के मस्तक परिसरों में जेनेटिक प्रेरण और सौम्य और आक्रामक ट्यूमर के दृश्य के लिए एक प्रोटोकॉल

Medicine

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Summary

रास V12 और कुछ लिखा, ट्यूमर कोशिकाओं को भी आक्रामक व्यवहार प्रदर्शित जहां ड्रोसोफिला में ट्यूमर के विकास में परिणाम की तरह सेल polarity जीन में उत्परिवर्तन की तरह एक सक्रिय ओंकोजीन के बीच सहयोग. यहाँ सौम्य और आक्रामक ट्यूमर के शामिल होने और अवलोकन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है.

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Srivastava, A. A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (79), e50624, doi:10.3791/50624 (2013).

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Abstract

ड्रोसोफिला यह जटिल रोगों 1-7 की हमारी समझ के लिए बेहद योगदान करने के लिए जारी है पिछले कई दशकों और आज के लिए सामान्य विकास और रोग के आनुवंशिक आधार के बारे में हमारी समझ के प्रबुद्ध गया है. एक metastatic राज्य के लिए एक सौम्य से ट्यूमर को बढ़ने से एक जटिल घटना 8 और हमें बेहतर इस रोग 9 के आनुवंशिक आधार को समझने में मदद करने के लिए ड्रोसोफिला में मॉडलिंग कर दिया गया है. यहाँ मैं आनुवंशिक रूप से प्रेरित निरीक्षण और फिर ड्रोसोफिला लार्वा में ट्यूमर की प्रगति का विश्लेषण करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल उपस्थित थे. ट्यूमर प्रेरण तकनीक MARCM प्रणाली 10 पर आधारित है और एक सक्रिय ओंकोजीन, रास V12 और सेल polarity जीन की हानि (कुछ लिखा, डिस्क बड़े और घातक विशाल लार्वा) आक्रामक ट्यूमर 9 उत्पन्न करने के बीच सहयोग का लाभ उठाते है. मैं इन ट्यूमर बरकरार लार्वा में कल्पना की जा सकती प्रदर्शन कैसे औरतो कैसे इन आगे के विश्लेषण के लिए बाहर विच्छेदित किया जा सकता है. यहाँ प्रस्तुत सरलीकृत प्रोटोकॉल यह संभव है कि इस तकनीक ट्यूमर आक्रमण में एक जीन की भूमिका को समझने में दिलचस्पी जांचकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जा करने के लिए करना चाहिए.

Introduction

एक metastatic राज्य के लिए एक सौम्य से ट्यूमर को बढ़ने से शरीर 8 में मौजूद सुरक्षा तंत्र की चोरी की विशेषता है कि एक कदम बुद्धिमान प्रक्रिया है. उदाहरण के लिए शरीर में ट्यूमर कोशिकाओं, apoptosis और प्रतिरक्षा प्रणाली से बचने के तहखाने झिल्ली बुलाया विशेष बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सफलता और आसपास की कोशिकाओं 8 द्वारा लगाए गए किसी भी सामाजिक नियंत्रण पर काबू पाने के लिए सक्षम होना चाहिए. यह कैंसर कोशिकाओं मेटास्टेसिस नामक प्रक्रिया में दूर के स्थानों की ओर पलायन और उपनिवेश स्थापित करने की क्षमता हासिल है कि एक कदम वार प्रगति के माध्यम से है. ट्यूमर सेल शरीर द्वारा लगाया बाधाओं पर काबू की हमारी समझ हालांकि, अनुसंधान से उभरती तस्वीर कैंसर की कोशिकाओं को 11-13 से सामान्य विकास की प्रक्रिया और संकेत रास्ते में से एक दोहराया का उपयोग करने के लिए इस प्रकार अब तक अंक किया, अपनी प्रारंभिक अवस्था में है.

फल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर हमारी समझ के लिए काफी योगदान दिया है मक्खीपिछले कई दशकों से 14-17 से अधिक विकसित परिष्कृत आनुवंशिक तकनीक के उपयोग के माध्यम से सामान्य विकास और रोग की erstanding. हम विभिन्न ओंकोजीन और ट्यूमर शमन जीनों 18-22 की एक बेहतर समझ में आ चुके हैं mutagenesis और overexpression उपकरणों का उपयोग करना. हालांकि, ट्यूमर मेटास्टेसिस सेल संस्कृति मॉडल 23,24 के साथ ही विभिन्न xenograft मॉडल 25-27 में मुख्य रूप से अध्ययन किया गया है कि कई आनुवंशिक घावों के बीच सहयोग का एक परिणाम है. वे पूरी तरह से एक जीवित जीव में पाया शर्तों की नकल नहीं है के रूप में इन मॉडलों को शक्तिशाली हालांकि अपनी सीमाएं हैं. इसके अलावा, चूहों में उपलब्ध ट्रांसजेनिक मॉडल बोझिल और आक्रामक व्यवहार 28,29 के आनुवांशिक विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं हैं. कई अध्ययनों से ड्रोसोफिला 30,31 में ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण को समझने का प्रयास किया है. इन तकनीकों में मुख्य रूप से मेजबान टीम के लिए प्राथमिक ट्यूमर के प्रत्यारोपण का उपयोग और फिर टीआरए ट्रैकिंग पर भरोसापड़ोसी ऊतकों 32,33 के आक्रमण के लिए ट्यूमर nsplanted. MARCM 10 नामक एक शक्तिशाली तकनीक ड्रोसोफिला 9 में ट्यूमर आक्रमण मॉडल पर PAGLIARINI और जू द्वारा रूपांतरित किया गया. ट्यूमर आक्रमण की यह खूबसूरत आनुवंशिक मॉडलिंग एक सक्रिय ओंकोजीन और सेल polarity के नुकसान के बीच सहयोग का फायदा उठाया. इस मॉडलिंग की सत्ता में आक्रामक ट्यूमर इस प्रकार के ऊतकों के प्रत्यारोपण के लिए जरूरत circumventing एक अक्षुण्ण जीव में बनाया जाता है कि तथ्य में निहित है. Oncogenic सहयोग के बारे में लाने के लिए, रास V12 तरह एक सक्रिय ओंकोजीन लार्वा आंख स्पर्शतंतु डिस्क में कोशिकाओं के क्लोन में व्यक्त किया है. MARCM तकनीक का एक परिणाम के रूप में इन क्लोन भी आसान दृश्य के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ चिह्नित कर रहे हैं और घातक विशाल लार्वा, कुछ लिखा है, और बड़े डिस्क की तरह सेल polarity म्यूटेंट के लिए homozygous बना रहे हैं. परिणाम GFP में आक्रामक ट्यूमर में चिह्नित है मस्तक जटिल. इस रिपोर्ट में मैंप्रेरित करने के लिए प्रदर्शन, और एक अक्षुण्ण लार्वा के संदर्भ में और बाहर विच्छेदित मस्तक परिसर में इन दोनों आक्रामक ट्यूमर कल्पना. यहाँ प्रस्तुत ट्यूमर प्रेरण ड्रोसोफिला के दूसरे गुणसूत्र पर अभिकर्मकों का इस्तेमाल करता. तालिका 2 में, मैं एक ही उद्देश्य के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक्स और 3 गुणसूत्रों पर शेयरों की एक सूची प्रदान करते हैं. मैं इस सरल प्रोटोकॉल ट्यूमर प्रगति की आणविक आधार को समझने में दिलचस्पी शोधकर्ताओं के लिए इस तकनीक को आसानी से सुलभ बनाना होगा कि विश्वास करते हैं.

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Protocol

1. सौम्य गैर आक्रामक ट्यूमर की प्रेरण

  1. सौम्य ट्यूमर के शामिल होने के लिए 2 तालिका में सूचीबद्ध शेयरों का प्रयोग करें.
  2. निम्नलिखित जीनोटाइप के "परीक्षक" शेयर के लिए एक स्टार्टर संस्कृति तैयार:; टब Gal80, FRT40A, वाई, ey-FLP1, डब्ल्यू Act5C> y +> Gal4, यूएएस GFP
  3. निम्नलिखित जीनोटाइप के "परीक्षण" शेयर के लिए एक स्टार्टर संस्कृति तैयार: डब्ल्यू, FRT40A, यूएएस रास V12 / CYO
  4. "परीक्षण" स्टॉक से "परीक्षक" स्टॉक से दस महिला कुंवारी और दस पुरुषों लीजिए.
  5. मक्खी भोजन के साथ एक शीशी में दोनों उन्हें रखने के द्वारा "परीक्षक" और "परीक्षण" स्टॉक से पुरुषों और महिलाओं को पार.
  6. एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पार प्लेस और पुरुषों और महिलाओं के दोस्त और 24-48 घंटे के लिए अंडे देना करने की अनुमति.
  7. पर्याप्त अंडे बयान के लिए और पहले instar लार्वा संस्कृति बाहर सुखाने नहीं है यह सुनिश्चित करने की उपस्थिति के लिए शीशियों की जाँच करें.
    1. Autoclaved की कुछ बूँदें जोड़ें(संस्कृति बाहर सूख रहा है तो) यह नम रखने के लिए संस्कृति को पानी आसुत.
    2. संस्कृति पर नजर रखने और जरूरत के रूप में कदम 1.7.1 दोहराने के लिए जारी.
  8. धारा 3 में उल्लिखित के रूप में एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत तीसरे instar लार्वा भटक निरीक्षण करें.

2. आक्रामक ट्यूमर की प्रेरण

  1. आक्रामक ट्यूमर के शामिल होने के लिए 2 तालिका में सूचीबद्ध शेयरों का प्रयोग करें.
  2. निम्नलिखित जीनोटाइप के ऊपर चरण में 1.2 से स्टार्टर संस्कृति का प्रयोग करें:, वाई ey-FLP1, डब्ल्यू, टब Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, यूएएस GFP
  3. LGL 4, FRT40A, यूएएस रास V12 / CYO, डब्ल्यू: निम्नलिखित जीनोटाइप के "परीक्षण" शेयर के लिए एक स्टार्टर संस्कृति की तैयारी
  4. "परीक्षण" स्टॉक से "परीक्षक" स्टॉक से दस महिला कुंवारी और दस पुरुषों लीजिए.
  5. मक्खी च के साथ एक शीशी में दोनों उन्हें रखने के द्वारा "परीक्षक" और "परीक्षण" स्टॉक से पुरुषों और महिलाओं के पारई..
  6. एक 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में पार प्लेस और पुरुषों और महिलाओं के दोस्त और 24-48 घंटे के लिए अंडे देना करने की अनुमति.
  7. पर्याप्त अंडे बयान के लिए और पहले instar लार्वा संस्कृति बाहर सुखाने नहीं है यह सुनिश्चित करने की उपस्थिति के लिए शीशियों की जाँच करें.
    1. (संस्कृति बाहर सूख रहा है तो) यह नम रखने के लिए संस्कृति को autoclaved आसुत जल की कुछ बूँदें जोड़ें.
    2. जरूरत के रूप में सूखापन और दोहराने कदम 2.7.1 के लिए संस्कृति की निगरानी जारी है.
  8. धारा 3 में उल्लिखित के रूप में एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत तीसरे instar लार्वा को ध्यान से देखें.

3. सौम्य और आक्रामक ट्यूमर का अवलोकन

  1. सौम्य ट्यूमर अलगाव और दृश्य के लिए तीसरे instar लार्वा का प्रयोग करें.
    1. आसुत जल में एक पेंट ब्रश गीला, और इस पेंट ब्रश का उपयोग संस्कृति शीशी की दीवार से कुछ तीसरे instar लार्वा परिमार्जन.
    2. 1X पीबीएस के साथ एक अवसाद स्लाइड में लार्वा प्लेस और फिर एक गीला पेंट ब्रश स्क्रैप का उपयोगलार्वा एपिडर्मिस से किसी भी खाद्य सामग्री से दूर ई.
    3. एक पेट्री थाली में लार्वा प्लेस और लार्वा को स्थिर करने के लिए 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में छोड़ दें.
      1. FLYNAP का उपयोग लार्वा को स्थिर करने के लिए वैकल्पिक विधि.
      2. 3.1.3.2 से शीशी FLYNAP में डूबा एक FLYNAP छड़ी प्लेस और लार्वा के साथ शीशी चलो खामियों को दूर शीशी plugging के बाद 30 से 40 मिनट के लिए खड़े हो जाओ.
    4. , प्रकाश हेलोकार्बन तेल की एक बूंद को जोड़ने के एक कवर गिलास के साथ कवर और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) कल्पना करने की क्षमता के साथ एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत निरीक्षण, एक गिलास स्लाइड पर स्थिर लार्वा रखें.
    5. सौम्य ट्यूमर असर लार्वा मस्तक जटिल मौजूद है जहां पूर्वकाल क्षेत्र में हरी प्रतिदीप्ति जाएगा.
  2. आक्रामक ट्यूमर के अवलोकन के लिए ऊपर कदम # 2 में सेट संस्कृति से दिन (प्रेरण के बाद) 10 लार्वा का चयन करें. आक्रामक ट्यूमर असर लार्वा एक विस्तारित एल है क्योंकि दिन 10 लार्वा चयन कर रहे हैंआम तौर पर ARVAL मंच और pupariate असफल.
  3. बजाय तीसरे instar लार्वा उपयोग दिन 10 लार्वा के सिवाय 3.1.4 के लिए कदम 3.1.1 का पालन करें.
    1. सुबह 10 इनवेसिव ट्यूमर असर लार्वा मस्तक जटिल मौजूद है जहां पूर्वकाल क्षेत्र में हरी प्रतिदीप्ति जाएगा.
  4. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप एक डिजिटल कैमरे से लैस है तो fluorescing सौम्य और आक्रामक ट्यूमर असर लार्वा की तस्वीरें ले.

4. सौम्य और आक्रामक ट्यूमर के मस्तक परिसर और इसके अलावा निरीक्षण के विच्छेदन

लार्वा की पारदर्शी एपिडर्मिस यह मुश्किल ट्यूमर के आक्रमण की हद तक निरीक्षण करने के लिए बनाता है. इस प्रकार आक्रमण की हद तक बेहतर लार्वा से बाहर मस्तक जटिल विदारक द्वारा कल्पना है. निम्न चरणों का मस्तक जटिल टुकड़े करना करने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए.

  1. एक गीला पेंट ब्रश का उपयोग च तीसरे instar (सौम्य ट्यूमर के लिए) लार्वा और दिन (आक्रामक ट्यूमर के लिए) 10 लार्वा का चयनसंबंधित संस्कृति शीशियों रोम.
  2. ठंड 1X पीबीएस युक्त विच्छेदन पकवान के एक कुएं में लार्वा रखें. लार्वा एपिडर्मिस से किसी भी खाद्य कणों परिमार्जन करने के लिए पेंट ब्रश का प्रयोग करें.
    1. ठंड 1X पीबीएस युक्त विच्छेदन पकवान की एक ताजा अच्छी तरह से साफ करने के लार्वा स्थानांतरण.
    2. प्रतिदीप्ति पता लगाने में सक्षम एक stereomicroscope का उपयोग GFP प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के लिए जाँच करें. गैर GFP असर लार्वा त्यागें.
  3. विच्छेदन पकवान पर एक ताजा अच्छी तरह से करने के लिए ठंड 1X पीबीएस के 1.0ml जोड़ें और संदंश की एक जोड़ी का उपयोग सौम्य या आक्रामक ट्यूमर (विच्छेदन प्रोटोकॉल ट्यूमर के इन दो प्रकार के लिए एक ही रहता है) या तो असर लार्वा हस्तांतरण.
  4. पूर्वकाल अंत से 2/3rds के बारे में संदंश की एक जोड़ी का उपयोग लार्वा नीचे रखें.
    1. संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग करें और चालाकी से लार्वा के पीछे 1/3rd अलग है और यह त्यागें.
    2. लार्वा के पूर्वकाल 2/3rds के चलते हैं. लार्वा के अंदर दबाव की सामग्री जारी की हैलार्वा शरीर गुहा के बाहर रिसना जाएगा.
    3. पेट, वसा शरीर और शरीर गुहा के बाहर oozed है कि लार्वा के अन्य भीतरी सामग्री को हटाने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें.
    4. लार्वा के मुंह हुक पकड़ और लार्वा एपिडर्मिस में धक्का संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें और पूरी तरह से लार्वा पलटना संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग.
    5. धीरे और सावधानी से वसा शरीर, लार ग्रंथियों, आंत, विंग डिस्क जटिल और किसी भी सांस की नली ट्यूब को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें. मस्तक जटिल अब उल्टे लार्वा का मुंह हुक से जुड़ी दिखाई जानी चाहिए. मस्तिष्क गोलार्द्धों और उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) अभी भी VNC से चलाई नसों के माध्यम से लार्वा बाह्य त्वचा से जुड़ा होगा.
    6. धीरे मस्तक नसों और लार्वा एपिडर्मिस के बीच कनेक्शन को तोड़ने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें.
    7. VNC और लार्वा एपिडर्मिस के बीच तंत्रिका कनेक्शन टूट गया है और अतिरिक्त चर्बी शरीर और अन्य ऊतक निकाल दिया है, मस्तक सहmplex स्पष्ट रूप से दृष्टिगोचर हो जाएगा और केवल मुंह हुक पर लार्वा बाह्य त्वचा से जुड़ी होगी.
    8. जटिल एंटीबॉडी धुंधला तरह बहाव के अनुप्रयोगों के लिए या बाद में दृश्य के लिए तय किए जाने की जरूरत है यदि मस्तक जटिल लार्वा बाह्य त्वचा से जुड़ी छोड़ा जा सकता है.
    9. आगे नहीं बहाव के अनुप्रयोगों तो प्रदर्शन किया जा सकता है तो मस्तक जटिल लार्वा बाह्य त्वचा से अलग और आगे अवलोकन और विश्लेषण के लिए बढ़ते मीडिया आधारित एक ग्लिसरॉल की एक बूंद में रखा जा सकता है. बढ़ते मीडिया के रूप में Vectashield का प्रयोग करें.

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Representative Results

प्रोटोकॉल का एक परिणाम यहाँ प्रस्तुत के रूप में उपयोगकर्ता लार्वा आंख स्पर्शतंतु imaginal डिस्क में एक सक्रिय ओंकोजीन overexpressing द्वारा सौम्य ट्यूमर को उत्पन्न करने में सक्षम हो जाएगा. उपयोगकर्ता भी भी एक सेल polarity जीन के लिए उत्परिवर्ती कोशिकाओं के क्लोन में एक सक्रिय ओंकोजीन overexpressing से आंख स्पर्शतंतु डिस्क में आक्रामक ट्यूमर को उत्पन्न करने में सक्षम हो जाएगा. ट्यूमर को आसानी से पूरे लार्वा में या लार्वा शरीर गुहा (चित्रा 1) के बाहर विच्छेदित किया गया है कि मस्तक परिसरों में "हरी फ्लोरोसेंट" ऊतक के रूप में एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope की मदद से देखे जा सकते थे. आक्रामक ट्यूमर ट्यूमर और VNC और अन्य सन्निहित अंगों को GFP सकारात्मक आक्रामक ट्यूमर के बाद प्रवास का भारी अतिवृद्धि का परिणाम देगा, जबकि सौम्य ट्यूमर GFP सकारात्मक कोशिकाओं के क्लोन के रूप में नजर स्पर्शतंतु डिस्क जटिल के लिए स्थानीयकृत किया जाएगा. > 10 दिन पुरानी लार्वा में GFP सकारात्मक और अलग माध्यमिक ट्यूमर (इनवेसिव ट्यूमर जीनोटाइप से प्राप्त) floaलार्वा शरीर गुहा में ting भी देखा जा सकता है. सौम्य ट्यूमर असर लार्वा समय पर pupariate इसके अलावा, जबकि आक्रामक ट्यूमर असर वाले एक विस्तारित लार्वा अवधि होती है और pupariate असफल. इन इनवेसिव ट्यूमर असर लार्वा आसानी से एक तरल पदार्थ भरा शरीर गुहा के साथ "विशाल लार्वा" के रूप में मनाया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. . क्रमशः सौम्य और आक्रामक ट्यूमर के साथ ग्रीन fluorescing लार्वा, एबी सही पैनल:.. लार्वा सौम्य ट्यूमर आंख स्पर्शतंतु के लिए स्थानीय कर रहे हैं ए) क्रमश सौम्य या आक्रामक ट्यूमर या तो असर से विच्छेदित मस्तक परिसरों ड्रोसोफिला में सौम्य और आक्रामक ट्यूमर एबी पैनल छोड़ दिया वे प्रेरित कर रहे हैं, जहां डिस्क. GFP लेबल ऊतक की तरह सन्निहित अंगों को माइग्रेट नहीं है नोटिसउदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC). मस्तक जटिल असर आक्रामक ट्यूमर एक दिन 10 लार्वा से) बी. बी करने के लिए इस की तुलना करें. ट्यूमर के ऊतक (हरा) के अतिवृद्धि और भी VNC और (एक लाल तीर द्वारा संकेत) ट्यूमर के ऊतक से मुंह हुक की तरह सन्निहित अंगों के आक्रमण सूचना है. आक्रामक ट्यूमर के ऊतक से सटे अंगों के आक्रमण एक तीर के साथ संकेत दिया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. VNC से अधिक प्रवास की हद पर आधारित आक्रामक ट्यूमर के लिए एक वर्गीकरण योजना. VNC के योजनाबद्ध हरे रंग भरने के साथ दर्शाया ट्यूमर प्रवास की हद के साथ दिखाया गया है. साथ जुड़े संख्यामाइग्रेशन की गंभीरता प्रत्येक योजनाबद्ध ऊपर दिए गए है.

क्रोमोजोम # परीक्षक तनाव जीनोटाइप परीक्षित तनाव जीनोटाइप संदर्भ
सौम्य ट्यूमर आक्रामक ट्यूमर
1 ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, यूएएस GFP; टब Gal80, FRT19A, डब्ल्यू डब्ल्यू, FRT19A, यूएएस रास V12 DLG M52, FRT19A/FM7C, यूएएस रास V12 PAGLIARINI और जू, 2003
2 वाई, ey-FLP1, डब्ल्यू, टब Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, यूएएस GFP डब्ल्यू, FRT40A, यूएएस रास V12 / CYO डब्ल्यू, LGL 4, FRT40A, यूएएस रास V12 / CYO PAGLIARINI और जू, 2003
3 वाई, ey-FLP1, डब्ल्यू, Act5C> y +> Gal4, यूएएस GFP;FRT82B, टब Gal80 डब्ल्यू, यूएएस रास V12; FRT82B डब्ल्यू, यूएएस रास V12; FRT82B, scrib 1 / TM6Tb PAGLIARINI और जू, 2003

तालिका 2. सौम्य और आक्रामक ट्यूमर को उत्पन्न करने के लिए आवश्यक शेयरों की जीनोटाइप. सभी शेयरों संकेत संदर्भ में वर्णित किया गया है. स्टॉक तियन जू की प्रयोगशाला से अनुरोध किया जाना चाहिए.

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Discussion

कैंसर अतीत की तुलना में एक बेहतर समझ के साथ आज एक जटिल बीमारी है. हालांकि, अभी भी बहुत कुछ सीखा है और हम अंतर्निहित तंत्र की एक पूरी तस्वीर है पहले समझाया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत सरल प्रोटोकॉल यह संभव आनुवंशिक रूप से एक पूरे जीव में सौम्य और आक्रामक ट्यूमर को उत्पन्न करने और फिर इस मॉडल में ट्यूमर की प्रगति से जुड़े जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए बनाता है. ड्रोसोफिला और अन्य जीवों में मौजूदा तकनीक के अधिकांश tumorigenesis और मेटास्टेसिस या 23-27 वयस्क मेजबानों में प्राथमिक ट्यूमर ऊतकों के प्रत्यारोपण के काम में एक प्रणाली को समझने के लिए एक सेल संस्कृति आधारित प्रणाली का उपयोग या तो. सेल आधारित और प्रत्यारोपण तकनीक अपनी सीमाएं हैं दोनों. उदाहरण के लिए, प्रत्यारोपण तकनीक बोझिल और समय लेने वाली है और मेजबान में गैर ट्यूमर ऊतकों के प्रत्यारोपण में परिणाम सकता है. इस प्रयोगात्मक कलाकृतियों का उत्पादन हो सकता है. इसके अलावा, सेल पंथure आधारित सिस्टम एक पूरे जीव में मौजूद है कि असली पर्यावरण के केवल approximations हैं. यह सीमा है कि यह कठिन ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस 34 में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि बहुत महत्वपूर्ण ट्यूमर और सूक्ष्म वातावरण बातचीत की नकल करने के लिए बनाता है. यहाँ प्रस्तुत तकनीक को सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला में ट्यूमर प्रगति की आनुवंशिक और आणविक आधार की जांच के लिए कई अनुसंधान समूहों द्वारा नियोजित किया गया है. उदाहरण के लिए, इस तकनीक का उपयोग यह JNK मार्ग दोनों आक्रामक ट्यूमर में upregulated है और यह भी ट्यूमर 35,36 की प्रगति के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शन किया गया. एक अन्य अध्ययन में ट्यूमर प्रगति में मैट्रिक्स metalloprotease की भूमिका इस आनुवंशिक मॉडल 12,37 में प्रदर्शन किया गया.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ जुड़े महत्वपूर्ण कदम सौम्य और आक्रामक ट्यूमर के शामिल होने के लिए इस्तेमाल शेयरों की सही जीनोटाइप के साथ शुरू करते हैं. देखभाल सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि इनशेयरों "टूट" नहीं कर रहे हैं. शेयरों समय समय पर पीले रंग की उपस्थिति के लिए जाँच की जा सकती (वाई -) एक शेयर टूटने का संकेत होगा जो मक्खियों. इस MARCM परीक्षक स्टॉक में FLP आउट कैसेट अनायास बाहर रूप से फ़्लिप किया है और इस तरह अनिवार्यता से Gal4 व्यक्त किया जाएगा कि संकेत होगा. इस ट्यूमर प्रेरित कर रहे हैं, इसके अलावा शीशियों में और 18 डिग्री सेल्सियस पर डुप्लिकेट शेयरों रखने से रोका जा सकता है, लार्वा सौम्य और आक्रामक ट्यूमर के लिए जाँच की जानी चाहिए जिस दिन भी महत्वपूर्ण है. सौम्य ट्यूमर असर लार्वा जंगली प्रकार लार्वा को बारीकी से इसी तरह की है कि एक विकासात्मक समय का पालन करते हैं, लार्वा असर आक्रामक ट्यूमर के साथ कहानी अलग है. आक्रामक ट्यूमर असर लार्वा प्रदर्शन लार्वा चरण बढ़ाया और कुछ pupariate असफल. दरअसल विफल रही pupariation बनाम pupariation की इस संपत्ति क्योंकि विस्तारित लार्वा की Menut एट अल. 38 से आक्रामक ट्यूमर दमन के एक उपाय के रूप में उपयोग किया गया हैमंच आक्रामक ट्यूमर असर लार्वा में यह सबसे अच्छा परिणाम के लिए दिन 8-10 डाक प्रेरण के आसपास आक्रामक ट्यूमर का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत आसानी से मानने योग्य है कि इतने दिन में 8-10 पर्याप्त ट्यूमर प्रवास VNC पर हुआ है. ट्यूमर मनाया जा सकता है, जबकि 10 दिन से परे है, यह पूरी तरह से यह मुश्किल विच्छेदित नमूनों में मस्तक जटिल उन्मुख करने के लिए कर रही वीएनसी अपनी चपेट में ले लेती है. पूरे लार्वा में ट्यूमर के दृश्य के साथ जुड़ा एक और महत्वपूर्ण कदम लार्वा को स्थिर करने की क्षमता है. FlyNap और कम तापमान दोनों में विस्तृत प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में लार्वा को स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विच्छेदित मस्तक परिसरों एक एंटीबॉडी के साथ दाग होने की जरूरत है, तो अंत में, तो dissections बर्फ पर बाहर किया जाना चाहिए और परिसरों तीस मिनट के भीतर तय की जानी चाहिए.

यहाँ प्रस्तुत तकनीक ट्यूमर प्रगति में एक भूमिका निभाने के लिए संदिग्ध जीन का योगदान समझने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जा सकता है.इस आनुवंशिक मॉडल का उपयोग एक जीन के ऊपर विनियमन एंटीबॉडी धुंधला तकनीक से या RT-पीसीआर के माध्यम से उपयोग में सीटू का अध्ययन किया जा सकता है. एक भी एक जीन प्रश्न या आरएनएआई अभिकर्मकों में जीन के लिए म्यूटेंट के साथ संयोजन में इस मॉडल का उपयोग करके ट्यूमर प्रगति के लिए आवश्यक है कि क्या समझने का प्रयास कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, ट्यूमर दमन के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए एक जीन के लिए एक आरएनएआई अभिकर्मक 3 गुणसूत्र पर मौजूद हो सकता है. इस मामले में 2 गुणसूत्र के लिए परीक्षक और परीक्षण शेयर संयोजन केवल आरएनएआई 3 गुणसूत्र परीक्षण किया शेयर में पार किया गया है असर के बाद (तालिका 2) का उपयोग किया जा सकता है. यह तो हासिल हो जाने के बाद 2 गुणसूत्र के लिए परीक्षक और परीक्षण स्टॉक पार किया जा सकता है और आक्रामक ट्यूमर के दमन assayed. आक्रामक ट्यूमर phenotype की एक दमन इनवेसिव प्रक्रिया में एक जीन की भागीदारी का सुझाव है. हालांकि, आक्रामक phenotype के दमन पूरी तरह व्याप्ति नहीं हो सकता है और यह इस कारण है कि मैंVNC से अधिक ट्यूमर के प्रवास की हद (चित्रा 2) के आधार पर आक्रामक ट्यूमर के लिए एक वर्गीकरण योजना प्रस्तुत करते हैं. एक बड़ी आसानी से आक्रमण में शामिल होने का संदेह एक जीन नीचे गिरा दिया गया है, जहां आक्रामक ट्यूमर के लिए आक्रामक ट्यूमर तुलना कर सकते हैं इस वर्गीकरण योजना का उपयोग. कई मस्तक परिसरों का विश्लेषण आक्रामक व्यवहार दमन की हद में एक बेहतर जानकारी दे सकता है.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ट्यूमर प्रगति पर 'जीन प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक या दो जीनों के पछाड़ना साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है, अधिक से अधिक दो जीनों के एक साथ knockdowns प्राप्त करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन होगा. अंत में, इस तकनीक का एक संशोधन सेल polarity जीनों के लिए उत्परिवर्ती थे कि कोशिकाओं के खिलाफ कोशिकाओं को व्यक्त सक्रिय ओंकोजीन juxtaposing के प्रभाव को समझने के लिए वू एट अल. 39 द्वारा उपयोग किया गया था. वू ने तकनीक एट अल. आनुवंशिक अभिकर्मकों घंटे के स्तर पर एक संशोधन किया गया थाट्यूमर के दृश्य के लिए मस्तक परिसरों के प्रयोग का उपयोग किया विच्छेदन owever. इस प्रकार यहां प्रस्तुत मस्तक परिसरों काटना विधि वू एट अल द्वारा प्रस्तुत संशोधित तकनीक का उपयोग करने की कोशिश कर वैज्ञानिकों के लिए उपयोगी हो सकता है. के रूप में अच्छी तरह से.

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Disclosures

मैं खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

मेरी प्रयोगशाला में अनुसंधान जीवविज्ञान स्टार्टअप धन की wku विभाग, wku रिसर्च फाउंडेशन RCAP मैं # 11-8032 अनुदान और के द्वारा समर्थित है राष्ट्रीय संस्थानों की जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान से एक माता पिता के अनुदान के माध्यम से वित्त पोषित एक KBRIN क्षेत्र अनुदान द्वारा स्वास्थ्य का पुरस्कार संख्या 5P20GM103436-13 के तहत. मैं भी प्रयोगशाला जिसका मैं पहले जू प्रयोगशाला में इस तकनीक की स्थापना की है जो इस तकनीक और डा. रेमंड PAGLIARINI के लिए पेश किया गया था डॉ. तियन जू में स्वीकार करना चाहते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution Invitrogen, Sigma Aldrich Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap Carolina Biologicals Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket Several Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube Various
Glass slides, cover glass Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil Polysciences Inc. or Halocarbon.com Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish Can be found at any general merchandise store Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope Leica and others Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish Sigma Aldrich
Paint Brush Can be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

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References

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