Um protocolo para indução genética e Visualização de tumores benignos e invasoras em Cephalic Complexos de

Medicine

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Summary

Cooperação entre um oncogene ativado como RAS V12 e mutações em genes de polaridade celular como íntima, resultar em crescimento do tumor em Drosophila, onde as células tumorais também exibem comportamentos invasivos. Aqui, um protocolo simples para a indução e observação dos tumores benignos e invasoras é apresentado.

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Srivastava, A. A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (79), e50624, doi:10.3791/50624 (2013).

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Abstract

Drosophila tem iluminado o nosso entendimento da base genética do desenvolvimento normal e da doença para as últimas décadas e hoje continua a contribuir imensamente para a nossa compreensão de doenças complexas 1-7. Progressão de tumores benignos de um para um estado metastático é um evento complexo 8 e foi modelado em Drosophila para nos ajudar a entender melhor a base genética da doença 9. Aqui eu apresento um protocolo simples para induzir geneticamente, observar e, em seguida, analisar a progressão de tumores em larvas de Drosophila. A técnica de indução de tumores baseia-se no sistema MARCM 10 e explora a cooperação entre um oncogene activado, Ras V12 e perda dos genes de polaridade celular (íntima, discos larvas grandes e letal gigante) para gerar tumores invasivos 9. I demonstram como esses tumores podem ser visualizados no larvas intacta eentão como estes podem ser dissecados para análise posterior. O protocolo simplificado aqui apresentados devem tornar possível que esta técnica para ser utilizado pelos investigadores interessados ​​na compreensão da função de um gene na invasão tumoral.

Introduction

Progressão de tumores benignos de um para um estado metastático é um processo de passo sábio que é caracterizada por a evasão de mecanismos de protecção presentes no corpo 8. Por exemplo células tumorais no corpo deve ser capaz de evitar a apoptose e do sistema imunológico, avanço da matriz extracelular especializada (ECM) chamado Membrana Basal, e superar todos os controles sociais impostas pelas células vizinhas 8. É através de uma progressão sábio passo que as células cancerosas adquirem a capacidade de migrar e colonizar locais distantes em um processo chamado metástase. A nossa compreensão de como a célula tumoral supera as barreiras impostas pelo órgão ainda está em sua infância, no entanto, a imagem que emerge da pesquisa feita pontos, até agora, a um uso repetido de processos normais de desenvolvimento e vias de sinalização pelas células cancerosas 11-13.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster tem contribuído enormemente para a nossa understanding do desenvolvimento normal e doença através do uso de técnicas genéticas sofisticadas desenvolvidas ao longo das últimas décadas 14-17. Usando mutagênese e ferramentas superexpressão Chegamos a uma melhor compreensão de vários oncogenes e genes supressores de tumor 18-22. No entanto, a metástase tumoral é um resultado de uma cooperação entre várias lesões genéticas que tem sido estudado principalmente em modelos de cultura de células 23,24, bem como vários modelos de xenotransplante de 25-27. Estes modelos porém poderoso têm suas limitações, pois não reproduzem inteiramente as condições encontradas em um organismo vivo. Além disso, os modelos transgênicos disponíveis em ratos são pesados ​​e não contribuem para a análise genética de comportamento invasivo 28,29. Vários estudos têm tentado compreender a invasão das células tumorais em Drosophila 30,31. Estas técnicas utilizam principalmente transplante de tumores primários para anfitriões e, em seguida, contar com acompanhamento do tratumores nsplanted por invasão de tecidos vizinhos 32,33. Uma poderosa técnica chamada MARCM 10 foi adaptada por Pagliarini e Xu modelar invasão tumoral em Drosophila 9. Esta modelação genética elegante de invasão tumoral explorada a cooperação entre um oncogene activado e a perda da polaridade celular. O poder deste modelagem situa-se no facto de que os tumores invasivos são criados num organismo intacto contornando assim a necessidade de transplante de tecidos. Para provocar a cooperação oncogénica, um oncogene activado como Ras V12 é expressa em clones de células no disco olho-antenais de larvas. Como um resultado da técnica MARCM estes clones também foram marcados com a proteína verde fluorescente (GFP) para facilitar a visualização e são feitas homozigotos para mutantes de polaridade celular como larvas letal gigante, íntima, e discos grandes. O resultado é GFP marcado tumores invasivos no complexo cefálica. Neste relatório eudemonstrar como para induzir, e visualizar estes tumores invasivos, tanto no âmbito de um larvas intacta e em dissecados complexo cefálica. A indução de tumores aqui apresentada utiliza os reagentes no segundo cromossoma de Drosophila. Na Tabela 2, que fornecem um perfil de existências em X e 3 rd cromossomas que podem ser utilizados para o mesmo fim. Acredito que este protocolo simplificado vai fazer esta técnica de fácil acesso para pesquisadores interessados ​​em compreender a base molecular da progressão do tumor.

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Protocol

1. Indução de tumores benignos não-invasivos

  1. Use ações listadas na Tabela 2 para a indução de tumores benignos.
  2. Prepare uma cultura de partida para o "testador" balanço da seguinte genótipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Prepare uma cultura inicial para o estoque "testado" do seguinte genótipo: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo
  4. Colete dez fêmeas virgens do estoque "tester" e dez homens do estoque "testado".
  5. Cruze os machos e fêmeas do "testador" e o estoque "testado", colocando-os tanto em um frasco com alimentos mosca.
  6. Coloque a cruz em uma incubadora de 25 ° C e permitir que os machos e as fêmeas para acasalar e pôr ovos por 24-48 horas.
  7. Confira os frascos para a deposição de ovos e suficiente para a presença de larvas de primeiro instar certificando-se de que a cultura não está secando.
    1. Adicione algumas gotas de autoclavadoágua destilada à cultura para mantê-lo húmido (se a cultura está a secar para fora).
    2. Continue a acompanhar a cultura e repita o passo 1.7.1, conforme necessário.
  8. Observe vagando larvas de terceiro estádio sob um microscópio estereoscópico fluorescência como descrito na secção 3.

2. Indução de tumores invasivos

  1. Use ações listadas na Tabela 2 para a indução de tumores invasivos.
  2. Use a cultura de partida a partir do passo 1.2 acima da seguinte genótipo: y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Prepare uma cultura inicial para o estoque "testado" do seguinte genótipo: w; LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo
  4. Colete dez fêmeas virgens do estoque "tester" e dez homens do estoque "testado".
  5. Cruze os machos e fêmeas do "testador" e o estoque "testado", colocando-os tanto em um frasco com a mosca food.
  6. Coloque a cruz em uma incubadora de 25 ° C e permitir que os machos e as fêmeas para acasalar e pôr ovos por 24-48 horas.
  7. Confira os frascos para a deposição de ovos e suficiente para a presença de larvas de primeiro instar certificando-se de que a cultura não está secando.
    1. Adicionar algumas gotas de água destilada esterilizada para a cultura para mantê-lo húmido (se a cultura está a secar para fora).
    2. Continue a monitorar a cultura para a secura e repita o passo 2.7.1, conforme necessário.
  8. Observe larvas de terceiro estádio sob um microscópio estereoscópico fluorescência como descrito na secção 3.

3. Observação de tumores benignos e invasoras

  1. Use larvas de terceiro instar para isolamento tumor benigno e visualização.
    1. Molhar um pincel em água destilada, e utilizando esta pincel raspar algumas larvas de terceiro instar a partir da parede do frasco de cultura.
    2. Coloque as larvas em um slide depressão com 1X PBS e em seguida, usando um pincel de pintura molhado sucataenviar um e fora de todo o material alimentar da epiderme larval.
    3. Coloque as larvas em uma placa de Petri e deixou-se a -20 ° C congelador durante 30 minutos para imobilizar as larvas.
      1. Método alternativo para imobilizar larvas usando FLYNAP.
      2. Coloque uma varinha FLYNAP mergulhado em FLYNAP para o frasco de 3.1.3.2 e depois ligar o let frasco frasco conectado com larvas representam de 30 a 40 min.
    4. Coloque a larva imobilizada em uma lâmina de vidro, adicione uma gota de óleo halocarbono luz, cubra com uma tampa de vidro e observar com um microscópio estereoscópico de fluorescência com a capacidade de visualizar Proteína Fluorescente Verde (GFP).
    5. As larvas rolamento tumor benigno irá fluorescência verde na região anterior onde o complexo cefálica está presente.
  2. Selecione dia 10 larvas (após indução) a partir da cultura definido na etapa 2 acima para a observação de tumores invasivos. Dia 10 larvas são selecionados porque larvas rolamento tumor invasivo ter um l estendidaArval fase e geralmente não conseguem pupariate.
  3. Siga os passos 3.1.1 a 3.1.4, exceto em vez de três dias uso larvas 10 larvas.
    1. As larvas dia 10 rolamento tumor invasivo fluorescência verde na região anterior onde o complexo cefálica está presente.
  4. Se o microscópio fluorescente é equipado com uma câmera digital, então tirar fotos das larvas rolamento tumor benigno e invasivo fluorescente.

4. Dissecção da Observação complexo e mais cefálica de tumores benignos e invasoras

A epiderme translúcidas da larva torna difícil de observar o grau de invasão de tumores. Assim, a extensão da invasão é melhor visualizado por dissecar o complexo cefálica fora da larva. Os passos seguintes devem ser utilizados para dissecar o complexo cefálica.

  1. Usando um pincel molhado selecionar larvas de terceiro estádio (para tumores benignos) e dia 10 larvas (para tumores invasivos) from dos respectivos frascos de cultura.
  2. Coloque as larvas em um poço de um prato dissecção contendo frio 1X PBS. Use pincel para raspar as partículas de alimentos da epiderme larval.
    1. Transferir larvas limpo para um novo bem do prato dissecção contendo frio 1X PBS.
    2. Verifique se há presença de GFP fluorescência utilizando um microscópio estereoscópico capaz de detectar a fluorescência. Descarte larvas rolamento não-GFP.
  3. Adicionar 1,0 mL de PBS 1X frio para um novo bem no prato de dissecação e usando um par de fórceps transferir uma larva de rolamento, quer os tumores benignos ou invasivos (o protocolo de dissecção é o mesmo para estes dois tipos de tumores).
  4. Segurar a larva para baixo usando um par de fórceps cerca 2/3RDS a partir da extremidade anterior.
    1. Use o outro par de fórceps e inteligentemente separar o 1/3rd posterior da larva e descartá-lo.
    2. Deixe de lado o 2/3RDS anterior da larva. À medida que a pressão dentro da larva é libertado o conteúdo dolarva vai escorrer para fora da cavidade do corpo.
    3. Utilizar um par de fórceps para remover o intestino, a gordura corporal e outros conteúdos interiores da larva que escorreu para fora da cavidade do corpo.
    4. Use uma pinça para segurar o gancho boca da larva e empurrá-lo para dentro da epiderme larval e usar o outro par de fórceps inverter a larva completamente.
    5. Use a pinça para suavemente e remova cuidadosamente o corpo de gordura, glândulas salivares, intestino, o complexo disco asa e quaisquer tubos traqueais. O complexo cefálica agora deve estar visível anexado ao gancho boca da larva invertido. Os hemisférios cerebrais e da medula nervosa ventral (VNC) seria ainda ser ligada à epiderme larvais através dos nervos que emanam do VNC.
    6. Utilizar um par de pinças para quebrar suavemente as conexões entre os nervos cefálicos e epiderme larvares.
    7. Como as ligações de nervos entre o VNC e epiderme larvas são quebrados e gordura corporal em excesso e outro tecido removido, o co cefálicamplex seria claramente visível e será anexado à epiderme larvas só nos ganchos na boca.
    8. O complexo cefálica pode ser deixado ligado à epiderme larval se o complexo precisa ser corrigido para aplicações a jusante como a coloração de anticorpos ou para posterior visualização.
    9. Se não há aplicações a jusante poderia ser realizada, em seguida, o complexo cefálica pode ser separado da epiderme larvais e colocados numa gota de glicerol a base meios de montagem para posterior observação e análise. Use Vectashield como a mídia de montagem.

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Representative Results

Como um resultado do protocolo apresentado aqui o utilizador irá ser capaz de induzir a superexpressão de tumores benignos por um oncogene activado no olho antenal disco imaginal larval. O utilizador também será capaz de induzir tumores invasivos no disco antenal olho por sobre-expressam um oncogene activado, em clones de células também para um mutante do gene da polaridade celular. Os tumores podem ser facilmente visualizadas com a ajuda de um estereomicroscópio fluorescente como o tecido "fluorescente verde" em todo o larvas ou em complexos cefálicos que foram dissecados para fora da cavidade do corpo de larvas (Figura 1). Os tumores benignos será localizada no complexo disco antenal olho como clones de células GFP positivas enquanto que os tumores invasivos irá resultar numa proliferação massiva de tumores e subsequente migração de tumores invasivos GFP positivas à VNC e outros órgãos adjacentes. Na> 10 dias de idade larvas (derivado do genótipo do tumor invasivo) GFP tumores secundários positivos e destacadas floating na cavidade do corpo larval também pode ser observada. Além disso, enquanto as larvas tendo os tumores benignos pupariate no tempo, os que carregam os tumores invasivos têm um período larval prolongado e não conseguem pupariate. Essas larvas rolamento tumor invasivo poderia ser facilmente observado como "larvas gigante" com um fluido corporal cavidade cheia.

Figura 1
Figura 1. . Tumores benignos e invasivo em Drosophila AB esquerda do painel: larva verde fluorescente com tumores benignos e invasivos, respectivamente AB painel direito:. Complexos cefálica dissecada larvas tendo tanto tumores benignos ou invasivos, respectivamente A) Os tumores benignos são localizados a olho-antena. disco, onde são induzidas. Observe que o tecido rotulado GFP não migrou para os órgãos adjacentes, comoo cordão nervoso ventral (VNC). Compare isso com B. B) tumores invasivos rolamento complexos Cephalic de um dia 10 de larva. Observe o crescimento excessivo de tecido tumoral (verde) e também a invasão de órgãos adjacentes, como o VNC e ganchos na boca por o tecido do tumor (indicado por uma seta vermelha). A invasão dos órgãos contíguos por tecido do tumor invasivo é indicado com uma seta. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Um esquema de classificação para tumores invasivos com base na extensão da migração sobre o VNC. O esquema do VNC é mostrado com a extensão da migração de tumor representado com a cor verde de enchimento. O número associado com aseveridade da migração é dado acima de cada esquema.

Cromossomo # Genótipo Tester tensão Genótipo estirpe testada Referência
Os tumores benignos Tumores invasivos
1 w, Tub-Gal80, FRT19A; ey-FLP5, Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP w, FRT19A; UAS-Ras V12 DLG M52, FRT19A/FM7C; UAS-Ras V12 Pagliarini e Xu, 2003
2 y, w, ey-FLP1; Tub-Gal80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP w; FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo w; LGL 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / cyo Pagliarini e Xu, 2003
3 y, w, ey-FLP1; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP;FRT82B, Tub-Gal80 w; UAS-Ras V12; FRT82B w; UAS-Ras V12; FRT82B, Scrib 1 / TM6Tb Pagliarini e Xu, 2003

Tabela 2. O genótipo de estoques necessários para induzir os tumores benignos e invasivos. Todos os stocks foram descritas na referência indicada. Ações devem ser solicitados ao laboratório de Tian Xu.

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Discussion

O cancro é uma doença complexa, com uma muito melhor compreensão hoje do que no passado. No entanto, ainda há muito a ser aprendido e explicou, antes de ter um quadro completo dos mecanismos subjacentes. O protocolo simples aqui apresentada torna possível induzir geneticamente tumores benignos e invasivos num organismo inteiro e depois estudar a biologia associada com a progressão de tumores neste modelo. A maioria das técnicas existentes em Drosophila e outros organismos ou utilizar um sistema de cultura de células de compreender tumorigénese e metástase ou um sistema que emprega o transplante de tecidos tumorais primários em hospedeiros adultos 23-27. Tanto a célula base e técnicas de transplante têm suas limitações. Por exemplo, a técnica do transplante é complicado e demorado e pode resultar na transplantação de tecidos não tumorais no hospedeiro. Isto poderia resultar na produção de artefactos experimentais. Além disso, culto celularsistemas baseados ure são apenas aproximações do ambiente real que existe num organismo inteiro. Esta limitação torna difícil de imitar o tumor muito importante e a interacção de micro-ambiente que desempenha um papel fundamental na progressão de tumores e metástases 34. A técnica aqui apresentada tenha sido aplicada com êxito por vários grupos de investigação para investigar a base genética e molecular de progressão tumoral em Drosophila. Por exemplo, utilizando esta técnica, foi demonstrado que a via JNK é regulada positivamente em ambos os tumores invasivos e é também necessária para a progressão de tumores 35,36. Em outro estudo, foi demonstrado o papel de metaloprotease de matriz na progressão do tumor neste modelo 12,37 genética.

Os passos críticos associados com o protocolo apresentado aqui começam com o genótipo correto de estoques utilizados para a indução de tumores benignos e invasivos. Cuidados devem ser tomados para garantir que estesações não são "quebrar". As ações podem ser verificados periodicamente para a presença de amarelo (y -) voa o que seria indicativo de um colapso estoque. Isto indicaria que a cassete FLP-Out no estoque testador MARCM tem virado espontaneamente e seria, portanto, expressando Gal4 constitutivamente. Isto pode ser evitado pela manutenção de existências em duplicado em frascos e a 18 ° C. Além disso, como os tumores são induzidos, o dia em que as larvas devem ser verificados para tumores benignos e invasivos também é crítico. Enquanto larvas rolamento tumor benigno seguir um cronograma de desenvolvimento que é muito parecido ao tipo selvagem larvas, a história com rolamento larvas tumores invasivos é diferente. O display larvas rolamento tumor invasivo estendido fase larval e alguns deixam de pupariate. Na verdade, esta propriedade de pupariation contra pupariation não tem sido utilizada como uma medida de supressão do tumor invasivo por Menut et al. 38 Devido à larval prolongadoestágio em larvas invasivo rolamento tumor é fundamental observar tumores invasivos em torno de 8-10 dias pós indução para obter melhores resultados. No dia 8-10 migração tumor suficiente aconteceu no VNC de modo que é facilmente observável sob um microscópio estéreo. Além do dia 10, enquanto que o tumor pode ser observado, que começa a envolver completamente o VNC tornando difícil orientar o complexo cefálica em espécimes dissecados. Outro passo crítico associado com a visualização de tumores em todo larvas é a capacidade para imobilizar as larvas. Ambos FlyNap e temperaturas reduzidas pode ser utilizado para imobilizar as larvas, conforme descrito no protocolo detalhado. Finalmente, se os complexos cefálicos dissecados precisam de ser marcadas com um anticorpo, em seguida, as dissecações deve ser levada a cabo em gelo e complexos deve ser fixada dentro de trinta minutos.

A técnica aqui apresentada pode ser utilizado por pesquisadores para compreender a contribuição dos genes que se suspeite ter um papel na progressão do tumor.Usando este modelo de regulação genética de um gene pode ser estudada in situ por meio de técnicas de coloração de anticorpo ou através da utilização de RT-PCR. Também se pode tentar compreender se um gene é necessário para a progressão do tumor, utilizando este modelo em combinação com mutantes para o gene em questão, ou reagentes de RNAi. Por exemplo, um reagente de ARNi para um gene a ser testado para a supressão do tumor pudesse estar presente no cromossoma 3 rd. Neste caso, o testador e combinação estoque testado para o cromossomo 2 poderia ser utilizado (Tabela 2) somente depois que o RNAi rolamento 3 º cromossomo foi cruzada para o estoque testado. Uma vez que isso foi conseguido então o testador e estoque testado para cromossomo 2 pode ser cruzado e supressão de tumores invasivos analisada. A supressão do fenótipo tumoral invasivo poderia sugerir o envolvimento de um gene no processo invasivo. No entanto, a supressão do fenótipo invasivo pode não ser completamente penetrantes e é por esta razão que Iapresentar um esquema de classificação para tumores invasivos com base na extensão da migração dos tumores ao longo do VNC (Figura 2). Utilizando este esquema de classificação pode-se facilmente comparar tumores invasivos para tumores invasivos, onde um gene suspeito de estar envolvido na invasão foi derrubado. Análise dos vários complexos cefálica pode dar uma melhor visão sobre a extensão da supressão comportamento invasivo.

Embora o protocolo aqui apresentado pode ser utilizado em combinação com o knockdown de um ou dois genes para estudar o efeito dos genes na progressão tumoral, knockdowns simultâneas de mais de dois genes seria tecnicamente difícil de conseguir. Finalmente, uma modificação desta técnica foi utilizada por Wu et al. 39 para compreender os efeitos da justaposição oncogene activado expressando as células contra células que eram mutantes de genes de polaridade celular. A técnica por Wu et al. Foi uma modificação no nível de reagentes genéticos however a experiência utilizou dissecção de complexos cefálica para a visualização de tumores. Assim, o método para dissecar complexos cefálicos aqui apresentados podem ser úteis para os cientistas que tentam utilizar a técnica modificada apresentada por Wu et al. Bem.

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Disclosures

Eu não tenho nada a divulgar.

Acknowledgments

A pesquisa em meu laboratório é apoiado pelo Departamento WKU de fundos de arranque Biologia, WKU Research Foundation RCAP-I conceder # 11-8032 e por uma concessão KBRIN-AREA financiado através de uma subvenção pai do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais da Saúde sob o número prêmio 5P20GM103436-13. Gostaria também de agradecer Dr. Tian Xu, em cujo laboratório fui apresentado a esta técnica e Dr. Raymond Pagliarini que primeiro estabeleceu esta técnica em laboratório Xu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution Invitrogen, Sigma Aldrich Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap Carolina Biologicals Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket Several Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube Various
Glass slides, cover glass Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil Polysciences Inc. or Halocarbon.com Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish Can be found at any general merchandise store Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope Leica and others Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish Sigma Aldrich
Paint Brush Can be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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