تحليل الأحماض الدهنية المحتوى والتركيب في الطحالب الدقيقة

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ووصف طريقة لتحديد محتوى الأحماض الدهنية وتكوين الطحالب في القائمة على تعطيل الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، الجزيئيات التبادلي، والقياس الكمي وتحديد الأحماض الدهنية باستخدام كروماتوغرافيا الغاز. ويستخدم معيار الداخلية tripentadecanoin للتعويض عن الخسائر المحتملة خلال استخراج والجزيئيات التبادلي غير مكتملة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Breuer, G., Evers, W. A., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ووصف طريقة لتحديد محتوى وتكوين مجموع الأحماض الدهنية الموجودة في الطحالب. الأحماض الدهنية هي أحد المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة. ويمكن لهذه الأحماض الدهنية تكون موجودة في الطبقات أسيل الدهون المختلفة. وخاصة الأحماض الموجودة في الدهون الثلاثية (TAG) الدهنية هي من مصلحة تجارية، لأنها يمكن أن تستخدم لإنتاج أنواع وقود النقل، والمواد الكيميائية السائبة، والمغذيات (ω-3 الأحماض الدهنية)، والسلع الغذائية. لتطوير التطبيقات التجارية، وهناك حاجة إلى أساليب تحليلية موثوق بها لتقدير حجم المحتوى الأحماض الدهنية وتكوينها. الطحالب هي خلايا مفردة محاطة جدار الخلية جامدة. وينبغي أن يكون أسلوب التحليل الأحماض الدهنية تقديم تمزيق الخلايا كافية لتحرير كل الدهون أسيل وإجراءات استخراج المستخدمة يجب أن تكون قادرة على استخراج جميع الطبقات أسيل الدهون.

مع أسلوب المقدمة هنا جميع الأحماض الدهنية الموجودة في الطحالب يمكن أن يكون بدقة وبتكاثر الاتساعتعرفها وكميا باستخدام كميات صغيرة من عينة (5 ملغ) مستقلة عن طول تلك السلسلة، ودرجة التشبع، أو الطبقة الدهنية التي هي جزء من.

هذا الأسلوب لا يوفر المعلومات حول الوفرة النسبية للفئات الدهون مختلفة، ولكن يمكن أن تمتد إلى الطبقات فصل الدهون عن بعضها البعض.

ويستند أسلوب على سلسلة من اضطراب الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، أسترة الأحماض الدهنية إلى استرات الأحماض الدهنية الميثيل (جوع)، وتقدير وتحديد جوع باستخدام كروماتوغرافيا الغاز (GC-FID). يتم إضافة معيار الداخلية TAG (tripentadecanoin) قبل الإجراء التحليلي لتصحيح خسائر خلال استخراج والجزيئيات التبادلي غير مكتملة.

Introduction

الأحماض الدهنية هي واحدة من المكونات الرئيسية للكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة وجعل عادة ما بين 5-50٪ من الوزن الجاف الخلية 1-3. كانت موجودة أساسا في شكل glycerolipids. هذه glycerolipids بدورها تتكون أساسا من الدهون الفوسفاتية، السكرية، والدهون الثلاثية (TAG). وخاصة الأحماض الدهنية الموجودة في TAG هي من مصلحة تجارية، لأنها يمكن أن تستخدم كمورد لإنتاج وقود النقل، والمواد الكيميائية السائبة، والمغذيات (ω-3 الأحماض الدهنية)، والسلع الغذائية 3-6. الطحالب يمكن أن تنمو في المياه القائمة وسائل الاعلام زراعة البحر، يمكن أن يكون لها الإنتاجية المساحية أعلى بكثير من النباتات البرية، ويمكن زراعتها في photobioreactors في مواقع غير مناسبة لأغراض الزراعة، وربما حتى في الخارج. لهذه الأسباب، وغالبا ما تعتبر الطحالب بديلا واعدا للنباتات الأرضية لإنتاج وقود الديزل الحيوي وغيرها من المنتجات السائبة 3-6. لا يحتمل لتر الزراعيةوأو المياه العذبة (عندما تزرع في photobioreactors مغلقة أو عندما يتم استخدام الطحالب البحرية) وهناك حاجة لإنتاجها. وبالتالي، تعتبر الوقود الحيوي المشتق من الطحالب الدقيقة 3 الوقود الحيوي من الجيل الثالث.

مجموع المحتويات الخلوية من الأحماض الدهنية (٪ من الوزن الجاف)، وتكوين الطبقة الدهنية، وكذلك طول الأحماض الدهنية ودرجة التشبع تختلف اختلافا كبيرا بين الأنواع الطحالب. علاوة على ذلك، هذه الخصائص تختلف مع ظروف زراعة مثل توافر المواد الغذائية، ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، وشدة الضوء 1،2. على سبيل المثال، عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين، يمكن أن الطحالب تتراكم كميات كبيرة من TAG. في ظل ظروف النمو المثلى TAG يشكل عادة أقل من 2٪ من الوزن الجاف، ولكن عندما تتعرض لمجاعة النيتروجين المحتويات TAG يمكن أن تزيد لتصل إلى 40٪ من الوزن الجاف الطحالب الدقيقة 1.

الطحالب أساسا إنتاج الأحماض الدهنية مع أطوال سلسلة من 16 و 18يمكن ذرات الكربون، ولكن بعض الأنواع تجعل الأحماض الدهنية لمدة تصل إلى 24 ذرات الكربون في الطول. كلا المشبعة، وكذلك يتم إنتاج الأحماض الدهنية غير المشبعة كبير من قبل الطحالب. وتشمل هذه الأخيرة الأحماض الدهنية مع الفوائد الغذائية (ω-3 الأحماض الدهنية) مثل C20: 5 (حمض الدهني؛ EPA) وC22: 6 (حمض الدوكوساهيكسانويك؛ DHA) التي لا وجود لها بدائل نباتية 1،2،4،7. و(توزيع) الدهنية حمض طول السلسلة ودرجة التشبع يحدد أيضا خصائص ونوعية الوقود الحيوي المشتق من الطحالب والزيوت الصالحة للأكل 4،8.

لتطوير التطبيقات التجارية من الطحالب الدقيقة المستمدة الأحماض الدهنية، وهناك حاجة إلى أساليب تحليلية موثوق بها لتقدير حجم المحتوى الأحماض الدهنية وتكوينها.

كما أشار أيضا بها Ryckebosch وآخرون. تحليل الأحماض الدهنية في الطحالب يميز نفسه عن ركائز أخرى (مثل الزيوت النباتية والمنتجات الغذائية والأنسجة الحيوانية الخ) يكونتسبب 1) هي خلايا الطحالب وحيدة الخلية محاطة بجدران صلبة، تعقيد استخراج الدهون؛ 2) الطحالب تحتوي على مجموعة متنوعة واسعة من الطبقات الشحمية وتوزيع الطبقة الدهنية متغير بدرجة كبيرة 7. هذه الفئات المختلفة الدهون دينا تشكيلة واسعة من حيث التركيب الكيميائي والخصائص مثل قطبية. أيضا، والطبقات الدهون الأخرى من الدهون أسيل يتم إنتاجها؛ 3) الطحالب تحتوي على مجموعة متنوعة واسعة من الأحماض الدهنية، والتي تتراوح 12-24 ذرات الكربون في طول وتحتوي على كل المشبعة وكذلك الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية. لذلك، وضعت وسائل لتحليل الأحماض الدهنية في ركائز أخرى من الطحالب الدقيقة، قد لا تكون مناسبة لتحليل الأحماض الدهنية في الطحالب.

كما استعرضتها Ryckebosch وآخرون. والفرق الرئيسي بين إجراءات استخراج الدهون شيوعا هو في أنظمة المذيبات التي يتم استخدامها. بسبب مجموعة كبيرة ومتنوعة من الطبقات الدهنية الموجودة في الطحالب، تختلف كل منها في قطبية، واستخراجوكمية الدهون تختلف مع المذيبات المستخدمة 10-12. وهذا يؤدي إلى عدم الاتساق في محتوى الدهون وتكوينها المعروضة في الأدب 9،10. اعتمادا على نظام المذيبات المستخدمة والأساليب القائمة على استخراج المذيبات دون انقطاع الخلية من خلال، على سبيل المثال، ضرب حبة أو صوتنة، قد لا استخراج كل الدهون بسبب بنية جامدة بعض الأنواع الطحالب 9،13. في حالة استخراج الدهون غير مكتملة، لا يمكن للكفاءة الاستخراج من الطبقات الشحمية مختلفة تختلف 14. وهذا يمكن أيضا أن يكون له تأثير على قياس تكوين الأحماض الدهنية، وذلك لأن تكوين الأحماض الدهنية غير متغير بين الطبقات الدهنية 7.

ويستند أسلوب لدينا على سلسلة من اضطراب الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، أسترة الأحماض الدهنية إلى استرات الأحماض الدهنية الميثيل (جوع)، وتقدير وتحديد جوع باستخدام كروماتوغرافيا الغاز في توليفة مع ioniza اللهبكشف نشوئها (GC-FID). يتم إضافة معيار الداخلية في شكل الدهون الثلاثية (tripentadecanoin) قبل إجراء التحليل. الخسائر المحتملة خلال استخراج والجزيئيات التبادلي غير مكتملة ومن ثم يمكن تصحيح ل. طريقة يمكن استخدامها لتحديد محتوى فضلا عن تكوين الأحماض الموجودة في الكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة الدهنية. جميع الأحماض الموجودة في الطبقات الدهنية أسيل مختلفة، بما في ذلك التخزين (TAG)، وكذلك نسبة الدهون في غشاء (السكرية، الدهون الفوسفاتية)، يتم الكشف عن، حدد وكميا بدقة وبتكاثر بواسطة هذه الطريقة باستخدام كميات صغيرة فقط من عينة (5 ملغ) الدهنية . هذا الأسلوب لا يوفر المعلومات حول الوفرة النسبية للفئات الدهون المختلفة. ومع ذلك، ويمكن تمديد طريقة لفصل الطبقات الدهنية من بعضها البعض 1. تركيز وتكوين الأحماض الدهنية من الطبقات الدهنية المختلفة ومن ثم يمكن تحديد بشكل فردي.

في الأدب العديد من الطرق الأخرىوصف لتحليل الدهون في الطحالب. تركز بعض الأساليب على مجموع مكونات محبة للدهون 15، في حين تركز أساليب أخرى على مجموع الأحماض الدهنية 9،16. وتشمل هذه البدائل تقرير الجاذبية من الدهون الكلية المستخرجة، مباشرة عبر الأسترة من الأحماض الدهنية جنبا إلى جنب مع الكمي باستخدام اللوني، وتلطيخ الخلايا مع الأصباغ الفلورية محبة للدهون.

وثمة بديل استخداما لتقدير الأحماض الدهنية باستخدام اللوني هو التقدير الكمي للدهون باستخدام تقرير الجاذبية 17،18. مزايا وجود تقرير الجاذبية هي عدم وجود متطلبات لمعدات متقدمة ومكلفة مثل اللوني الغاز؛ تخفيف لإعداد الإجراء، نظرا لتوافر المعدات التحليلية موحدة (على سبيل المثال سوكسليت)؛ وتقرير الجاذبية هو أقل استهلاكا للوقت من اللوني الأساليب القائمة. والميزة الرئيسية لاستخدام أساليب اللوني استنادا إلى الغيرإيه اليد هو أنه في مثل هذا الأسلوب يتم قياس فقط الأحماض الدهنية. في تقرير الجاذبية حمض غير الدهنية التي تحتوي على الدهون، مثل الصبغات أو المنشطات، وترد أيضا في تقرير. ويمكن لهذه الأحماض الدهنية غير المحتوية على الدهون تشكل نسبة كبيرة (> 50٪) من إجمالي الدهون. إذا كان أحد لا يهتم إلا في محتوى الأحماض الدهنية (على سبيل المثال للتطبيقات وقود الديزل الحيوي)، وسوف يتم المبالغة في تقدير ذلك عند استخدام تقرير الجاذبية. بالإضافة إلى ذلك، في تقرير الجاذبية دقة التوازن التحليلية المستخدمة لوزن الدهون المستخرجة يحدد حجم العينة التي تحتاج إلى استخدامها. هذه الكمية هي عادة أكثر بكثير من المبلغ المطلوب عند استخدام اللوني. أخيرا، ميزة أخرى لاستخدام اللوني على تقرير الجاذبية هو أن اللوني يوفر معلومات حول تكوين الأحماض الدهنية.

بديل آخر لدينا وسيلة قدم هو 16،19،20 الأسترة المباشرة.في هذه الطريقة يتم الجمع بين استخراج الدهون وأسترة الأحماض الدهنية لجوع في خطوة واحدة. هذا الأسلوب هو أسرع من خطوة الاستخراج والجزيئيات التبادلي منفصلة، ​​ولكن الجمع بين هذه الخطوات يحد من المذيبات التي يمكن استخدامها لاستخراج. وهذا قد يؤثر سلبا على كفاءة الاستخراج. ميزة أخرى لخطوة منفصلة استخراج الدهون والجزيئيات التبادلي هو أنه يتيح لفصل الطبقة الدهنية إضافية بين هذه الخطوات 1. هذا غير ممكن عند استخدام الأسترة المباشرة.

وتشمل الأساليب الأخرى المستخدمة عادة لتحديد محتوى الدهون في الطحالب تلطيخ الكتلة الحيوية مع البقع الفلورية محبة للدهون مثل النيل الأحمر أو BODIPY وقياس إشارة مضان 21،22. ميزة هذه الطرق هي أنها أقل شاقة من الطرق البديلة. والعيب من هذه الأساليب هو أن استجابة الفلورسنت، لأسباب مختلفة، بين متغير SPECIوفاق، وظروف زراعة، والطبقات الدهنية، والإجراءات التحليلية. على سبيل المثال، هي سبب العديد من هذه الاختلافات الاختلافات في امتصاص الصبغة من الطحالب. وبالتالي هناك حاجة المعايرة باستخدام طريقة أخرى الكمي، ويفضل أن يؤديها لجميع الشروط وزراعة مختلف مراحل النمو. أخيرا، هذا الأسلوب لا يوفر معلومات حول تكوين الأحماض الدهنية وأقل دقة وقابلة للتكرار من الطرق اللوني القائم.

ويستند أسلوب عرضها على طريقة وصفها امرز وآخرون 23 وسانتوس وآخرون 24 وكما تم تطبيقها من قبل مختلف الكتاب الآخرين 1،25-27. أيضا طرق أخرى المتاحة التي تقوم على نفس المبادئ ويمكن أن توفر نتائج مماثلة 9،28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحضير العينة

هناك نوعان من البروتوكولات البديلة لعينة شملت إعداد الخطوات كما 1.1 و 1.2. كلتا الطريقتين هي مناسبة على قدم المساواة وتعطي نتائج مماثلة، ولكن إذا كمية محدودة من حجم الثقافة الطحالب هو متاح، طريقة 1.1 مستحسن.

ملاحظة: للحصول على أي بروتوكول، وإعداد اثنين من أنابيب إضافية حبة الخافق وفقا لبروتوكول بأكمله ولكن دون إضافة الطحالب لهم لاستخدامها فارغة. بهذه الطريقة، يمكن تحديد القمم في اللوني GC الناتجة عن استخراج المكونات من المواد المستخدمة وكميا.

1.1. عينة بروتوكول إعداد الخيار 1: مستحسن عندما كمية محدودة من الطحالب الثقافة هو متاح

  1. تحديد تركيز الطحالب الوزن الجاف (ز / L) في مرق الثقافة، على سبيل المثال كما هو موضح من قبل بروير وآخرون. 1.
  2. نقل حجم ثقافة مرق يحتوي على 5-10 ملغ الطحالب الوزن الجاف لجهاز للطرد المركزي أنبوب زجاجي. حساب المبلغ المحدد من الكتلة الحيوية باستخدام نقل تركيز الكتلة الحيوية تحديدها في الخطوة 1.1.1.
  3. الطرد المركزي 5 دقائق في ز × 1،200.
  4. تجاهل جزء من طاف، وترك ما يقرب من 0.25 مل في أنبوب.
  5. إعادة تعليق الطحالب في طاف المتبقية لطيف pipetting لبيليه صعودا وهبوطا ونقل بيليه خلية كاملة لالخافق أنبوب حبة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  6. شطف أنبوب الطرد المركزي والزجاج ماصة بالماء ± 0.15 مل milliQ ونقل السائل إلى نفس حبة أنبوب الخافق.
  7. أنابيب الطرد المركزي حبة الخافق لدقيقة واحدة في أقصى دورة في الدقيقة للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء تبقى في الجزء السفلي من الأنابيب. فمن الممكن لتخزين أنابيب حبة الخافق مغلقة في -80 درجة مئوية.
  8. يجفد الأنابيب حبة الخافق الذي يحتوي على العينة. فمن الممكن لتخزين الأنابيب حبة الخافق مغلقة في -80 درجة مئوية.

1.2. عينة بروتوكول إعداد الخيار 2

  1. أجهزة الطرد المركزي وحدة تخزين غير محدد من الطحالب ثقافة مرق وتجاهل طاف. فإنه ليس من الضروري لتحديد تركيز الكتلة الحيوية أو لقياس حجم استخدام.
  2. قياس أو حساب الأسمولية من مستنبت باستخدام تركيز الأملاح الرئيسية موجودة في ثقافة المتوسط.
  3. غسل بيليه الخلية عن طريق إعادة التعليق على بيليه خلية في نفس الحجم، كما هو مستخدم في الخطوة 1.2.1، من حل فورمات الأمونيوم، الذي يقترب من الأسمولية من المتوسط ​​الثقافة. حل فورمات الأمونيوم equiosmolar يمنع lyses الخلية أثناء غسل الخلايا.

ملاحظة: غسل خلايا ضروري لإزالة الأملاح الموجودة في مستنبت. هذا مهم بشكل خاص لتحليل الأحماض الدهنية في الطحالب البحرية بسبب ارتفاع تركيز الملح في المتوسط ​​ثقافتهم. إذا الأملاح ستكون لا تزال موجودة، وهذا من شأنه أن يسبب المبالغة في تقدير كمية الخلايا الوزن الجاف والتي سوف يتم تحديدها في وقت لاحق ربروتوكول له. يستخدم فورمات الأمونيوم لغسل الخلايا لأن هذا الحل سوف تتبخر تماما خلال تجفيد وعدم ترك أي بقايا.

  1. تعليق الطرد المركزي الطحالب وتجاهل طاف.
  2. يجفد بيليه الخلية.
  3. تزن 5-10 ملغ مسحوق مجفف بالتجميد الطحالب في أنبوب حبة الخافق. تسجيل الوزن الدقيق.

2. تعطيل الخلايا والدهون استخراج

ملاحظة: يصف هذا القسم إجراء اسعة تمزيق الخلايا. ربما، بعض الخطوات تمزيق الخلايا هي زائدة عن الحاجة وتمزيق الخلايا أقل اتساعا قد تسفر عن نفس النتائج بالنسبة لبعض الأنواع الطحالب أو الكتلة الحيوية المشتقة من زراعة بعض الظروف. وهذا من شأنه تحتاج التحقق من صحة لكل حالة على حدة ولكن. ولذلك أوصى بروتوكول تعطل واسع النطاق المقترح كوسيلة عالمية مناسبة لجميع المواد الطحالب الدقيقة.

  1. تزن المبلغ المحدد من tripentadecanoin (آرiacylglycerol يحتوي على ثلاثة C15: 0 الأحماض الدهنية) وإضافته إلى مبلغ يعرف بالضبط من 04:05 (ت / ت) كلوروفورم: الميثانول. بهذه الطريقة تركيز tripentadecanoin يعرف بالضبط. تهدف لتركيز 50 مجم / لتر. Tripentadecanoin يخدم كمعيار الداخلية لتقدير الأحماض الدهنية.
  2. إضافة 1 مل كلوروفورم: 04:05 الميثانول (ت / ت) التي تحتوي على tripentadecanoin لكل أنبوب الضرب (المحدد في الجدول الكواشف والمعدات). تحقق من عدم وجود حبات المتبقية داخل الغطاء من الأنبوب beadbeater، وهذا سوف يؤدي إلى تسرب من الأنابيب. استخدام ماصة الإزاحة الإيجابية لإضافة دقيقة من المذيبات.
  3. فاز حبة حبة الخافق أنابيب 8X في 2،500 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية، في كل مرة مع 120 ثانية الداخلي بين كل الضرب.
  4. نقل الحل من الأنابيب حبة الخافق لنظيف المقاوم للحرارة والزجاج 15 مل أنبوب الطرد المركزي مع إدراج تفلون المسمار مباراة دولية. تأكد من نقل جميع حبات من حبة أنبوب الخافق كذلك.
  5. لكانح حبة أنبوب الخافق، إضافة 1 مل كلوروفورم: 04:05 الميثانول (ت / ت) التي تحتوي على tripentadecanoin في الخافق أنبوب حبة، وكأب وثيقة وخلط، ونقل هذا الحل لنفس أنبوب زجاجي من الخطوة 2.4. غسل أنبوب ثلاث مرات (في المجموع 4 مل من الكلوروفورم: 04:05 الميثانول (ت / ت) يستخدم تحتوي tripentadecanoin لكل عينة - 1 مل بإضافته في الخطوة 2.2 و 3 مل لمدة 3 خطوات الغسيل).
  6. دوامة الأنابيب الزجاجية لمدة 5 ثوانى ويصوتن في حمام صوتنة لمدة 10 دقيقة.
  7. إضافة 2.5 مل من الماء MilliQ، التي تحتوي على 50 ملي 2-الأمينية-2-هيدروكسي-البروبان-1 ،3-ديول (تريس) و 1 M كلوريد الصوديوم، التي من المقرر أن درجة الحموضة 7 باستخدام محلول حمض الهيدروكلوريك. وهذا يؤدي إلى فصل المرحلة بين الكلوروفورم والميثانول: الماء. ويستخدم 1 M كلوريد الصوديوم لتعزيز توازن الدهون نحو المرحلة الكلوروفورم.
  8. دوامة لمدة 5 ثوانى ثم يصوتن لمدة 10 دقيقة.
  9. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 ز س.
  10. نقل المرحلة الكلوروفورم كامل (مرحلة القاع) إلى أنبوب زجاجي نظيف باستخدام pipett الزجاج باستوره. تأكد من عدم نقل أي الطور البيني أو مرحلة أعلى.
  11. إعادة استخراج عينة بإضافة 1 مل كلوروفورم إلى أنبوب القديمة (التي تحتوي على الميثانول: المحلول المائي).
  12. دوامة لمدة 5 ثوانى ثم يصوتن لمدة 10 دقيقة.
  13. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 ز س.
  14. جمع المرحلة الكلوروفورم (المرحلة القاع) باستخدام ماصة باستير الزجاج وتجمع مع أول جزء من الخطوة 2.10 الكلوروفورم.
  15. إذا واجهت صعوبات في جمع الكسر الكلوروفورم بأكمله في الخطوة السابقة، كرر الخطوات 2،11-2،14. المضي قدما على خلاف ذلك مع الخطوة 2.16.
  16. تتبخر الكلوروفورم من الأنبوب في تيار غاز النيتروجين. بعد هذه الخطوة يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية تحت جو غاز النيتروجين.

3. الأسترة إلى الأحماض الدهنية استرات الميثيل

  1. إضافة 3 مل الميثانول تحتوي على 5٪ (V / V) حامض الكبريتيك إلى الأنبوب الذي يحتوي على الدهون المستخرجة المجففة (أنبوب يحتوي في الأصل جزء الكلوروفورم) وإغلاق الأنبوب بإحكام.
  2. دوامة لمدة 5 ثانية.
  3. احتضان العينات لمدة 3 ساعة على 70 درجة مئوية في كتلة أو سخان حمام الماء. دوري (كل ± 30 دقيقة) ضمان أن العينات لا يتم المغلي (الناجم عن غطاء مغلقة بشكل غير صحيح) وأنابيب الدوامة. خلال هذا التفاعل يتم ميثليته الأحماض الدهنية إلى استرات الميثيل الأحماض الدهنية الخاصة بهم (جوع).
  4. عينات تبرد لدرجة حرارة الغرفة، وإضافة 3 مل MilliQ المياه و3 مل ن الهكسان.
  5. دوامة لمدة 5 ثوانى وتخلط لمدة 15 دقيقة مع محور دوار أنبوب الاختبار.
  6. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 ز س.
  7. جمع 2 مل من المرحلة الهكسان (أعلى) وضعت في أنبوب زجاجي جديدة باستخدام ماصة باستير الزجاج.
  8. إضافة الماء 2 مل MilliQ إلى مرحلة الهكسان جمعها لأنه يغسل.
  9. دوامة لمدة 5 ثوانى وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،200 ز س. بعد هذه الخطوة فمن الممكن لتخزين العينات في -20 درجة مئوية تحت جو غاز النيتروجين (مرحلة الانفصال ليس من الضروري).

4. الكمي للجوع Uالغناء الغاز اللوني

  1. ملء قارورة GC مع المرحلة الهكسان (المرحلة العليا) باستخدام ماصة باستير الزجاج.
  2. وضع القبعات على قارورة GC. تأكد من مختومة تماما قبعات، ولا يمكن أن تتحول، لمنع التبخر من القارورة.
  3. إعادة ملء المذيبات غسل GC (الهكسان)، قارورة تفريغ النفايات، ووضع قارورة العينة في صناعة السيارات في العينات. قبل تشغيل عينات الفعلية على GC، الجولة الأولى 2 الفراغات التي تحتوي الهكسان فقط على GC.
  4. تشغيل العينات على GC-ااا مع عمود Nukol (30 متر x 0.53 ملم × 1.0 ميكرون). استخدام درجة حرارة مدخل 250 درجة مئوية، واستخدام الهليوم كغاز الناقل، والضغط من 81.7 كيلو باسكال ونسبة الانقسام من 0.1:1، مجموع معدل التدفق: 20 مل / دقيقة. ااا درجة الحرارة للكشف عن 270 درجة مئوية مع H 2 معدل التدفق من 40 مل / دقيقة، ومعدل تدفق الهواء من 400 مل / دقيقة وكان معدل 9.3 مل / دقيقة التدفق. تعيين حجم الحقن إلى 1 ميكرولتر / عينة. حاقن قبل وغسل آخر مع n-الهكسان. تم تعيين الأولي درجة حرارة الفرن إلى 90 درجة مئوية لمدة 0.5 دقيقة ثم رفع الطرافةح 20 ° C / دقيقة حتى درجة حرارة الفرن 200 درجة مئوية يتم التوصل إليه. ثم يتم الحفاظ على درجة حرارة الفرن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 39 دقيقة. إجمالي وقت التشغيل هو 45 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد اللوني النموذجية التي يتم الحصول عليها عبر هذه العملية في الشكل 1. يتم فصل جوع حسب حجم ودرجة التشبع حسب العمود GC والبروتوكول المستخدم. أقصر طول سلسلة الأحماض الدهنية والأحماض الدهنية المشبعة أكثر (أقل روابط مزدوجة) لديها مرات الاحتفاظ أقصر. العمود GC المستخدمة والبروتوكول لا تنوي فصل أيزومرات الأحماض الدهنية (نفس طول السلسلة ودرجة التشبع، ولكن المواقف المختلفة من سندات مزدوجة)، ولكن هذا يمكن تحقيقه باستخدام عمود GC مختلفة والبروتوكول.

ويمكن حساب تركيز الأحماض الدهنية وتكوين باستخدام مجال قمم GC، والتركيز الداخلي القياسية (ملغم / لتر) (الخطوة 2.1)، وكمية الكتلة الحيوية تضاف إلى العينة (ملغ) (الخطوة 1.1.2 أو 1.2. 6، الذي تم اختياره حسب بروتوكول إعداد نموذج).

محتوى كل الأحماض الدهنية الفردية في الكتلة الحيوية (الدهنية حمض ملغ / غرام من الوزن الجاف) يمكن تحديده ب ذ

المعادلة 1
مع مساحة FAME الفردية على النحو الذي يحدده تكامل اللوني GC (الشكل 1)؛ مساحة C15: 0 FAME على النحو الذي يحدده تكامل اللوني GC (الشكل 1)؛

المعادلة 2
مع [هي] تركيز tripentadecanoin في الكلوروفورم: حل الميثانول كما هو محدد في الخطوة 2.1؛ ميغاواط C15: 0 FA الوزن الجزيئي للC15: 0 الأحماض الدهنية (242.4 جم / مول)؛ ميغاواط C15: 0 TAG الوزن الجزيئي من tripentadecanoin (765.24 جم / مول)؛

ighres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
على النحو الذي يحدده تشغيل حلول المعايرة على GC، وتشكل من خليط من C15: 0 FAME وجوع من جميع الأحماض الدهنية الفردية المتوقع في العينة، مع [C15: 0 FAME في حل المعايرة] تركيز C15: 0 FAME في الحل المعايرة (ملغم / لتر)؛ [FAME الفردية في حل المعايرة] تركيز FAME الفردية في حل المعايرة (ملغم / لتر)، والمناطق التي يحددها تكامل اللوني GC من الحل المعايرة.

يمكن حساب مجموع محتوى الأحماض الدهنية كمجموع جميع الأحماض الدهنية الفردية. ويمكن حساب وفرة نسبية من كل الأحماض الدهنية بقسمة تركيز كل الأحماض الدهنية الفردية من المحتوى الكلي الأحماض الدهنية.

تكوين الأحماض الدهنية ومحتوى Scenedesmus المائلة UTEX393 (Chlorophyceae) في إطار كل من النيتروجين وتزخر تستنزف الشروط هوهو مبين في الشكل 2. تتأثر للغاية تكوين الأحماض الدهنية ومحتوى النيتروجين جوعا. في S. المائلة، C16: 0 (حمض البالمتيك) وC18: 1 (حامض الأوليك) هما الأحماض الدهنية الأكثر وفرة.

وترد في تكوين الأحماض الدهنية ومحتوى Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (المشطورة) في إطار كل من النيتروجين وتزخر تستنزف الظروف في الشكل 3. مماثلة لS. المائلة، ومحتوى الأحماض الدهنية وتكوين تتأثر بشدة من المجاعة النيتروجين. P. tricornutum كما تنتج كميات كبيرة من الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية مثل C20: 5 (حمض الدهني، وكالة حماية البيئة)، وكذلك الأحماض الدهنية سلسلة طويلة جدا (حمض lignoceric، C24: 0) والتي يمكن الكشف عنها بواسطة هذا الأسلوب.

الشكل 1 < ر /> الشكل 1. ممثل GC-ااا اللوني. تم استخدام العينة المستمدة من Scenedesmus المائلة تتعرض لمجاعة النيتروجين. يتم عرض 20 دقيقة الأولى من اللوني فقط. بعد 20 دقيقة تم الكشف عن أي قمم في هذه العينة.

الرقم 2
الشكل 2. تكوين الاحماض الدهنية (الوفرة النسبية من الأحماض الدهنية) من Scenedesmus المائلة (Chlorophyceae) في إطار كل من النيتروجين كافية (أشرطة سوداء) والنيتروجين ظروف زراعة المحرومين (أشرطة بيضاء). وبلغ إجمالي محتويات الأحماض الدهنية 8.6 ± 0.5٪ و 44.7 ± 1.7٪ ( ٪ من الوزن الجاف) تحت النيتروجين كافية والنيتروجين حرمان ظروف زراعة، على التوالي. أشرطة الخطأ تشير إلى قيمة أعلى وأدنى من اثنين مكررات التحليلية.

خيمة "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 3
الرقم 3. تكوين الأحماض الدهنية (الوفرة النسبية من الأحماض الدهنية) من Phaeodactylum tricornutum (المشطورة) في إطار كل من النيتروجين كافية (أشرطة سوداء) والنيتروجين ظروف زراعة المحرومين (أشرطة بيضاء). بلغ إجمالي محتويات الأحماض الدهنية 11.7 ± 0.9٪ و 30.5 ± 1.1٪ (٪ من الوزن الجاف) تحت ظروف كافية النيتروجين والنيتروجين يحرم زراعة، على التوالي. أشرطة الخطأ تشير إلى قيمة أعلى وأدنى من اثنين مكررات التحليلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة الموصوفة يمكن استخدامها لتحديد محتوى وكذلك تكوين مجموع الأحماض الموجودة في الكتلة الحيوية الطحالب الدقيقة الدهنية. ، تم الكشف عن الأحماض الدهنية المستمدة من جميع الطبقات الدهنية، بما في ذلك التخزين (TAG)، وكذلك نسبة الدهون في غشاء (الفوسفورية والسكرية). ويمكن الكشف عن جميع أطوال سلسلة الأحماض الدهنية ودرجة التشبع الموجودة في الطحالب ومتميزة. ويستند هذا الأسلوب على تعطيل الميكانيكية الخلية، المذيبات استخراج الدهون مقرها، أسترة الأحماض الدهنية إلى جوع، والتحديد الكمي للجوع باستخدام كروماتوغرافيا الغاز في توليفة مع كاشف اللهب التأين (GC-FID). يتطلب هذا الأسلوب كميات صغيرة من عينة (5 ملغ)، دقيقة وقابلة للتكرار، ويمكن استخدامها من بين مجموعة واسعة من أنواع الطحالب. ويهدف هذا الأسلوب لاستخدامها لأغراض التحليل ومصممة خصيصا لاستخدام أحجام عينة صغيرة. وليس المقصود طريقة يمكن تحجيمها المتابعة وتستخدم لاستخراج كبيرةكميات من الأحماض الدهنية الطحالب الدقيقة. وجود قيود على هذا الأسلوب هو أنه شاقة ويمكن أن يستغرق بضعة أيام من بدء الإجراء إلى الحصول على نتائج. وخاصة في حالة عملية الرصد لإنتاج الطحالب الدقيقة الصناعية الأحماض الدهنية وهذا قد يعتبر القيد. إذا كانت هناك حاجة نتائج أسرع، وخيارات أخرى مثل تلطيخ مع الأصباغ الفلورية محبة للدهون قد تكون أكثر ملاءمة. والتوصيات التالية فيما يتعلق تنفيذ الإجراء التحليلي:

  1. استخراج وإجراءات موحدة الجزيئيات التبادلي باستخدام الدهون الثلاثية (tripentadecanoin) كمعيار داخلي. ويستخدم استخدام معيار الداخلية عادة لتقدير حجم جوع في العينات باستخدام كروماتوغرافيا الغاز، ولكن غالبا ما يتم استخدام معيار الداخلية FAME. فمن المستحسن استخدام معيار الداخلية TAG بدلا من معيار الداخلية FAME وإضافته قبل تمزيق الخلايا والاستخلاص بالمذيبات. الخسائر المحتملة خلال الدهون EXTRعمل أو الجزيئيات التبادلي غير مكتملة ومن ثم يمكن تصحيح ل، حيث من المتوقع أن خسائر مماثلة يمكن أن تحدث لمعيار الداخلية. معيار الداخلية ينبغي أن تستخدم هذا لا أزل التعاون مع الأحماض الدهنية التي تنتجها الطحالب. لأن الطحالب تنتج سوى الأحماض الدهنية حتى مع أرقام الكربون، وهو TAG تحتوي على الأحماض الدهنية مع عدد فردي من ذرات الكربون هو مرشح جيد. لأن العمود GC وبروتوكول منفصل ليس فقط على طول السلسلة ولكن أيضا على درجة التشبع، والغريب مرقمة الأحماض الدهنية المشبعة يمكن نظريا شارك أزل-مع غير المشبعة الأحماض الدهنية الزوجية. وينبغي التحقق من صحة ذلك أن المعيار الداخلي لا تستخدم شارك أزل مع الأحماض الدهنية الموجودة طبيعيا في العينة. في تجربتنا مع مختلف الطحالب، tripentadecanoin (TAG يحتوي على ثلاثة C15: 0 الأحماض الدهنية) لا أزل التعاون مع الأحماض الدهنية الموجودة طبيعيا في الطحالب.
  2. المشبعة والأحماض الدهنية غير المشبعة عالية اعطاء اجابات-GC ااا مختلفة (المناطق الذروة) بتركيزات مماثلة. لذا معايير جوع وينبغي أن تستخدم للمعايرة وتحديد العوامل استجابة النسبية من الأحماض الدهنية الفردية كما هو موضح في قسم النتائج ممثل. ويمكن أيضا معايير جوع استخدامها لتحديد مرات الاحتفاظ من الأحماض الدهنية الفردية. بدلا من ذلك، GC-MS يمكن استخدامها لتحديد الأحماض الدهنية.
  3. وسوف كل من عامل الوقت الاحتفاظ واستجابة النسبية من الأحماض الدهنية الفردية تغيير مع تقدم العمر المعدات GC. لذا ينصح المعايرة المتكررة من الوقت الاحتفاظ وعامل استجابة النسبية.
  4. تمزيق الخلايا الميكانيكية هو خطوة هامة في هذا الأسلوب. ويتحقق ذلك من خلال مزيج من تجفيد، والضرب حبة وصوتنة. بدون تمزيق الخلايا فمن الممكن أن ليس كل الدهون يتم استخراج 9،13. ربما، بعض الخطوات تمزيق الخلايا هي تمزيق الخلايا الزائدة عن الحاجة وأقل اتساعا (على سبيل المثال حبة أقصر الأوقات الضرب) قد تسفر عن إعادة نفسsults لبعض الأنواع الطحالب أو الكتلة الحيوية المشتقة من زراعة بعض الظروف. وهذا من شأنه تحتاج التحقق من صحة لكل حالة على حدة ولكن، لذلك ينصح بروتوكول تعطل واسع النطاق المقترح.
  5. أثناء الإجراء التحليلي، والمذيبات المستخدمة قد استخراج المكونات من الأنابيب البلاستيكية ونصائح ماصة المستخدمة. هذه المكونات المستخرجة قد تتداخل مع الكشف عن جوع باستخدام GC-ااا. خاصة، وسوف مرات حبة ضربات طويلة وارتفاع في درجة الحرارة خلال حبة الضرب يؤدي إلى تلويث المكونات. تجربتنا هو أن المكونات المستخرجة من أنابيب حبة ضربات سيؤدي في بضع قمم إضافية في اللوني GC-ااا، وبعضها تراكب مع الطحالب جوع المشتقة (أساسا الأحماض الدهنية المشبعة). عندما يتم تنفيذ الأسلوب كما هو مقترح، وهذا هو أبدا أكثر من 1-2٪ من المساحة الإجمالية الذروة. سوف تبريد أنابيب حبة حبة الخافق خلال ضرب واستخدام كميات أكبر من الكتلة الحيوية في العينة تقليل الذروة النسبيةمساحة هذه القمم المستمدة من البلاستيك. فمن المستحسن استخدام ماصات الزجاج وأنابيب الزجاج قدر الإمكان في جميع أنحاء البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الفراغات لفحص والصحيح للمكونات المستخرجة من البلاستيك، ولكن أيضا لمراجعة وتصحيح لفي التلوث على سبيل المثال المذيبات المستخدمة، فمن المستحسن.
  6. أثناء عملية حبة الضرب، وكلا من حبة الخافق وأنابيب حبة الخافق تسخين. عندما ضرب حبة لفترة أطول بكثير أو أكبر بكثير من دورة في الدقيقة المقترحة في هذا الأسلوب، وعندما يتم تطبيق أي التبريد في بين، وهذا يمكن أن يؤدي إلى غليان المذيبات، وفي نهاية المطاف تمزق الأنابيب. وهذا يؤدي إلى فقدان العينة. في تجربتنا، وتحدث هذه الحالة عندما حبة الضرب لأكثر من 6 دقائق في 6،000 دورة في الدقيقة.
  7. الطحالب يمكن أن تنتج الأحماض الدهنية غير المشبعة عالية، والتي يمكن أن تكون عرضة للأكسدة. Ryckebosch وآخرون. 9 يلاحظ أي تغيير في تكوين الأحماض الدهنية الناجمة عن أكسدة و غير المشبعةالأحماض العاطى خلال إجراءات استخراج المختلفة. اقترح أن المواد المضادة للاكسدة التي تحدث بشكل طبيعي في الطحالب حماية هذه الأحماض الدهنية غير المشبعة من الأكسدة. إذا كان يشتبه في أن الأكسدة قد تحدث، فإن إمكانية أن يكون لإضافة أحد مضادات الأكسدة الاصطناعية مثل butylhydroxytoluene (BHT) طالما لا المضادة للأكسدة شارك أزل مع جوع، وطالما أن كمية مضادات الأكسدة المستخدمة لا تتداخل مع اللوني 9. لمنع الأكسدة أثناء التخزين على المدى الطويل، فمن المستحسن أن عينات تخزينها في -80 درجة مئوية تحت جو غاز النيتروجين.
  8. يباسيس موجودة في الطحالب يمكن أن يحتمل يتحلل الدهون أثناء إجراء التحليل، وبالتالي تؤثر على النتائج. Ryckebosch وآخرون. 9 وجدت أن تجفيد يثبط نشاط الليباز. علاوة على ذلك، يباسيس لا تتحلل الأحماض الدهنية، ولكن مجرد فصل منها من مجموعة من الجلسرين glycerolipids. وبالتالي، ينبغي النشاط الليباز لا تتداخل مع المجلس الدولي للمطارات الدهنية قدمد البروتوكول. الانزيمات المشاركة في الفعل الدهنية حمض تدهور على أنزيم A تنشيط الأحماض الدهنية وحدوث مثل هذا التدهور خلال استخراج بالتالي لا يبدو احتمالا. ومع ذلك، في حالة يشتبه في أن انهيار الأنزيمية من الأحماض الدهنية من glycerolipids قد تؤثر على النتائج، فإن إمكانية أن يكون لإضافة مثبطات الليباز، مثل الأيزوبروبانول، طالما أن المانع لا تتداخل مع الإجراء التحليلي نفسه 9.

هذا الأسلوب يمكن تمديدها لقياس وتحديد تكوين الاحماض الدهنية من الدهون محايد (TAG) والدهون القطبية (الدهون الفوسفاتية، السكرية) باستخدام مرحلة استخراج الصلبة (SPE) خطوة الفصل بين الخطوة 2 (استخراج الدهن) والخطوة 3 (الجزيئيات التبادلي ) كما وصفها على سبيل المثال بروير وآخرون. 1. بدلا من ذلك، طبقة رقيقة اللوني (TLC) خطوة يمكن أن تستخدم لفصل مختلف الطبقات الدهنية القطبية، على سبيل المثال كما وصفها وانغ وبينينغ 28.

ويمكن تمديد هذه الطريقة لاستخدامها، على سبيل المثال، والنباتات، الأنسجة الحيوانية وغيرها من الكائنات الحية الدقيقة. بسبب التركيز على تمزيق الخلايا، وهذه الطريقة مناسبة أساسا لتحليل الأحماض الدهنية في المواد التي يصعب استخراجها.

الجزء استخراج أسلوب (الخطوات 1 و 2) يمكن استخدامها لاستخراج أصباغ ومحبة للدهون مكونات أخرى 23،25. ويمكن استخدام هذا الإجراء تمزيق الخلايا لاستخراج مكونات أخرى مثل النشا أو الكربوهيدرات باستخدام نظم المذيبات الأخرى (بما في ذلك الماء).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وهناك جزء من هذا العمل كان مدعوما ماليا من قبل المعهد لتعزيز الابتكار من خلال العلوم والتكنولوجيا الاستراتيجية للبحوث الأساسية (IWT-SBO) مشروع الشمس والخلايا Biosolar. واعترف إريك أكثر جرأة وBackKim نجوين عن مساهمتها في تعظيم الاستفادة من الإجراء الضرب حبة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54, (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25, (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24, (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329, (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4, (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45, (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1, (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89, (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84, (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36, (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71, (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100, (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45, (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28, (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77, (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109, (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106, (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24, (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162, (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics