superiore della piastra TLC (~ 2,5-3 hr), rimuovere la piastra e asciugare all'aria (> 60 min). Una pistola ad aria fredda può essere utilizzato per garantire la completa secchezza.
  9. Mentre la piastra si asciuga, accendere piatto caldo a 250 ° C per carbonizzazione.
  10. In una cappa ventilata, preparare miscela al 10% di acido solforico-etanolo per carbonizzazione lipidi risolti sulla piastra TLC di silice (acido solforico concentrato: 100% di etanolo; 01:09 v / v). Misurare 10 ml di acido solforico e aggiungere lentamente 90 ml di etanolo al 100%. Curacompletamente mescolare e versare in un bicchiere cromatografica reagente atomizzatore.
  11. Nella cappa, utilizzare un vetro cromatografica atomizzatore reagente per spruzzare la piastra TLC essiccato con miscela al 10% di acido solforico-etanolo. Spruzzare miscela in modo uniforme su tutta la piastra.
  12. Posizionare la piastra TLC sul piatto caldo a 250 ° C fino a quando i campioni di lipidi carbonizzati appaiono come macchie nere / marroni (<1 min). Non esporre troppo il piatto, in quanto ciò causerà l'intera piastra per accendere marrone e rendere la visualizzazione di specie un lipide difficile.

3. Caratterizzazione strutturale di lipide A via MALDI-TOF

  1. Dal punto 1.20, (o punto 2.7) rimuovere lipide A campione dal freezer e lasciare caldo per RT. Risospendere lipide essiccato Un campione in ~ 20 microlitri cloroformio: metanolo (4:1, v / v) e agitare per ottenere una ~ 1-5 mg / mL lipide A soluzione se estratto da E. coli. (Nota: il 10% in meno concentrato se il materiale utilizzato dal punto 2.7).
  2. Preparare componenti della matrice ATT. Saturi 6-aza-2-thiothymine nel 50% acetonitrile: aggiungere 500 ml di acqua e 500 ml di acetonitrile in una provetta da 1,5 ml, e quindi aggiungere> 10 mg 6-aza-2-thiothymine in modo che l'acetonitrile 50% è super-saturi. Satura tribasico soluzione di citrato ammonico: Aggiungi> 1 mg a 500 microlitri di acqua, precipitare dovrebbe essere evidente. Le soluzioni Vortex e centrifugare prima dell'uso; sono utilizzati al solo surnatante saturi.
  3. Preparare miscela matrice ATT: saturi 6-aza-2-thiothymine in 50% acetonitrile, satura di ammonio citrato tribasico (20:1 v / v). Mescolare componenti della matrice insieme con l'aggiunta di 20 ml di soluzione di ATT a 1 ml saturi soluzione di citrato ammonico tribasico in tubo da 500 ml microcentrifuga, vortice di mescolare e centrifugare prima di applicare a piastra MALDI.
  4. Preparare piastra MALDI aggiungendo miscela calibratore 0,5 microlitri alla piastra MALDI in un luogo vicino a dove saranno depositati i campioni, per fornire il rapporto più accurata determinazione della massa / carica.
  5. Depositare 0,5 microlitridi matrice ATT sulla piastra MALDI su ogni punto in cui verrà depositato lipide A campione.
  6. Cassetta 0,5 microlitri di campione (2,5% del totale del campione) sul punto di matrice ATT, da mescolare sulla piastra, e acquisire spettri campione scansione per segnali ottimali di ioni (Figura 3). Nota: Gli importi per il più ottimale MS segnale può variare con l'organismo e devono essere determinati empiricamente. Per aggiungere più materiale si può macchiare 0,5 microlitri più volte permettendo miscela avvistato ad asciugare tra l'aggiunta di più campione. Il campione può anche essere concentrato (secco e risospendere in un volume più piccolo) o diluito come necessario. Altro materiale di partenza (volume di avviare coltura cellulare) può anche essere usato (vedi la discussione).

4. Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa e Collision Induced dissociazione of Lipid A

  1. Preparare una cloroformio: metanolo miscela solvente (1:1 v / v) mescolando un magazzino 200 ml di metanolo per HPLC con 200 ml grado HPLC cloroformio in un sol bicchierevent bottiglia.
  2. Trasferire 200 ml di cloroformio: metanolo miscela solvente nel flaconcino con lipide A (ad esempio dal punto 1.20, 2.7, o essiccati dopo Protocol 3) e sonicare lipide una soluzione per 5 minuti o fino a quando tutto il materiale è disciolto.
  3. Impostare lo spettrometro di massa per ionizzazione negativa modalità elettrospray.
  4. Utilizzando una siringa 250 microlitri e una pompa a siringa, infondere direttamente il lipide A diluita campione ad una velocità di flusso di 2,0-3,5 ml / min.
  5. Ottimizzare e migliorare il lipide A segnale di ioni sintonizzando l'ottica di ioni. Una gamma completa di massa può ora essere raccolte della specie lipide A (Figura 4).
  6. Isolare e attivare la porta lipide A selezionando CID come metodo MS / MS.
  7. Aumentare la tensione CID (o energia di collisione normalizzato, NCE) fino lipide precursore Una specie è circa il 10% abbondanza relativa rispetto alla massima ione prodotto.
  8. Acquisire e spettri medi fino sufficiente segnale-rumore si ottiene per ªe ioni prodotto. Il numero di scansioni necessarie dipende dall'intensità del precursore segnale originale e può variare 3-300 scansioni (Figura 5A).

5. MS / MS il lipide A da Ultraviolet fotodissociazione

  1. Preparare il campione e spettrometro di massa come nei passaggi 4,1-4,5.
  2. Accendere il laser interfacciato allo spettrometro di massa. Lo spettrometro di massa è stato equipaggiato con un laser ad eccimeri 193 nm e modificato per consentire l'attivazione UV nella cella HCD dello strumento. Fotodissociazione stato attuato in un modo simile a quello descritto in precedenza 35. Usiamo un collettore sottovuoto modificato con una finestra ottica CaF 2 per trasmettere i fotoni in maggiore energia C-trap dissociazione (HCD) cell. Il laser viene attivato durante MS / MS da una logica transistor-transistor (TTL) segnale spettrometro di massa a un generatore di impulsi / ritardo.
  3. Impostare il software strumento in modo che il laser attiverà il laser ad eccimeri quando l'ioni di entrare nella cellula HCD. Ciò richiede una modesta modifica del software.
  4. Accendere il generatore di impulsi in modo che il laser è impulsata ogni 2 msec (500 Hz).
  5. Isolare il lipide A ione precursore selezionando HCD come metodo di MS / MS e regolare l'energia di collisione al 1% NCE. Questo permette l'isolamento di ioni precursori per la dissociazione ultravioletta all'interno della cella HCD. Anche se si utilizza la cella HCD, il programma viene modificato per eseguire UVPD durante questo intervallo.
  6. Attivare il lipide A isolato ione aumentando l'energia laser e regolando il numero di impulsi laser. Un tipico esperimento UVPD verrà eseguita utilizzando dieci 6 ml impulsi.
  7. Come nella fase 4.8, acquisire e spettri medi fino rumore segnale-sufficiente si ottiene per gli ioni prodotto UVPD. Il numero di scansioni necessarie dipende dall'intensità del precursore segnale originale e può variare 3-300 scansioni (Figura 5B).

6. 32 P-Labelingof Lipid A e isolamento successivo

  1. Inoculare 5 ml di media (brodo Luria o altri supporti) da una singola colonia. Grow O / N a 37 ° C oa temperatura desiderata.
  2. Il giorno successivo, misurare il diametro esterno 600 e utilizzare la cultura O / N per inoculare 7 ml di coltura per un OD di partenza di 600 ~ 0,05, coltivate in 20 x 150 mm provetta di coltura monouso in vetro standard. Aggiungere 2,5 uCi / ml di inorganico 32 P. Crescere le cellule fino a quando un OD 600 di 0.8-1.0 è raggiunto. Si prega di seguire federali, statali e / o linee guida istituzionali per la manipolazione sicura e corretta dei materiali radioattivi.
  3. Celle di raccolta in 16 x 125 provette da centrifuga mm di vetro con PTFE allineati cappuccio con una centrifuga clinica angolo fisso a 1.500 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante in apposito contenitore per i rifiuti radioattivi. Tutti i rifiuti radioattivi (ad esempio liquido, vetro, rischio biologico) generati nei passaggi successivi devono essere smaltiti secondo le disposizioni federali, statali e / o gui istituzionaledelines.
  4. Lavare pellet di cellule con 5 ml di 1x tampone fosfato (PBS). Centrifugare per 10 minuti a 1500 x g. Scartare il surnatante.
  5. Risospendere le cellule in 5 ml di monofase miscela Bligh-Dyer (Figura 2) costituita da cloroformio: metanolo: acqua (1:2:0.8, v / v). Vortex per miscelare e incubare a temperatura ambiente per> 20 min per garantire la lisi cellulare completo.
  6. Centrifugare in centrifuga clinica a 1.500 xg per 20 min. Versare delicatamente il surnatante, che contiene fosfolipidi e lipidi isoprenyl.
  7. Risospendere il pellet LPS in 1,8 ml di acetato di sodio 50 mM, pH 4,5, 1% SDS tampone nel vortex. Sottoporre ad ultrasuoni campione utilizzando un sonicatore bagno fino a pellet è uniformemente disperso (~ 30 sec).
  8. Incubare il campione per 30 minuti in bagno di acqua bollente. Assicurarsi che i tappi sono stretti ma non sigillato.
  9. Togliere dal bagnomaria e lasciare raffreddare campione a temperatura ambiente per 5-10 min.
  10. Convertire la soluzione in una miscela bifase Bligh-Dyer aggiungendo 2 ml di cloroformio e 2 ml dimetanolo, ottenendo una cloroformio: metanolo: miscela acquosa (2:2:1.8 v / v). Vortex per mescolare e centrifugare per 10 minuti a centrifuga clinica a 1.500 xg per fasi separate.
  11. Estrarre la fase inferiore in una provetta da centrifuga vetro pulito usando una pipetta di vetro (prima estrazione).
  12. Effettuare una seconda estrazione sul campione aggiungendo 2 ml di pre-equilibrata bifase Bligh-Dyer fase inferiore (preparati come al punto 1.2) per la fase superiore rimanente dal passo 11. Vortex e centrifugare 10 min. Rimuovere fase inferiore e si combinano con la fase inferiore dalla prima estrazione.
  13. Per la fase inferiore pooled (~ 4 ml di volume totale), aggiungere 7,6 ml di pre-equilibrata fase superiore (fase 1.2), ottenendo una soluzione Bligh-Dyer bifase (cloroformio: metanolo: acqua; 2:2:1.8, v / v). Vortex e centrifugare per 10 min.
  14. Rimuovere la fase inferiore ad una provetta pulita e asciugare con un essiccatore azoto. Campioni essiccati possono essere conservati a -20 ° C fino all'utilizzo.

7. Visualizzione di 32 P-marcato lipide A Specie tramite cromatografia su strato sottile

  1. Preparare 32 P-marcato lipide A campione, serbatoio TLC, e piastre TLC come descritto nei passaggi 2,1-2,8.
  2. Sciogliere 32 campione P-marcato in 500 microlitri di 4:1 cloroformio-metanolo (v / v). Vortex e bagno ultrasuoni per sciogliere completamente il materiale lipidico. Aggiungere 5 ml di campione di fiala di scintillazione contenente 5 ml di cocktail di scintillazione. Conte in contatore a scintillazione e calcolare totale conteggi / min di campione.
  3. Quando visualizzando specie lipidiche radiomarcati, possono essere utilizzati 10 x 20 cm o 20 cm x 20 piastre TLC. Per le lastre 10x20 cm, i campioni devono essere individuati lungo l'origine marcata nella fase 2.5 in modo che la dimensione più lunga del piatto è verticale (ossia campioni macchiato all'origine assegnati 2 cm sopra il bordo 10 cm).
  4. Usando una pipetta microcapillare spot 10.000-20.000 cpm / campione sul piatto e lasciare macchie asciugare (> 15 min). I campioni potrebbero dover essere concentrati mediante essiccazione aazoto e risospese in un volume adeguato, per raggiungere 10.000-20.000 conteggi / min / spot (2 ml o 2 ml per volta per <10 microlitri totale).
  5. Posizionare la piastra TLC contenente campioni radioattivi nel serbatoio pre-equilibrata. Una volta davanti solvente raggiunge la parte superiore della piastra TLC (~ 3 ore), rimuovere la piastra e asciugare all'aria (> 60 min). Attenzione: piastre TLC eseguiti in presenza di piridina devono essere asciugati accuratamente in una cappa, come tracce di piridina possono danneggiare schermi phosphorimaging. Una pistola ad aria fredda può essere utilizzato per garantire la completa secchezza.
  6. Avvolgere la piastra nella pellicola e esporre a schermo phosphorimager in un autoradiografia cassette O / N. La mattina successiva, la scansione dello schermo per ottenere l'immagine (Figura 6). Utilizzando immagine software di analisi densitometria, questo metodo consente di preciso, quantificazione relativa di specie un lipide.

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Representative Results

Canonical lipide A di E. coli e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium è un disaccaride esa-acilato di glucosamina con i gruppi fosfato al 1 - e 4 'posizioni. Durante la crescita in mezzi ricchi (es Luria Broth) una porzione del lipide A contiene un gruppo pirofosfato nella posizione 1 cedevole Tris-fosforilata specie 36 (Figura 1). Kdo (D-manno-octulosonic-3-deossi acido), è attaccato al 6'-idrossile e serve come un ponte per collegare lipide A ai settori di carboidrati rimanenti (cioè oligosaccaridiche core e domini O-antigene) di LPS. Sebbene i batteri gram-negativi condividono un percorso conservato per lipide A biosintesi simile a quella di E. coli K-12, vi è una grande quantità di diversità in strutture un lipide. Questa diversità deriva dall'azione di enzimi latenti che modificano la struttura di un lipide, che sono attivati ​​in risposta a stimoli ambientali. Per example, in S. enterica gruppi fosfato di lipide A possono essere modificati con lo zucchero cationico L-4-aminoarabinose (Figura 1; blu) o con un residuo fosfoetanolamina (Figura 1; magenta). In Salmonella queste modifiche sono regolate da sistemi a due componenti regolatore di risposta, aggiunto in risposta a partire [Mg 2 +], pH neutro-acido, e la presenza di peptidi antimicrobici cationici. Inoltre in Salmonella, palmitato può essere aggiunto per formare un epta-acilato lipide A, che promuove la resistenza a peptidi antimicrobici cationici (Figura 1; verde) 8. Altre modifiche includono, ma non sono limitati a, la rimozione di gruppi fosfato e catene acile, o diossigenasi catalizzata aggiunta di un gruppo idrossile alla catena acil derivato 3'-linked osservato in un numero di organismi 1,3.

Isolamento di intatta lipide A da cellule intere dalla nostra modifica del metodo di Caroff e Raetz è descritto nel protocollo 1 (Figura 2). Questo metodo di isolamento è stato usato per stimare che esistano 10 6 molecole di lipide A per cellula batterica di E. coli 37. Seguenti protocolli 1 e 3, lo ione negativo MALDI-TOF spettro di massa del lipide A di E. coli K-12 (W3110) produce lo ione singolarmente deprotonata ([MH] -) m / z 1,796.20 come specie majorly osservati (Figura 3). MALDI-TOF MS è stata eseguita in modalità negativa-reflectron per migliorare la risoluzione spettrale. In alternativa, lo stesso campione lipidico sottoposto a modalità negativa nano-ESI (protocollo 4) produce prevalentemente doppiamente deprotonato ioni lipide A a m / z 898,1 denotata da [M-2H] 2 - (Figura 4). Singolarmente deprotonato ioni lipide A [MH] - m / z 1,796.20 sono osservabili, ma sono di minore abbondanza relativa di [M-2H] 2 - ioni (Figura 4). Specie Multiply cariche prevalentementenate quando si utilizza ESI. Frammentazione CID (figura 5A) o 193 nm UVPD (Figura 5B) è stata eseguita sulla [MH] - lipide A ione m / z 1,796.20. Queste tecniche possono essere utilizzate per assegnare meglio strutture chimiche, in particolare della specie lipide A contenenti combinazioni complesse di modifiche o modificazioni chimiche precedenza non caratterizzate. Profili di frammentazione sono mostrati con linee tratteggiate rappresentano siti di taglio e sono abbinati con i valori m / z sotto ogni struttura disponibile (Figura 5). I valori di m / z e siti di taglio evidenziate in carattere rosso rappresentare ioni prodotto univoco associato UVPD.

Come descritto in protocolli 6 e 7, 32 lipidi P-marcato Un isolato di due diversi E. coli K-12 ceppi è stato analizzato mediante TLC (Figura 6). W3110 contiene soprattutto-bis e tris-fosforilata lipide A (Figura 6;corsia sinistra), mentre un modello più complesso TLC è osservata con 32 P-lipide A isolato da E. coli WD101 (figura 6; corsia di destra) 38. WD101 produce lipide A pesantemente modificato con aminoarabinose (L-Ara4N) e fosfoetanolamina (PETN). Poiché sia 1 - e 4 '- fosfati sono disponibili per la modifica, lipide A di WD101 può essere descritto come singolarmente modificati contenenti una sola L-Ara4N o PETN sia a fosfato, o doppiamente modificato dove entrambe fosfati vengono modificate in maniera combinatoria. Oltre alle modifiche al 1 - e 4 '- fosfati, si osserva anche palmitato aggiunta (vedi Figura 1) e aumenta il valore f R di specie un lipide in questo sistema solvente (Figura 6). Se lo si desidera, analisi densitometrica utilizzando un phosphorimager, può essere utilizzato per quantificabile stima quantità relative di specie un lipide all'interno dello stesso campione.


Figura 1. Lipidi Rappresentante A strutture di dominio da E. coli K-12 e S. enterica sierotipo Typhimurium. Modifiche al Una struttura lipidica conservati sono mostrati (a destra), come descritto nella Rappresentante dei risultati. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2
Figura 2. Schema del lipide A isolamento procedura. Outline raffigura lisi chimica del pellet cellula batterica utilizzando monofase miscela Bligh-Dyer, centrifugazione del lisato a pellet LPS, lieve-a cid idrolisi per liberare lipide A da polisaccaride attaccato, e la purificazione finale del lipide A con due fasi di estrazione Bligh-Dyer. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3
Figura 3. Analisi MALDI-MS di lipide A isolato da E. coli K-12 (W3110). spettri ottenuti dalla media di> 300 scatti. Singolarmente carica [MH] - lipide A è osservato come lo ione molecolare a m / z 1,796.2, che corrisponde ad una specie deprotonato della struttura mostrata a destra.

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Figura 4. Analisi ESI-MS di lipide A isolato da E. coli K-12 (W3110) Singly [MH] e doppiamente carica [M-2H] 2 -. specie lipidi sono osservati come ioni molecolari di m / z 1,796.2 e m / z 898,1, rispettivamente.

Figura 5
Figura 5. Analisi MS / MS del lipide A isolato da E. coli K-12 (W3110). dissociazione indotta da collisione (A) o fotodissociazione ultravioletta (B) sono stati usati per frammentare il precursore ione m / z 1,796.2. UVPD specifici ioni prodotto sono indicate in rosso. Una mappa frammentazione è prevista (C), dove il nero linee tratteggiate indicano la frammentazione associata sia con CID e UVPD e rosso linee tratteggiate indicano UVPD speframmentazione fica. I valori elencati sotto la mappa frammentazione corrispondono a masse esatte di [MH] -. Ioni prodotto Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 6
Figura 6. Separazione basata TLC di specie un lipide isolato da E. coli K-12 32 P-marcato lipide A è stato isolato da W3110 (corsia di sinistra) o WD101 (corsia di destra) e separati in un sistema solvente serbatoio TLC contenente cloroformio:. piridina: 88% acido formico: acqua (50:50:16 : / 5 v v).

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Discussion

In questo protocollo abbiamo dettagliato l'isolamento di lipidi Una specie di cellule intere di batteri, e descritto TLC o metodi analitici basati MS per caratterizzare chimicamente il materiale isolato. Spettrometria di massa tandem è una potente strategia per de novo caratterizzazione strutturale di composti biologici, ed è prezioso per la caratterizzazione chimica della panoplia di molecole di un lipide osservate in natura. CID e UVPD sono due metodi di attivazione complementari che creano diversi tipi di ioni prodotto che forniscono impronte chiave per molecole di lipidi. MS / MS frammentazione utilizzando sia CID e UVPD permette delucidazione di sottili differenze di strutture lipidi, fornendo dettagli più fini per le assegnazioni struttura chimica. Sono necessari dati di questo tipo per stabilire precise relazioni struttura correlato / funzione nella biologia di lipidi Una specie molecolari. Abbiamo anche descritta la procedura per 32 specie di lipidi A P-radiomarcatura in scolture batteriche mall scala, dove il modello chimico di 32 specie un P-lipidico possono essere visualizzati utilizzando TLC e autoradiografia.

Ci sono un certo numero di caratteristiche di questo protocollo che ogni utente deve essere a conoscenza. Per i preparati lipidi larga scala (protocollo 1), la percentuale di solvente a partire quantità di pellet batterico può essere ottimizzato per migliorare la resa complessiva. Tuttavia questa percentuale può essere determinato solo empiricamente. Gli importi descritti in questo protocollo rappresentano un buon punto di partenza per la maggior parte dei ceppi batterici. Volumi di cultura per una estrazione dei lipidi e l'isolamento possono essere regolati a seconda del ceppo batterico si sta lavorando. Per esempio, V. cholerae richiede almeno 200 ml di coltura per ottenere spettri di massa di alta qualità, tuttavia, il volume di coltura per E. coli può essere scalata fino a 5 ml. È necessario più materiale di partenza (maggiori volumi di coltura) per alcune specie batteriche perché i hydrolysè passo che rilascia lipide A di LPS intero è meno efficiente. Ad esempio, gli organismi che contengono una diossigenasi Kdo funzionale o Kdo chinasi mostre sono diminuiti i rendimenti un lipide dopo lieve-acido idrolisi 39. Spesso, mutanti con strutture A LPS / lipidici alterati o di una particolare specie batteriche sono spesso difficili da pellet durante la raccolta delle cellule. Per questi ceppi, la lunghezza di centrifugazione può essere estesa per aumentare il rendimento. Anche di nota, dopo la lisi cellulare in una monofase Bligh-Dyer miscela e LPS è in granuli (vedi punto 1.9), le fasi di lavaggio aggiuntivi potrebbero essere necessari per ridurre la contaminazione fosfolipidi. Quando si isola lipide A di E. coli o Salmonella, è necessario un solo lavaggio. Tuttavia, se isolando lipide A da altri organismi (es. V. cholerae o Helicobacter pylori), sono necessari ulteriori fasi di lavaggio.

Dopo idrolisi acida mite in SDS, il rendimento delle specie lipidico A con hydrophobicity ridotta (cioè più phogruppi sphate> 2 o meno catene di acidi <5) può essere migliorata utilizzando un estrazione Bligh-Dyer acido. Per i volumi utilizzati nella sezione protocollo 1, aggiungere 225 ml di HCl concentrato alla soluzione di SDS contenente idrolizzato lipide A seguita da 30 ml di cloroformio e 30 ml di metanolo per un bifase Bligh-Dyer miscela di cloroformio: metanolo: 0.1 M HCl (2:2:1.8, v / v). Per i volumi utilizzati nella sezione protocollo 6 aggiungono 15 ml di HCl concentrato alla soluzione di SDS contenente idrolizzato lipide A seguito da 2 ml di cloroformio e 2 ml di metanolo ottenendo una cloroformio: metanolo: 0.1 M HCl (2:2:1.8, v / v) della miscela. Dopo estrazione Bligh-Dyer acida, piridina può essere aggiunto alle fasi inferiori aggregati per neutralizzare l'acido (1 goccia di piridina / 2 ml di volume del campione finale). Questo passo ulteriore dovrebbe essere eseguito prima di asciugare il campione, in una cappa. Fare attenzione a non utilizzare piridina eccesso, che può portare alla rimozione di acidi grassi esterificati collegato. Inoltre, se la samp lipidicoLe è difficile da asciugare sotto azoto, aggiungere qualche ml di cloroformio: metanolo (4:1, v / v) al pallone e continuare ad asciugare il campione di completamento.

Il complesso eterogeneità chimica di specie un lipide osservate in alcuni organismi (ad esempio V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) a volte può rendere l'analisi basata su MS-TLC o difficile. La cromatografia su colonna può essere impiegato monte di queste tecniche analitiche pre-frazionare isolati specie lipidico A in miscele più semplici. Scambio anionico con dietilamminoetil (DEAE)-cellulosa è più comunemente usato 40. Come regola generale lipide A modificate in entrambe le posizioni fosfato, con gruppi non-acidi come aminoarabinose o fosfoetanolamina, eluisce prima non modificati specie lipidico A 40. Allo stesso modo tris-fosforilata lipide A eluisce bene dopo non modificate specie bisphosphorylated 36,40. Cromatografia inversione di fase può essere utilizzato per frazionare lipide A species di diversi gradi di idrofobicità 41. La cromatografia su colonna è anche utile nella rimozione di residui SDS dopo idrolisi acida e successiva lipidi Bligh-Dyer A fasi di estrazione. Alti livelli di SDS residui possano contribuire a segnalare la soppressione degli spettri ottenuti dai nostri protocolli ESI-MS sensibili.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni AI064184 e AI76322 dal National Institutes of Health (NIH) e da Grant 61789-MA-MUR dalla ricerca dell'Ufficio dell'Esercito di MST La ricerca è stata sostenuta anche dalla Welch Foundation Grant F1155 e NIH concedere R01GM103655 a JSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

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