بروتوكول لالتعريفي الجيني والتخيل من أورام حميدة والغازية في رأسي مجامع

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

التعاون بين الجين الورمي تفعيلها مثل RAS V12 والطفرات في جينات الخلية القطبية مثل خربش، يؤدي إلى نمو الأورام في ذبابة الفاكهة حيث عرض الخلايا السرطانية أيضا السلوكيات الغازية. هنا يتم تقديم بروتوكول بسيط للتحريض والمراقبة من الأورام الحميدة والغازية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Srivastava, A. A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (79), e50624, doi:10.3791/50624 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد مضيئة ذبابة الفاكهة فهمنا للأساس الجيني للتطور الطبيعي والمرض على مدى العقود القليلة الماضية، واليوم لا تزال تساهم بشكل كبير في فهمنا للأمراض المعقدة 1-7. تطور أورام حميدة من إلى حالة النقيلي هو حدث معقد 8 و تم غرار ذبابة الفاكهة في لتساعدنا على فهم أفضل الأسس الجينية لهذا المرض 9. أنا هنا تقديم بروتوكول بسيط للحث وراثيا، ومراقبة وتحليل ثم تطور الأورام في يرقات ذبابة الفاكهة. ويستند أسلوب الحث الورم على النظام MARCM 10 ويستغل التعاون بين الجين الورمي تفعيلها، رأس V12 وفقدان الجينات قطبية الخلية (خربش، وأقراص كبيرة وقاتلة اليرقات العملاقة) لتوليد الأورام الغازية 9. أنا شرح كيفية يمكن تصور هذه الأورام في يرقات سليمة وثم كيف يمكن تشريح هذه خارج لمزيد من التحليل. بروتوكول مبسطة المقدمة هنا ينبغي أن تجعل من الممكن لهذه التقنية لاستخدامها من قبل المحققين المهتمين في فهم دور الجينات في غزو الورم.

Introduction

تطور أورام حميدة من إلى حالة النقيلي هو عملية خطوة حكيمة التي تتميز التهرب من آليات الحماية الموجودة في الجسم 8. على سبيل المثال الخلايا السرطانية في الجسم يجب أن تكون قادرة على التهرب من موت الخلايا المبرمج وجهاز المناعة، واختراق المصفوفة خارج الخلية المتخصصة (ECM) يسمى الغشاء القاعدي، والتغلب على أي الضوابط الاجتماعية التي تفرضها الخلايا المحيطة 8. فمن خلال التقدم خطوة حكيمة أن الخلايا السرطانية اكتساب القدرة على ترحيل مواقع بعيدة في عملية تسمى الانبثاث واستعمار. فهمنا لكيفية يتغلب على الخلايا السرطانية الحواجز المفروضة من قبل الهيئة لا تزال في مهدها، ومع ذلك، فإن الصورة الناشئة من الأبحاث التي أجريت حتى الآن نقطة إلى الاستخدام المتكرر للعمليات التنموية العادية ومسارات الإشارات من الخلايا السرطانية 11-13.

ذبابة الفاكهة قد ساهم الى حد كبير في ذبابة الفاكهة السوداء البطن اوند لديناerstanding من التطور الطبيعي والمرض من خلال استخدام تقنيات وراثية متطورة وضعت على مدى العقود العديدة الماضية 14-17. باستخدام الطفرات وأدوات من overexpression اننا وصلنا الى فهم أفضل لمختلف الجينات المسرطنة والجينات الكابتة ورم 18-22. ومع ذلك، الورم ورم خبيث هو نتيجة للتعاون بين العديد من الآفات الجينية التي تمت دراستها في المقام الأول في نماذج الثقافة الخلية 23،24 فضلا عن مختلف نماذج طعم أجنبي 25-27. على الرغم من هذه النماذج قوية لديها قيود لأنها لا تحاكي تماما الظروف الموجودة في الكائن الحي. وعلاوة على ذلك، والنماذج المعدلة وراثيا المتوفرة في الفئران هي مرهقة ولا يفضي إلى التحليل الجيني للسلوك الغازية 28،29. وقد حاولت العديد من الدراسات لفهم غزو الخلايا السرطانية في ذبابة الفاكهة 30،31. هذه التقنيات تستخدم في المقام الأول زرع الأورام الأولية إلى المضيفين ومن ثم الاعتماد على تتبع هيئة تنظيم الاتصالاتnsplanted أورام لغزو الأنسجة المجاورة 32،33. تم تكييفها وهناك تقنية قوية تسمى MARCM 10 بواسطة Pagliarini وشو لنموذج غزو الورم في ذبابة الفاكهة 9. هذه النمذجة الوراثية أنيقة من غزو الورم استغلت التعاون بين الجين الورمي تنشيط وفقدان قطبية الخلية. قوة هذه النمذجة يكمن في حقيقة أن الأورام الغازية تم إنشاؤها في كائن حي سليمة وبالتالي الالتفاف على الحاجة لزرع الأنسجة. لتحقيق التعاون أنكجنيك، يتم التعبير عن الجين الورمي تفعيلها مثل رأس V12 في استنساخ الخلايا في العين antennal القرص اليرقات. نتيجة لهذه التقنية MARCM وتتميز هذه الحيوانات المستنسخة أيضا مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) لسهولة التصور ومصنوعة متماثلة اللواقح بالنسبة المسوخ قطبية الخلية مثل يرقات القاتلة العملاقة، خربش، والأقراص الكبيرة. والنتيجة هي GFP الموسومة الأورام الغازية في مجمع رأسي. في هذا التقرير الأولشرح كيفية حمل، ووضع تصور لهذه الأورام الغازية سواء في سياق يرقات سليمة وتشريح خارج مجمع رأسي. تحريض الورم المقدمة هنا تستخدم الكواشف على كروموسوم الثاني من ذبابة الفاكهة. في الجدول 2، وتقديم قائمة من الأسهم على X و 3 الثالثة الكروموسومات التي يمكن استخدامها لنفس الغرض. وأعتقد أن هذا البروتوكول المبسط سوف تجعل هذه التقنية في متناول الجميع للباحثين المهتمين في فهم الأساس الجزيئي لتطور الورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحريض أورام حميدة غير الغازية

  1. استخدام الأسهم المدرجة في الجدول (2) لتحريض الأورام الحميدة.
  2. إعداد ثقافة بداية ل "اختبار" الأسهم من النمط الجيني التالية: ذ، ث، إرنست و يونغ-FLP1؛ حوض-Gal80، FRT40A؛ Act5C> ذ +> GAL4، UAS GFP-
  3. إعداد ثقافة بداية ل "اختبار" الأسهم من النمط الجيني التالية: w؛ FRT40A، UAS الراس V12 / CYO
  4. جمع عشر عذارى الإناث من المخزون "اختبار" وعشرة من الذكور من المخزون "اختبار".
  5. عبور الذكور والإناث من "اختبار" والاسهم "اختبار" عن طريق وضعها في كل من قارورة مع ذبابة الغذاء.
  6. وضع الصليب في حاضنة 25 درجة مئوية، والسماح للذكور والإناث للتزاوج ووضع البيض لمدة 24-48 ساعة.
  7. التحقق من قوارير لترسب البيض كافية لوجود يرقات العمر الأول والتأكد من أن الثقافة لا ينزح.
    1. إضافة بضع قطرات من تعقيمهاالماء المقطر لثقافة لإبقائها رطبة (إن الثقافة وتجفيف).
    2. مواصلة رصد الثقافة وكرر الخطوة 1.7.1 حسب الحاجة.
  8. مراقبة تجول اليرقات طور مرحلي الثالثة تحت stereomicroscope مضان النحو المبين في الفرع 3.

2. تحريض الأورام الغازية

  1. استخدام الأسهم المدرجة في الجدول (2) لتحريض الأورام الغازية.
  2. استخدام الثقافة بداية من الخطوة 1.2 أعلاه من النمط الجيني التالية: ذ، ث، إرنست و يونغ-FLP1؛ حوض-Gal80، FRT40A؛ Act5C> ذ +> GAL4، UAS GFP-
  3. إعداد ثقافة بداية ل "اختبار" الأسهم من النمط الجيني التالية: w؛ LGL FRT40A، UAS الراس V12 / CYO
  4. جمع عشر عذارى الإناث من المخزون "اختبار" وعشرة من الذكور من المخزون "اختبار".
  5. عبور الذكور والإناث من "اختبار" والاسهم "اختبار" عن طريق وضعها في كل من قارورة مع ذبابة والعود.
  6. وضع الصليب في حاضنة 25 درجة مئوية، والسماح للذكور والإناث للتزاوج ووضع البيض لمدة 24-48 ساعة.
  7. التحقق من قوارير لترسب البيض كافية لوجود يرقات العمر الأول والتأكد من أن الثقافة لا ينزح.
    1. إضافة بضع قطرات من الماء المقطر تعقيمها للثقافة لإبقائها رطبة (إن الثقافة وتجفيف).
    2. مواصلة رصد الثقافة لجفاف وكرر الخطوة 2.7.1 حسب الحاجة.
  8. مراقبة يرقات العمر الثالث تحت stereomicroscope مضان النحو المبين في الفرع 3.

3. رصد أورام حميدة والغازية

  1. استخدام يرقات العمر الثالث للحميدة العزلة الورم والتصور.
    1. الرطب فرشاة الطلاء في الماء المقطر، واستخدام هذه الفرشاة الطلاء كشط بضع يرقات العمر الثالث من جدار القارورة الثقافة.
    2. وضع اليرقات في شريحة الاكتئاب مع 1X PBS ثم باستخدام فرشاة مبللة الطلاء الخردةالبريد من أي المواد الغذائية من البشرة اليرقات.
    3. وضع اليرقات في طبق بتري ويترك في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لشل حركة اليرقة.
      1. طريقة بديلة للشل حركة اليرقات باستخدام FLYNAP.
      2. وضع عصا FLYNAP مغموسة في FLYNAP إلى قارورة من 3.1.3.2 وبعد توصيل دعونا القارورة تسد القارورة مع يرقات الوقوف لمدة 30 إلى 40 دقيقة.
    4. وضع اليرقة يجمد على شريحة زجاجية، إضافة قطرة من زيت الهالوكربون الضوء، وتغطي مع غطاء زجاجي ومراقبة تحت stereomicroscope مضان مع القدرة على تصور الفلورية الخضراء البروتين (GFP).
    5. سوف ورم حميد تحمل اليرقات يتألق الخضراء في المنطقة الأمامية حيث مجمع الرأس موجودا.
  2. حدد يوم 10 اليرقات (بعد الاستقراء) من الثقافة بتعيينها في الخطوة # 2 أعلاه لرصد الأورام الغازية. ويتم اختيار يوم 10 اليرقات بسبب تأثير الورم الغازية اليرقات لها ل موسعةالمرحلة ARVAL وعموما تفشل في pupariate.
  3. اتبع الخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.4 باستثناء بدلا من يوم الثالث الطور استخدام يرقات 10 اليرقات.
    1. وسوف تحمل الورم الغازية اليرقات يوم 10 يتألق الخضراء في المنطقة الأمامية حيث مجمع الرأس موجودا.
  4. إذا تم تجهيز المجهر الفلورسنت مع كاميرا رقمية ثم التقاط صور للالاستشعاع حميدة والغازية تحمل اليرقات الورم.

4. تشريح للمراقبة في مجمع وكذلك رأسي من الأورام الحميدة والغازية

البشرة شفافة من اليرقة يجعل من الصعب مراقبة مدى غزو الأورام. وبالتالي مدى الغزو هو تصور أفضل عن طريق تشريح مجمع رأسي من اليرقة. وينبغي أن تستخدم الخطوات التالية لتشريح مجمع رأسي.

  1. باستخدام فرشاة الطلاء الرطب حدد يرقات الطور الثالث (للأورام حميدة) ويوم 10 اليرقات (للأورام الغازية) وROM قارورة الثقافة المعنية.
  2. وضع اليرقات في بئر طبق تشريح تحتوي على 1X PBS الباردة. استخدام فرشاة الطلاء لكشط أي جزيئات الطعام من البشرة اليرقات.
    1. نقل اليرقات نظيفة لبئر جديدة للطبق تشريح تحتوي على 1X PBS الباردة.
    2. تحقق من وجود GFP مضان باستخدام stereomicroscope قادرة على الكشف عن مضان. تجاهل غير GFP اليرقات الحاملة.
  3. إضافة 1.0ml من 1X PBS الباردة إلى بئر جديدة على طبق تشريح وباستخدام زوج من ملقط نقل اليرقة تحمل إما أورام حميدة أو الغازية (يبقى بروتوكول تشريح نفسه لهذين النوعين من الأورام).
  4. عقد اليرقة أسفل باستخدام زوج من ملقط حول 2/3rds من نهاية الأمامي.
    1. استخدام زوج آخر من ملقط وفصل بذكاء وعليها 1/3rd الخلفي لليرقة وتخلص منه.
    2. ترك من 2/3rds الأمامي من اليرقة. كما يتم تحرير الضغط داخل يرقة محتوياتسوف يرقة طين من تجويف الجسم.
    3. استخدام زوج من ملقط لإزالة الأمعاء، والدهون في الجسم الداخلية محتويات أخرى من اليرقة التي يرشحان من تجويف الجسم.
    4. استخدام زوج من ملقط لعقد ربط فم اليرقة ودفعها إلى البشرة اليرقات واستخدام زوج آخر من ملقط عكس اليرقة تماما.
    5. استخدام ملقط بلطف وعناية لإزالة الدهون في الجسم والغدد اللعابية، امعاء، مجمع القرص الجناح وأنابيب القصبة الهوائية أي. يجب أن تكون معقدة رأسي الآن مرئية تعلق على ربط فم اليرقة مقلوب. سيظل متصلا نصفي الدماغ والحبل البطني العصب (VNC) للبشرة اليرقات من خلال الأعصاب المنبثقة من فنك.
    6. استخدام زوج من ملقط لكسر بلطف الاتصالات بين الأعصاب الرأس والبشرة اليرقات.
    7. كما يتم تقسيم الاتصالات العصبية بين فنك والبشرة اليرقات والجسم الدهون الزائدة والأنسجة الأخرى إزالتها، وشارك في رأسيmplex سوف تصبح واضحة للعيان وسوف تعلق على البشرة اليرقات فقط في السنانير الفم.
    8. يمكن ترك المجمع رأسي تعلق على البشرة اليرقات إذا يحتاج المجمع إلى أن تكون ثابتة للتطبيقات المصب مثل تلوين الأجسام المضادة أو التصور في وقت لاحق.
    9. إذا كان سيتم تنفيذ أي طلبات المصب مزيد من ثم مجمع رأسي يمكن فصل اليرقات من البشرة وضعها في قطرة من الجلسرين سائل الاعلام القائمة المتزايدة لمزيد من المراقبة والتحليل. استخدام VECTASHIELD وسائل الإعلام في تصاعد مستمر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما قدمت نتيجة للبروتوكول المستخدم هنا سوف تكون قادرة على إحداث أورام حميدة من قبل overexpressing الجين الورمي تفعيلها في العين قرص تخيلي antennal اليرقات. وسيكون المستخدم قادرا على حمل الأورام الغازية في القرص antennal العين عن طريق overexpressing الجين الورمي في تنشيط الحيوانات المستنسخة من خلايا متحولة أيضا لجين قطبية الخلية أيضا. الأورام يمكن تصور بسهولة مع مساعدة من stereomicroscope الفلورسنت باسم "الفلورية الخضراء" في الأنسجة اليرقات كليا أو المجمعات الرأس التي تم تشريح خارج تجويف الجسم اليرقات (الشكل 1). وسوف تكون مترجمة الأورام حميدة إلى مجمع القرص antennal العين كما استنساخ الخلايا GFP إيجابية في حين أن الأورام الغازية سيؤدي إلى فرط هائلة من الأورام والهجرة اللاحقة من GFP إيجابية الأورام الغازية إلى فنك والأجهزة الأخرى القريبة. في يرقات العمر> 10 يوم (مشتقة من النمط الجيني الورم الغازية) GFP إيجابية وأورام ثانوية منفصلة floaتينغ في تجويف الجسم اليرقات يمكن أيضا ملاحظتها. وعلاوة على ذلك، في حين أن يرقات تحمل أورام حميدة pupariate في الوقت المحدد، وتلك التي تحمل الأورام الغازية لها فترة طويلة اليرقات وتفشل في pupariate. هذه الأورام الغازية التي تحمل اليرقات يمكن ملاحظتها بسهولة على أنها "اليرقات العملاقة" مع السوائل تملأ تجويف الجسم.

الشكل 1
الشكل 1. . الأورام الحميدة والغازية في ذبابة الفاكهة ترك AB الفريق: الأخضر الاستشعاع يرقة المصابين بأورام حميدة والغازية، على التوالي اللوحة اليمنى AB: تشريح المجمعات رأسي من اليرقات تحمل إما أورام حميدة أو الغازية على التوالي A) يتم ترجمة الأورام الحميدة إلى العين antennal. القرص حيث أنها يسببها. تلاحظ أن النسيج المسمى GFP لم هاجروا إلى أجهزة متجاورة مثلالحبل البطني العصب (VNC). قارن هذا إلى B. B) تحمل الأورام الغازية معقدة رأسي من يرقة يوم 10. لاحظ فرط نمو أنسجة الورم (الخضراء) وغزو أجهزة متجاورة مثل VNC والسنانير الفم من الأنسجة الورم (المشار إليها بواسطة السهم الأحمر) أيضا. يشار إلى غزو أجهزة متجاورة من أنسجة الورم الغازية مع سهم. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الرقم 2
الشكل 2. وهناك مخطط لتصنيف الأورام الغازية على أساس مدى الهجرة خلال فنك. يظهر التخطيطي للVNC مع حد للهجرة الورم يصور مع ملء اللون الأخضر. عدد المرتبطةوتعطى شدة الهجرة فوق كل التخطيطي.

كروموسوم # سلالة اختبار التركيب الوراثي اختبار التركيب الوراثي السلالة مرجع
أورام حميدة الأورام الغازية
1 ث، حوض استحمام-Gal80، FRT19A؛ إرنست و يونغ-FLP5، Act5C> ذ +> GAL4، UAS GFP- ث، FRT19A؛ UAS الراس V12 DLG M52، FRT19A/FM7C؛ UAS الراس V12 Pagliarini وشو 2003
2 ذ، ث، إرنست و يونغ-FLP1؛ حوض-Gal80، FRT40A؛ Act5C> ذ +> GAL4، UAS GFP- ث؛ FRT40A، UAS الراس V12 / CYO ث؛ LGL FRT40A، UAS الراس V12 / CYO Pagliarini وشو 2003
3 ذ، ث، إرنست و يونغ-FLP1؛ Act5C> ذ +> GAL4، UAS GFP-؛FRT82B، حوض استحمام-Gal80 ث؛ UAS الراس V12؛ FRT82B ث؛ UAS الراس V12؛ FRT82B، scrib 1 / TM6Tb Pagliarini وشو 2003

الجدول 2. النمط الجيني للمخزونات اللازمة للحث على الأورام الحميدة والغازية. وقد وصفت جميع الأسهم في المرجع المشار إليه. ينبغي أن يطلب من مخزونات المختبر من تيان شو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

السرطان هو مرض معقد مع فهم أفضل بكثير اليوم مما كانت عليه في الماضي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يمكن تعلمه يحتاج وأوضح من قبل لدينا صورة كاملة عن الآليات الكامنة. بروتوكول المعروضة هنا بسيطة يجعل من الممكن للحث على راثيا الأورام الحميدة والغازية في الحي كله ومن ثم دراسة علم الأحياء المرتبطة تطور أورام في هذا النموذج. معظم التقنيات الموجودة في ذبابة الفاكهة وغيرها من الكائنات إما الاستفادة من الثقافة القائمة على نظام الخلية لتكون الأورام وفهم ورم خبيث أو أن النظام يعمل زرع أنسجة الورم الرئيسي في المضيفين الكبار 23-27. كل من الخلية والتقنيات القائمة على زرع لها حدودها. على سبيل المثال، تقنية زرع مرهقة وتستغرق وقتا طويلا ويمكن أن يؤدي إلى زرع الأنسجة غير السرطانية-إلى المضيف. هذا يمكن أن يؤدي إلى إنتاج الأعمال الفنية التجريبية. علاوة على ذلك، عبادة الخليةنظم لدى عودتهم استنادا تقريبية فقط من البيئة الحقيقية موجود في الحي كله. هذا القيد يجعل من الصعب تقليد الورم مهم جدا والتفاعل البيئة الدقيقة التي تلعب دورا حاسما في تطور الورم والانبثاث 34. تقنية المعروضة هنا قد استخدمت بنجاح من قبل عدة مجموعات بحثية للتحقيق في الأساس الجيني والجزيئي للتطور الورم في ذبابة الفاكهة. على سبيل المثال، وذلك باستخدام هذه التقنية وقد تبين أن المسار JNK على حد سواء upregulated في الأورام الغازية وضروري أيضا لتطور أورام 35،36. في دراسة أخرى وقد تجلى دور ماتريكس MetalloProtease في تطور الورم في هذا النموذج 12،37 الوراثية.

الخطوات الحاسمة المرتبطة مع بروتوكول المعروضة هنا تبدأ مع النمط الوراثي الصحيح من الأسهم تستخدم للتحريض الأورام الحميدة والغازية. ينبغي توخي الحذر لضمان أن هذهالأسهم لا "الانهيار". الأسهم يمكن فحصها دوريا لوجود الصفراء (ص -) الذباب الذي من شأنه أن يكون مؤشرا على انهيار الأسهم. فإن هذا يشير إلى أن كاسيت FLP خارج في الأسهم اختبار MARCM قد انقلبت بشكل عفوي خارج، وبالتالي سيكون معبرا عن GAL4 جوهري. هذا يمكن الوقاية عن طريق الحفاظ على مخزون مكررة في قارورة وعند 18 درجة مئوية. أيضا، كما وبفعل الأورام، واليوم الذي يجب أن يتم التحقق اليرقات للأورام الحميدة والغازية أمر بالغ الأهمية أيضا. في حين تحمل ورم حميد اليرقات اتباع جدول زمني التنموية مشابه ارتباطا وثيقا النوع البري اليرقات، قصة مع تحمل اليرقات الأورام الغازية مختلفة. الورم الغازية تحمل اليرقات العرض تمديد مرحلة اليرقات وبعض تفشل في pupariate. بل وقد استخدمت هذه الخاصية من pupariation مقابل pupariation فشلت كمقياس للقمع الورم الغازية التي كتبها Menut آخرون 38 بسبب اليرقات موسعةالمرحلة الغازية في تحمل اليرقات الورم فمن الأهمية بمكان أن نلاحظ الأورام الغازية حوالي 8-10 يوم آخر الحث للحصول على أفضل النتائج. في اليوم الذي حدث 8-10 بما فيه الكفاية الهجرة الورم على VNC بحيث يمكن ملاحظتها بسهولة تحت المجهر ستيريو. ما بعد يوم 10، في حين أن الورم يمكن ملاحظتها، ويبدأ بابتلاع تماما VNC مما يجعل من الصعب توجيه معقدة رأسي في عينات تشريح. خطوة حاسمة أخرى يرتبط التصور الأورام في اليرقات كله هو القدرة على شل اليرقات. كلا FlyNap وانخفاض درجات الحرارة يمكن استخدامها لشل حركة اليرقات على النحو المبين في بروتوكول مفصلة. أخيرا، إذا كان بحاجة إلى المجمعات رأسي تشريح لتكون ملطخة مع الأجسام المضادة بعد ذلك ينبغي أن يتم تشريح خارجا على الجليد وينبغي أن تكون ثابتة المجمعات في غضون ثلاثين دقيقة.

تقنية المعروضة هنا يمكن الاستفادة منها من قبل الباحثين لفهم مساهمة الجينات يشتبه في أن تلعب دورا في تطور الورم.باستخدام هذا النموذج الجيني التنظيم حتى الجين يمكن دراستها في الموقع من خلال تقنيات تلوين الأجسام المضادة أو من خلال استخدام RT-PCR. يمكن للمرء أيضا محاولة لفهم ما إذا كان الجين ضروري لتطور الورم عن طريق استخدام هذا النموذج في تركيبة مع المسوخ لهذا الجين في سؤال أو الكواشف رني. على سبيل المثال، يمكن للكاشف رني لجين لفحصها لقمع الورم تكون موجودة على كروموسوم 3 الثالثة. في هذه الحالة يمكن استخدام اختبار واختبار مزيج من الأوراق المالية لكروموسوم 2 (الجدول 2) إلا بعد رني تحمل وقد عبرت 3 الثالثة كروموسوم في الأسهم التي تم اختبارها. مرة واحدة وقد تحقق هذا بعد اختبار والاسهم اختبار لكروموسوم 2 يمكن تجاوزه وقمع الأورام الغازية يعاير. ومن شأن قمع الغازية النمط الظاهري الورم تشير تورط الجينات في عملية الغازية. ومع ذلك، فإن قمع النمط الظاهري الغازية قد لا تكون توغل تماما وأنه لهذا السبب أنايقدم نظام تصنيف للأورام الغازية على أساس مدى هجرة الأورام على مدى VNC (الشكل 2). استخدام هذا المخطط تصنيف واحد يمكن بسهولة مقارنة الأورام الغازية للأورام الغازية حيث تم طرقت جين يشتبه في أن تشارك في غزو أسفل. تحليل العديد من المجمعات رأسي قد تعطي فهم أفضل للمدى الغازية قمع السلوك.

في حين أن البروتوكول المقدمة هنا يمكن استخدامها في تركيبة مع ضربة قاضية من واحد أو اثنين من الجينات لدراسة تأثير الجينات 'على تطور الورم، فإن knockdowns في وقت واحد أكثر من اثنين من الجينات يكون من الصعب من الناحية الفنية لتحقيقه. أخيرا، تم استخدام تعديل لهذه التقنية من وو وآخرون 39 إلى فهم آثار ازدواجية الجين الورمي تنشيط معربا عن الخلايا ضد الخلايا التي كانت متحولة عن الجينات قطبية الخلية. تقنية وو وآخرون، وكان هذا التعديل على مستوى الكواشف الجينية حowever تشريح التجربة الاستفادة من المجمعات رأسي لرؤية الأورام. وبالتالي طريقة لتشريح المجمعات رأسي المقدمة هنا يمكن أن تكون مفيدة للعلماء يحاولون الاستفادة من تقنية تعديل قدمه وو وآخرون كذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدي أي شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

ويدعم البحوث في مختبري قبل وزارة WKU الأموال بدء التشغيل الأحياء، بحوث WKU مؤسسة RCAP-I منح # 11-8032 وبمنحة KBRIN-AREA تمويلها من خلال منحة الوالد من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية الصحة تحت رقم الجائزة 5P20GM103436-13. وأود أيضا أن أنوه الدكتور تيان شو في التي تعرفت على هذه التقنية، والدكتور ريموند Pagliarini الذين أنشئت لأول مرة هذه التقنية في المختبر شو المختبر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution Invitrogen, Sigma Aldrich Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap Carolina Biologicals Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket Several Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube Various
Glass slides, cover glass Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil Polysciences Inc. or Halocarbon.com Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish Can be found at any general merchandise store Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope Leica and others Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish Sigma Aldrich
Paint Brush Can be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
  2. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  3. Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
  4. Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980 (2012).
  5. Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
  6. Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
  7. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  8. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  9. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
  12. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
  13. Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
  14. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  15. Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
  16. Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
  17. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
  18. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
  19. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  20. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
  21. Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
  22. Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
  23. Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
  24. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99, (Pt 4), 769-775 (1991).
  25. Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
  26. Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
  27. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  28. McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
  29. Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
  30. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
  31. Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
  32. Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
  33. Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
  34. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  35. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
  36. Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
  37. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
  38. Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
  39. Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics