Analyse af Fatty Acid indhold og sammensætning i mikroalger

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En metode til bestemmelse af fedtsyreindhold og sammensætning i mikroalger baseret på mekanisk celle forstyrrelser, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion, transesterificering, og kvantificering og identifikation af fedtsyrer ved hjælp af gaskromatografi beskrives. En tripentadecanoin intern standard bruges til at kompensere for eventuelle tab i udvinding og ufuldstændig transesterificering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Breuer, G., Evers, W. A., de Vree, J. H., Kleinegris, D. M., Martens, D. E., Wijffels, R. H., Lamers, P. P. Analysis of Fatty Acid Content and Composition in Microalgae. J. Vis. Exp. (80), e50628, doi:10.3791/50628 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En metode til at bestemme indholdet og sammensætningen af ​​fedtsyrer i alt til stede i mikroalger er beskrevet. Fedtsyrer er en vigtig bestanddel af mikroalger biomasse. Disse fedtsyrer kan være til stede i forskellige acyl-lipid-klasser. Især fedtsyrerne i triacylglycerol (TAG) er af kommerciel interesse, fordi de kan bruges til produktion af transportbrændstof, bulk kemikalier, nutraceuticals (ω-3 fedtsyrer) og fødevarer råvarer. At udvikle kommercielle applikationer, er der behov for pålidelige analysemetoder til kvantificering af fedtsyreindhold og sammensætning. Mikroalger er enkelte celler omgivet af en stiv cellevæg. En fedtsyre analysemetode bør give tilstrækkelig cellesprængning at løslade alle acyl lipider og ekstraktionsmetode, der anvendes, bør være i stand til at udtrække alle acyl lipidklasser.

Med den metode, der præsenteres her alle fedtsyrerne i mikroalger kan være præcist og reproducerbart idenceret og kvantificeres ved hjælp af små mængder af prøven (5 mg) uafhængig af deres kædelængde, umætningsgrad eller lipid klasse, de er en del af.

Denne metode giver ikke oplysninger om den relative forekomst af forskellige lipidklasser, men kan udvides til at adskille lipidklasser fra hinanden.

Metoden er baseret på en sekvens af mekanisk celle forstyrrelser, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion, omestring af fedtsyrer til methylesterolier (fames), og kvantificering og identifikation af FAMEs anvender gaskromatografi (GC-FID). En TAG intern standard (tripentadecanoin) tilsættes før den analytiske procedure for at korrigere for tab under udvinding og ufuldstændig transesterificering.

Introduction

Fedtsyrer er en af de vigtigste bestanddele af mikroalger biomasse og udgør typisk mellem 5-50% af cellens tørvægt 1-3. De er hovedsageligt til stede i form af glycerolipider. Disse glycerolipider gengæld består hovedsageligt af phospholipider, glycolipider og triacylglycerol (TAG). Især fedtsyrerne i TAG er af kommerciel interesse, fordi de kan bruges som en ressource til produktion af transportbrændstof, bulk kemikalier, nutraceuticals (ω-3 fedtsyrer) og fødevarer råvarer 3-6. Mikroalger kan vokse i havvand baseret vækstmediers, kan have en meget højere areal produktivitet end landplanter, og kan dyrkes i fotobioreaktorer på steder, der er uegnet til landbrug, måske endda offshore. Af disse grunde er mikroalger ofte betragtet som et lovende alternativ til terrestriske planter til produktion af biodiesel og andre bulkvarer 3-6. Potentielt ingen landbrugs log eller frisk vand (når dyrkes i lukkede fotobioreaktorer, eller når der bruges marine mikroalger) er nødvendig for deres produktion. Derfor er biobrændstoffer, der stammer fra mikroalger betragtet 3. generations biobrændstoffer.

Det samlede cellulære indhold af fedtsyrer (% tørvægt), lipid-klasse sammensætning, såvel som fedtsyren længde og graden af ​​mætning varierer meget mellem mikroalger arter. Desuden er disse egenskaber varierer med dyrkningsbetingelserne såsom tilgængeligheden af næringsstoffer, temperatur, pH og lysintensitet 1,2. For eksempel, når de udsættes for kvælstof sult, kan mikroalger akkumulere store mængder af TAG. Under optimale vækstbetingelser TAG udgør typisk mindre end 2% af tørvægt, men når de udsættes for nitrogenudsultning TAG indhold kan stige til op til 40% af mikroalger tørvægt 1.

Mikroalger primært producerer fedtsyrer med kædelængder af 16 og 18carbonatomer, men nogle arter kan gøre fedtsyrer op til 24 carbonatomer i længde. Både mættede samt yderst umættede fedtsyrer er produceret af mikroalger. Sidstnævnte omfatter fedtsyrer med ernæringsmæssige fordele (ω-3 fedtsyrer) som C20: 5 (eicosapentaensyre, EPA) og C22: 6 (docosahexaensyre, DHA) for hvilke der ikke vegetabilske alternativer 1,2,4,7. Den (distribution af) fedtsyre kædelængde og mætningsgrad bestemmer også egenskaber og kvalitet af alger-afledte biobrændstoffer og spiseolier 4,8.

At udvikle kommercielle anvendelser af mikroalger afledt fedtsyrer, er der behov for pålidelige analysemetoder til kvantificering af fedtsyreindhold og sammensætning.

Som også påpeget af Ryckebosch et al. 9, analyse af fedtsyrer i mikroalger adskiller sig fra andre substrater (fx vegetabilsk olie, fødevarer, dyrevæv osv.) væreforårsage 1) mikroalger er enkelte celler omgivet af stive cellevægge komplicerer lipidekstraktion 2) mikroalger indeholde en bred vifte af lipidklasser og lipid-klasse fordelingen er meget variabel 7. Disse forskellige lipidklasser har en lang række i kemisk struktur og egenskaber, såsom polaritet. Også andre end acyl lipider lipidklasser produceret 3) mikroalger indeholde en bred vifte af fedtsyrer, der spænder fra 12 til 24 carbonatomer i længde og indeholder både mættede samt yderst umættede fedtsyrer. Derfor udviklede metoder til at analysere fedtsyrer bortset mikroalger substrater måske ikke være egnet til at analysere fedtsyrer mikroalger.

Som gennemgået af Ryckebosch et al. 9, den vigtigste forskel mellem almindeligt anvendte lipidekstraktion procedurer er i opløsningsmiddel-systemer, der anvendes. På grund af det store udvalg af lipidklasser stede i mikroalger, der hver har forskellig polaritet, den ekstraheredelipid mængde vil variere med opløsningsmidler 10-12. Dette fører til uoverensstemmelser i lipid-indhold og sammensætning præsenteret i litteraturen 9,10. Afhængigt af den anvendte opløsningsmiddelsystem, metoder baseret på opløsningsmiddelekstraktion uden cellesprængning gennem for eksempel perle hjerteslag eller lydbehandling, kan ikke udtrække alle lipider på grund af den stive konstruktion af nogle mikroalger arter 9,13. I tilfælde af ufuldstændig lipidekstraktion kan ekstraktionseffektiviteten af de forskellige lipidklasser variere 14. Dette kan også have en effekt på det målte fedtsyresammensætning, fordi fedtsyresammensætningen er variabel blandt lipidklasser 7.

Vores fremgangsmåde er baseret på en sekvens af mekanisk cellesprængning, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion transesterificering af fedtsyrerne til fedtsyremethylestere (FAMEs) og kvantificering og identifikation af FAMEs anvender gaskromatografi i kombination med en flamme ionization detektor (GC-FID). En intern standard i form af en triacylglycerol (tripentadecanoin) tilsættes før den analytiske procedure. Mulige tab i udvinding og ufuldstændig transesterificering kan derefter korrigeres for. Fremgangsmåden kan anvendes til at bestemme indhold samt sammensætningen af ​​fedtsyrerne i mikroalger biomasse. Alle fedtsyrerne i de forskellige acyl-lipid klasser, herunder oplagring (TAG) samt membran lipider (glycolipider, phospholipider), der opdages, identificeres og kvantificeres præcist og reproducerbart ved denne metode kun bruger små mængder prøve (5 mg) . Denne metode giver ikke oplysninger om den relative forekomst af forskellige lipidklasser. Imidlertid kan fremgangsmåden udvides til at adskille lipidklasser fra hinanden 1. Koncentrationen og fedtsyresammensætningen af ​​de forskellige lipidklasser kan derefter bestemmes individuelt.

I litteraturen flere andre metoder erbeskrevet at analysere lipider mikroalger. Nogle metoder fokuserer på de samlede lipofile komponenter 15, mens andre metoder fokus på fedtsyrer i alt 9,16. Disse alternativer omfatter gravimetrisk bestemmelse af det samlede ekstraherede lipider, direkte trans-forestring af fedtsyrer kombineret med kvantificering ved hjælp af kromatografi og farvning celler med lipofile fluorescerende farvestoffer.

En almindeligt anvendt alternativ til kvantificering af fedtsyrer ved hjælp af kromatografi er kvantificering af lipider under anvendelse af en gravimetrisk bestemmelse 17,18. Fordele ved en gravimetrisk bestemmelse er manglen på krav til avancerede og dyre udstyr som en gaskromatograf, let at sætte op proceduren på grund af tilgængeligheden af standardiserede analytiske udstyr (f.eks Soxhlet), og en gravimetrisk bestemmelse er mindre tidskrævende end kromatografi baserede metoder. Den største fordel ved at anvende kromatografi metoder på othare side er, at kun fedtsyrer i en sådan fremgangsmåde måles. I en gravimetrisk bestemmelse ikke-fedtsyre indeholdende lipider, ligesom pigmenter eller steroider, er også medtaget i opgørelsen. Disse ikke-fedtsyre indeholdende lipider kan udgøre en stor del (> 50%) af de samlede lipider. Hvis man kun er interesseret i fedtsyre-indhold (for eksempel til anvendelser biodiesel), vil det være overvurderet, når en gravimetrisk bestemmelse anvendes. Hertil kommer, i en gravimetrisk bestemmelse nøjagtigheden af ​​den analytiske balance bruges til at afveje de udtrukne lipider bestemmer prøvens størrelse, der skal bruges. Denne mængde er typisk meget mere end den mængde, der kræves, når kromatografi anvendes. Endelig er en anden fordel ved at anvende kromatografi over gravimetrisk bestemmelse er, at chromatografi giver oplysninger om fedtsyresammensætningen.

Et andet alternativ til vores præsenterede metode er direkte transesterificering 16,19,20.I denne metode lipidekstraktion og transesterificering af fedtsyrer til FAMEs kombineres i én arbejdsgang. Denne fremgangsmåde er hurtigere end en separat udvinding og transesterificering skridt, men at kombinere disse trin begrænser de opløsningsmidler, der kan anvendes til ekstraktion. Dette kan have en negativ indflydelse udsugningseffektivitet. En anden fordel ved en særskilt lipidekstraktion og transesterifikation skridt er, at det giver mulighed for en ekstra lipid klasse adskillelse mellem disse trin 1. Dette er ikke muligt, når direkte transesterificering anvendes.

Andre almindeligt anvendte metoder til at bestemme fedtindholdet i mikroalger omfatte farvning biomassen med lipofile fluorescerende pletter såsom Nile rød eller BODIPY og måle fluorescens signal 21,22. En fordel ved disse metoder er, at de er mindre arbejdskrævende end alternative metoder. En ulempe ved disse metoder er, at fluorescerende respons er af forskellige grunde, variabel mellem species, dyrkningsforhold, lipidklasser og analytiske procedurer. Som et eksempel, er flere af disse variationer skyldes forskelle i optagelse af farvestoffet ved mikroalger. Kalibrering med en anden kvantitativ metode er derfor nødvendigt, fortrinsvis udført for alle de forskellige dyrkningsbetingelser og vækststadier. Endelig virker denne metode ikke give oplysninger om fedtsyresammensætningen og er mindre nøjagtige og reproducerbare end kromatografi baserede metoder.

Den præsenterede metode er baseret på den beskrevet af Lamers et al. 23 og Santos et al. 24-metoden og er også blevet anvendt af forskellige andre forfattere 1,25-27. Også andre metoder er til rådighed, der er baseret på de samme principper, og kunne give lignende resultater 9,28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Prøveforberedelse

Der er to alternative protokoller for prøveforberedelse indgår som trin 1.1 og 1.2. Begge metoder er lige så egnede og giver lignende resultater, men hvis en begrænset mængde af alger kultur volumen er tilgængelig, anbefalede metode 1.1.

BEMÆRK: For enten protokol, forberede yderligere to perle beater rør i henhold til protokollen for hele men uden at tilføje alger til dem for at blive brugt som en blank. På denne måde kan toppe i GC kromatogram som følge af udvinding af komponenter fra materialer identificeres og kvantificeres.

1.1. Prøveforberedelse Protocol Mulighed 1: Anbefalet Når en begrænset mængde af alger kultur er tilgængelig

  1. Bestem alger koncentration tørvægt (g / l) i kulturen bouillon, for eksempel som beskrevet af Breuer et al. 1..
  2. Overfør en mængde af kultur bouillon, der indeholder 5-10 mg alger tørvægt tilet glas centrifugerør. Beregne den nøjagtige mængde biomasse overføres ved hjælp af biomasse koncentration bestemt i trin 1.1.1.
  3. Centrifuger i 5 minutter ved 1.200 x g.
  4. Kassér del af supernatanten forlader ca 0,25 ml i røret.
  5. Re-suspendere alger i resterende supernatanten ved forsigtig pipettering pillen op og ned og overføre komplet cellepellet til en perle tæppebanker rør ved hjælp af en 200 gl pipette.
  6. Skyl centrifugeglas glaspipette med ± 0,15 ml MilliQ vand og overføres væsken til den samme perle beater rør.
  7. Centrifuge perle tæppebanker rør til ét minut ved maksimalt omdrejningstal for at sikre, ingen luftbobler forbliver i bunden af ​​rørene. Det er muligt at opbevare lukkede bead beater rør ved -80 ° C.
  8. Lyofilisere perle beater rør indeholdende prøven. Det er muligt at opbevare de lukkede bead beater rør ved -80 ° C.

1.2. Prøveforberedelse Protocol Mulighed 2

  1. Centrifuger en ubestemt mængde af alger dyrkningsvæsken og kassér supernatanten. Det er ikke nødvendigt at bestemme koncentrationen biomasse eller at måle anvendte mængde.
  2. Måle eller beregne osmolariteten af ​​dyrkningsmediet ved hjælp af koncentrationen af ​​de vigtigste salte er til stede i dyrkningsmediet.
  3. Vask cellepelleten ved at resuspendere cellepelleten i det samme volumen, som anvendes i trin 1.2.1, med en ammoniumformiat løsning, som tilnærmer osmolariteten af ​​dyrkningsmediet. En equiosmolar ammoniumformiat løsning forhindrer celle lyserer under vask af cellerne.

BEMÆRK: Vask cellerne er nødvendigt at fjerne salte til stede i dyrkningsmediet. Dette er især vigtigt for fedtsyreanalyse i mikroalger grund af de høje saltkoncentrationer i deres dyrkningsmedium. Hvis salte stadig vil være til stede, ville dette medføre overvurdering af den mængde af celle tørvægt som vil blive fastlagt senere i tsin protokol. Ammoniumformiat bruges til at vaske celler, fordi denne løsning helt vil fordampe i løbet af frysetørring og ikke efterlade nogen rester.

  1. Centrifuge alger suspension og kassere supernatanten.
  2. Lyofilisere cellepelleten.
  3. 5-10 mg frysetørret mikroalger pulver afvejes i en perle beater rør. Optag den nøjagtige vægt.

2. Cellesprængning og fedtekstraktion

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver en omfattende cellesprængning procedure. Muligvis er nogle af de cellesprængning trin er overflødige og mindre omfattende cellesprængning kunne give de samme resultater for nogle mikroalger arter eller for biomasse fra visse dyrkningsbetingelser. Det skulle validering for hver enkelt situation dog. Derfor foreslås omfattende forstyrrelser protokol anbefales som en universel metode egnet til alle mikroalger materiale.

  1. En nøjagtig mængde tripentadecanoin (tr afvejesiacylglycerol med tre C15: 0 fedtsyrer), og føje den til en nøjagtig kendt mængde 04:05 (v / v) chloroform: methanol. På denne måde er koncentrationen af ​​tripentadecanoin er nøjagtig kendt. Målet for en koncentration på 50 mg / L. Tripentadecanoin tjener som intern standard for fedtsyre kvantificering.
  2. Tilsæt 1 ml chloroform: methanol 04:05 (v / v) indeholdende tripentadecanoin hver bankende rør (angivet i de reagenser og udstyr tabel). Kontroller, at der ikke er nogen perler forblive inde i hætten af ​​beadbeater røret, vil dette resultere i utætte af rørene. Brug en fortrængningspumpe pipette til nøjagtig tilsætning af opløsningsmidler.
  3. Bead slå bead beater rør 8x ved 2500 rpm i 60 sekunder, hver gang med en 120 sek indre mellem hvert slag.
  4. Opløsningen overføres fra perlen beater rør til en ren varme-resistent 15 ml glas centrifugeglas med Teflon skærskrue-caps. Vær sikker på at overføre alle perlerne fra perlen tæppebanker rør så godt.
  5. Til varh perlen tæppebanker rør, tilsættes 1 ml chloroform: methanol 04:05 (v / v) indeholdende tripentadecanoin i perlen tæppebanker rør tæt hætte og mikse og overføre denne løsning på den samme glasrør fra trin 2.4. Vask glasset tre gange (i alt 4 ml chloroform: methanol 04:05 (v / v) indeholdende tripentadecanoin anvendes per prøve - 1 ml tilsættes i trin 2.2 og 3 ml til 3 vasketrin).
  6. Vortex glasrør til 5 sek og soniker i et ultralydsbad i 10 min.
  7. Tilsæt 2,5 ml MilliQ vand, indeholdende 50 mM 2-amino-2-hydroxymethyl-propan-1 ,3-diol (Tris) og 1 M NaCl, som er indstillet til pH 7 ved hjælp af en HCI-opløsning. Dette vil medføre en faseseparation mellem chloroform og methanol: vand. 1 M NaCl bruges til at forbedre ligevægten af ​​lipider mod chloroformfasen.
  8. Vortex i 5 sekunder og derefter lydbehandle i 10 min.
  9. Centrifuger i 5 minutter ved 1.200 x g.
  10. Overfør hele chloroformfasen (nederste fase) til et rent glas rør ved hjælp af et glas Pasteur pipette. Sørg for ikke at overføre nogen mellemfasen eller øverste fase.
  11. Gen-udpakke prøven ved tilsætning af 1 ml chloroform til gamle rør (indeholdende methanol: vand opløsning).
  12. Vortex i 5 sekunder og derefter lydbehandle i 10 min.
  13. Centrifuger i 5 minutter ved 1.200 x g.
  14. Chloroformfasen opsamles (nederste fase) ved hjælp af et glas Pasteur pipette og pool med den første kloroform fraktion fra trin 2.10.
  15. Hvis der vanskeligheder med at indsamle hele kloroform fraktionen i det forrige trin, skal du gentage trin 2,11-2,14. Ellers skal du fortsætte med trin 2.16.
  16. Afdampe chloroform fra røret i en strøm af nitrogengas. Efter dette trin prøver kan opbevares ved -20 ° C under en nitrogengas-atmosfære.

3. Transesterificering til fedtsyremethylestere

  1. Tilsæt 3 ml methanol indeholdende 5% (v / v) svovlsyre til røret indeholdende de tørrede ekstraherede lipider (rør oprindeligt indeholder fraktionen chloroform) oglukke tuben tæt.
  2. Vortex i 5 sek.
  3. Inkuber prøver til 3 timer ved 70 ° C i en blok varmeapparat eller vandbad. Periodisk (hver ± 30 min) sikrer, at prøverne er ikke kogende (forårsaget af en forkert lukket låg) og vortexrør. Under denne reaktion fedtsyrer methyleres til deres fedtsyremethylestere (FAMEs).
  4. Cool prøver til stuetemperatur og tilsættes 3 ml MilliQ vand og 3 ml n-hexan.
  5. Vortex i 5 sek og bland i 15 minutter med et reagensglas rotator.
  6. Centrifuger i 5 minutter ved 1.200 x g.
  7. Collect 2 ml hexan (øverste) fase og sat i frisk glasrør ved hjælp af en glas Pasteur-pipette.
  8. Tilsæt 2 ml milliQ vand til den indsamlede Hexanfasen at vaske det.
  9. Vortex i 5 sek og centrifugeres i 5 min ved 1.200 x g.. Efter dette trin er det muligt at opbevare prøverne ved -20 ° C under nitrogengasatmosfære (faseadskillelse ikke nødvendigt).

4.. Kvantificering af FAMEs USing Gas Chromatography

  1. Fyld GC hætteglas med hexan fase (øvre fase) med en glas Pasteur-pipette.
  2. Placer hætter på GC hætteglas. Sørg for, at hætterne er helt forseglede, og kan ikke tændes, for at forhindre fordampning fra hætteglasset.
  3. Refill GC vask opløsningsmidler (hexan), tømme affald hætteglas, og sætte prøvehætteglas i auto-sampler. Før du kører den faktiske prøver på GC, først køre 2 blanke, der kun indeholder hexan på GC.
  4. Kør prøverne på en GC-FID med en Nukol kolonne (30 mx 0,53 mm x 1,0 um). Brug indgangstemperatur på 250 ° C og anvendes helium som bæregas, tryk på 81,7 kPa og split forhold på 0,1:1, totale strømningshastighed: 20 ml / min. FID-detektor temperatur på 270 ° C med H2 strømningshastighed på 40 ml / min, luftstrømningshastighed på 400 ml / min, og han strømningshastighed på 9,3 ml / min. Indstil injektionsvolumen til 1 gl / prøve. Før og efter vask injektor med n-hexan. Initial ovntemperaturen indstillet til 90 ° C i 0,5 min og derefter hævet witT 20 ° C / min indtil en ovntemperatur på 200 ° C er nået. Ovntemperaturen holdes derefter ved 200 ° C i 39 min. Samlet køretid er 45 minutter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et typisk kromatogram, som opnås via denne proces er vist i figur 1. FAMEs er adskilt af størrelse og graden af ​​mætning af GC-kolonne og protokol, der anvendes. Kortere kædelængde fedtsyrer og mere mættede fedtsyrer (færre dobbeltbindinger) har kortere retentionstider. Den anvendte GC-kolonne og protokol har ikke til hensigt at adskille fedtsyreisomerer (samme kædelængde og grad af mætning, men forskellige positioner dobbeltbindinger), men dette kunne opnås ved hjælp af en anden GC-kolonne og protokol.

Fedtsyre koncentration og sammensætning Den kan beregnes ved hjælp af arealet af GC toppe, intern koncentration standard (mg / L) (trin 2.1), og mængden af ​​biomasse tilsat prøven (mg) (trin 1.1.2 eller 1.2. 6, afhængigt af hvilket prøveforberedelse protokol er valgt).

Indholdet af hver enkelt fedtsyre i biomasse (mg fedtsyre / g tørvægt) kan bestemmes b y

Ligning 1
Med Område individuelle FAME som bestemmes ved integration af GC kromatogram (figur 1), Område C15: 0 FAME som bestemmes ved integration af GC kromatogrammet (fig. 1);

Ligning 2
Med [IS] koncentrationen af tripentadecanoin i chloroform: methanol opløsning som bestemt i trin 2.1 MW C15: 0 FA molekylvægten af C15: 0 fedtsyre (242,4 g / mol), MW C15: 0 TAG molekylvægten af tripentadecanoin (765,24 g / mol);

ighres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50628/50628eq3.jpg "/>
Som bestemt ved at køre kalibreringsopløsninger på GC, udgør ud af blandinger af C15: 0 FAME og FAMEs af alle individuelle fedtsyrer, der forventes i stikprøven, med [C15: 0 FAME i kalibreringsopløsning] koncentrationen af ​​C15: 0 FAME i kalibreringsopløsning (mg / L) [individuel FAME i kalibreringsopløsning] koncentrationen af ​​den enkelte FAME i standardopløsningen (mg / L), og de områder, som bestemmes ved integration af GC kromatogram af standardopløsningen.

Det totale fedtsyreindhold kan beregnes som summen af ​​alle individuelle fedtsyrer. Den relative forekomst af hver fedtsyre kan beregnes ved at dividere koncentrationen af ​​hver enkelt fedtsyre med det samlede fedtsyreindhold.

Fedtsyresammensætningen og indholdet af Scenedesmus obliquus UTEX393 (Chlorophyceae) under både kvælstof propfuld og nedbryder betingelservist i figur 2. Fedtsyresammensætning og indhold er stærkt påvirket af nitrogenudsultning. I S. obliquus, C16: 0 (palmitinsyre) og C18: 1 (oliesyre) er de to mest talrige fedtsyrer.

Fedtsyresammensætningen og indholdet af Phaeodactylum tricornutum UTEX640 (diatom) under både kvælstof propfuld og nedbryder betingelser er vist i figur 3.. Svarende til S. obliquus er fedtsyreindholdet og sammensætning stærkt påvirket af kvælstof sult. P. tricornutum producerer også væsentlige mængder af stærkt umættede fedtsyrer, såsom C20: 5 (eicosapentaensyre, EPA) samt meget langkædede fedtsyrer (lignocerinsyre, C24: 0), som kan detekteres ved denne metode.

Figur 1 < br /> Figur 1.. Repræsentative GC-FID kromatogrammet. En prøve fra Scenedesmus obliquus udsat for nitrogenudsultning blev anvendt. Kun de første 20 min af kromatogrammet er vist. Efter 20 minutter ingen toppe blev påvist i dette eksempel.

Figur 2
Figur 2. Fedtsyresammensætning (relativ overflod af fedtsyrer) af Scenedesmus obliquus (Chlorophyceae) under både kvælstof tilstrækkelig (sorte søjler) og kvælstof berøvet dyrkningsforhold (hvide søjler). De samlede fedtsyre indhold var 8,6 ± 0,5% og 44,7 ± 1,7% ( % af tørvægt) under nitrogen tilstrækkeligt og kvælstof berøvet dyrkningsforhold, hhv. Fejllinjer angiver den højeste og laveste værdi af to analytiske gentagelser.

telt "fo: keep-together.within-side =" altid "> Figur 3
Figur 3.. Fedtsyresammensætning (relativ overflod af fedtsyrer), i Phaeodactylum tricornutum (diatom) under både kvælstof tilstrækkelig (sorte søjler) og kvælstof berøvet dyrkningsforhold (hvide søjler). De samlede fedtsyre indhold var 11,7 ± 0,9% og 30,5 ± 1,1% (% af tørstof) under nitrogen tilstrækkelige og kvælstof berøvet dyrkningsbetingelser, hhv. Fejllinjer angiver den højeste og laveste værdi af to analytiske gentagelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til at bestemme indholdet samt sammensætningen af ​​totale fedtsyrer er til stede i mikroalger biomasse. Fedtsyrer afledt fra alle lipidklasser, herunder oplagring (TAG) samt membranlipider (phospholipider og glycolipider), opdages. Alle fedtsyrekædelængder og grader af mætning, der er til stede i mikroalger kan påvises og skelnes. Metoden er baseret på mekanisk celle forstyrrelser, opløsningsmiddelbaseret lipidekstraktion, omestring af fedtsyrer til FAMEs, og kvantificering af FAMEs anvender gaskromatografi kombineret med en flammeioniseringsdetektor (GC-FID). Denne metode kræver små mængder af prøven (5 mg), er nøjagtig og reproducerbar og kan bruges blandt en bred vifte af mikroalger arter. Denne fremgangsmåde er beregnet til at blive brugt til analytiske formål og er specifikt skræddersyet til anvendelse af små prøvestørrelser. Metoden er ikke beregnet til at blive opskaleret og anvendes til ekstraktion af storemængder af mikroalger fedtsyrer. En begrænsning ved denne metode er, at det er besværligt, og det kan tage et par dage starter proceduren for at opnå resultater. Især i tilfælde af procesovervågning til industriel mikroalger fedtsyreproduktion dette kan betragtes som en begrænsning. Hvis der kræves hurtigere resultater, kan andre muligheder, såsom farvning med lipofile fluorescerende farvestoffer være mere passende. Følgende anbefalinger er lavet med hensyn til at udføre den analytiske procedure:

  1. Udvinding og transesterifikation procedure er standardiseret ved hjælp af en triacylglycerol (tripentadecanoin) som en intern standard. Anvendelse af en intern standard er almindeligt anvendt til kvantificering af FAMEs i prøver ved hjælp af gaskromatografi, men oftest en intern standard FAME anvendes. Det anbefales at bruge en TAG intern standard snarere end en FAME intern standard og tilføje det før cellesprængning og solventekstraktion. Mulige tab i lipid Udvindinghandling eller ufuldstændig omestring kan derefter korrigeres for, eftersom det forventes, at lignende tab kan forekomme for den interne standard. En intern standard bør anvendes, der ikke co-elueres med fedtsyrer produceret af mikroalger. Fordi mikroalger kun producerer fedtsyrer med selv carbonantal en TAG indeholder en fedtsyre med et ulige antal carbonatomer, er en god kandidat. Fordi GC-kolonne og protokollen ikke kun adskilt af kædens længde, men også på umætningsgrad, kunne en mættet ulige nummereret fedtsyre hypotetisk co-elueres med en umættet selv nummereret fedtsyre. Det skal valideres, at den anvendte interne standard ikke co-elueres med fedtsyrer naturligt til stede i prøven. I vores erfaring med diverse mikroalger, tripentadecanoin (TAG med tre C15: 0 fedtsyrer) ikke co-elueres med fedtsyrer forekommer naturligt i mikroalger.
  2. Mættede og stærkt umættede fedtsyrer giver forskellige GC-FID reaktioner (toparealer) ved identiske koncentrationer. Derfor bør der anvendes standarder for FAMEs til kalibrering og bestemmelse af relative respons faktorer i de enkelte fedtsyrer som beskrevet i den repræsentative resultater sektionen. Kan også anvendes Standarder for FAMEs at bestemme retentionstider enkelte fedtsyrer. Alternativt kan GC-MS anvendes til fedtsyre identifikation.
  3. Både retentionstiden og relative respons faktor enkelte fedtsyrer vil ændre sig med GC udstyr alder. Hyppig kalibrering af opholdstid og relativ respons faktor anbefales derfor.
  4. Mekanisk cellesprængning er et vigtigt skridt i denne metode. Det realiseres ved en kombination af lyofilisering bead beating og sonikering. Uden cellesprængning er det muligt, at ikke alle lipiderne ekstraheret 9,13. Muligvis er nogle af de cellesprængning trin er overflødige og mindre omfattende cellesprængning (fx kortere perle beating tidspunkter) kunne give samme resultater for visse mikroalger arter eller for biomasse fra visse dyrkningsbetingelser. Det skulle validering for hver specifik situation imidlertid, derfor anbefales det foreslåede omfattende forstyrrelser protokol.
  5. Under den analytiske procedure, kan de anvendte opløsningsmidler udtrække komponenter fra plast rør og pipettespidser brugt. Disse ekstraherede komponenter kan forstyrre påvisning af FAMEs ved GC-FID. Især vil lange perle-beat tider og høj temperatur i løbet af perle-bankende resultere i at forurene komponenter. Vores erfaring er, at komponenter udvindes af perle-beat rør vil resultere i et par ekstra toppe i GC-FID kromatogram, hvoraf nogle overlay med alger afledt FAMEs (hovedsagelig de mættede fedtsyrer). Når fremgangsmåden udføres som foreslået, er aldrig mere end 1-2% af det totale topareal. Køling af perle-beater glassene under perle-prygl og bruge større mængder af biomasse per prøve vil reducere den relative topområde af disse plast afledte toppe. Det anbefales at bruge glas pipetter og glasrør så meget som muligt i hele protokollen. Endvidere kan anvendelsen af ​​råemner kontrollere og korrigere for de ekstraherede af plast komponenter, men også at kontrollere og korrigere for forureninger i for eksempel de anvendte opløsningsmidler, anbefales.
  6. Under perle-bankende proces vil både perle-beater og perle-beater rør varme op. Når perle-slag for en meget længere tid eller meget højere omdrejningstal end foreslået i denne fremgangsmåde, og da ingen køling anvendes i mellem, kan dette resultere i kogning af opløsningsmidlerne og til sidst brud på rørene. Dette vil resultere i et tab af prøven. Det er vores erfaring, opstår denne situation, når perle-slå mere end 6 min ved 6.000 rpm.
  7. Mikroalger kan producere stærkt umættede fedtsyrer, som kan være tilbøjelige til oxidation. Ryckebosch et al. 9. observeret nogen ændringer i fedtsyresammensætningen forårsaget af oxidation af umættede fATTY syrer under forskellige ekstraktionsprocedurer. Det blev foreslået, at antioxidanter naturligt forekommende i mikroalger beskytte disse umættede fedtsyrer fra oxidation. Hvis der er mistanke om, at kunne forekomme oxidation, ville en mulighed være at tilføje en syntetisk antioxidant, såsom butylhydroxytoluen (BHT), så længe antioxidant ikke co-eluerede med FAMEs, og så længe mængden af ​​antioxidant brugte ikke forstyrrer kromatografi 9. For at forhindre oxidation under langtidsopbevaring, anbefales det at opbevare prøver ved -80 ° C under en nitrogengas-atmosfære.
  8. Lipaser stede i mikroalger potentielt kan hydrolysere lipider under den analytiske procedure, og derfor påvirke resultaterne. Ryckebosch et al. 9. fundet, at lyofilisering inaktiverer lipaser. Hertil kommer, at lipaser ikke nedbrydes fedtsyrer, men blot frigøre dem fra glycerol gruppe af glycerolipider. Derfor bør lipaseaktivitet ikke blande sig i præsenterede fede ACId protokol. Enzymer involveret i fedtsyre nedbrydning handle på coenzym A aktiverede fedtsyrer og forekomsten af ​​en sådan nedbrydning under udvinding derfor ikke synes sandsynligt. Ikke desto mindre, i tilfælde der er mistanke om, at enzymatisk nedbrydning af fedtsyrer fra glycerolipider kan påvirke resultaterne, en mulighed ville være at tilføje en lipase-inhibitor, såsom isopropanol, så længe inhibitor ikke forstyrrer den analytiske procedure selve 9.

Denne fremgangsmåde kan udvides til at kvantificere og bestemme fedtsyresammensætningen af ​​neutrale lipider (TAG) og polære lipider (phospholipider, glycolipider) ved hjælp af en fast fase-ekstraktion (SPE) separeringstrin mellem trin 2 (lipid extraction) og trin 3 (transesterificering ) som beskrevet af for eksempel Breuer et al. 1.. Alternativt kan en Tyndtlagskromatografi (TLC) trin anvendes til at adskille forskellige polære lipidklasser, for eksempel som beskrevet af Wang og Benning 28.

Denne fremgangsmåde kan udvides til at blive anvendt i for eksempel planter, dyrevæv og andre mikroorganismer. På grund af den vægt på cellesprængning denne fremgangsmåde er hovedsagelig egnet til analyse af fedtsyrer i materialer, som er meget vanskeligt at udvinde.

Ekstraktionen del af fremgangsmåden (trin 1 og 2) kan anvendes til ekstraktion af pigmenter og andre lipofile komponenter 23,25. Cellen forstyrrelser procedure kan anvendes til udvinding af andre bestanddele, såsom stivelse eller kulhydrater ved hjælp af andre opløsningsmiddelsystemer (herunder vand).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

En del af dette arbejde blev støttet af Institut for at fremme innovation af videnskab og teknologi-Strategisk Basic Research (IWT-SBO) projekt Sollys og BioSolar celler. Erik Bolder og BackKim Nguyen er anerkendt for deres bidrag til optimering af perlen bankende procedure.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG) Sigma Aldrich T4257 CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample Larodan
Beadbeater Bertin Technologies Precellys 24
beadbeater tubes MP Biomedicals Lysing matrix E
116914500
GC-FID Hewlett-Packer HP6871
GC column Supelco Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl Mettler Toledo MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000 Mettler Toledo C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml VWR 612-1925
glass tubes VWR SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000 VWR SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps VWR SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator VWR 445-2101
Heated Evaporator/Concentrator Cole-Parmer YO-28690-25

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
  2. Hu, Q., Sommerfeld, M., et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances. The Plant Journal. 54, (4), 621-639 (2008).
  3. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances. 25, (3), 294-306 (2007).
  4. Draaisma, R. B., Wijffels, R. H., et al. Food commodities from microalgae. Curr. Opin. Biotechnol. 24, (2), 169-177 (2012).
  5. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J. An outlook on microalgal biofuels. Science. 329, (5993), 796-799 (2010).
  6. Wijffels, R. H., Barbosa, M. J., Eppink, M. H. M. Microalgae for the production of bulk chemicals and biofuels. Biofuels, Bioprod. Bioref. 4, (3), 287-295 (2010).
  7. Guschina, I. A., Harwood, J. L. Lipids and lipid metabolism in eukaryotic algae. Progress in Lipid Research. 45, (2), 160-186 (2006).
  8. Schenk, P. M., Thomas-Hall, S. R., et al. Second Generation Biofuels: High-Efficiency Microalgae for Biodiesel Production. BioEnergy Research. 1, (1), 20-43 (2008).
  9. Ryckebosch, E., Muylaert, K., Foubert, I. Optimization of an Analytical Procedure for Extraction of Lipids from Microalgae. Journal of the American Oil Chemists' Society. 89, (2), 189-198 (2011).
  10. Laurens, L. M. L., Dempster, T. A., et al. Algal Biomass Constituent Analysis: Method Uncertainties and Investigation of the Underlying Measuring Chemistries. Analytical Chemistry. 84, (4), 1879-1887 (2012).
  11. Iverson, S. J., Lang, S. L. C., Cooper, M. H. Comparison of the bligh and dyer and folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids. 36, (11), 1283-1287 (2001).
  12. Grima, E. M., Medina, A. R., et al. Comparison Between Extraction of Lipids and Fatty Acids from microalgal biomass. JAOCS. 71, (9), 955-959 (1994).
  13. Lee, J. Y., Yoo, C., Jun, S. Y., Ahn, C. Y., Oh, H. M. Comparison of several methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresour Technol. 101, Suppl 1 ement. 75-77 (2010).
  14. Guckert, J. B., Cooksey, K. E., Jackson, L. L. lipid solvent systems are not equivalent for analysis of lipid classes in the micro eukaryotic green alga. Journal of Microbiological Methods. 8, 139-149 (1988).
  15. Pruvost, J., Van Vooren, G., Cogne, G., Legrand, J. Investigation of biomass and lipids production with Neochloris oleoabundans in photobioreactor. Bioresource Technology. 100, (23), 5988-5995 (2009).
  16. Griffiths, M. J., Hille, R. P., Harrison, S. T. L. Selection of Direct Transesterification as the Preferred Method for Assay of Fatty Acid Content of Microalgae. 45, (11), 1053-1060 (2010).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol. Chem. 226, 497-509 (1956).
  18. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37, (8), 911-917 (1959).
  19. Lepage, G., Roy, C. C. Improved recovery of fatty acid through direct transesterification without prior extraction or purification. Journal of Lipid research. 25, 1391-1396 (1984).
  20. Welch, R. W. A micro-method for the estimation of oil content and composition in seed crops. J. Sci. Food Agric. 28, (7), 635-638 (1002).
  21. Chen, W., Zhang, C., Song, L., Sommerfeld, M., Hu, Q. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. Journal of Microbiological Methods. 77, (1), 41-47 (2009).
  22. Cooper, M. S., Hardin, W. R., Petersen, T. W., Cattolico, R. A. Visualizing "green oil" in live algal cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 109, (2), 198-201 (2010).
  23. Lamers, P. P., van de Laak, C. C., et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina. Biotechnology and Bioengineering. 106, (4), 638-648 (2010).
  24. Santos, A. M., Janssen, M., Lamers, P. P., Evers, W. A., Wijffels, R. H. Growth of oil accumulating microalga Neochloris oleoabundans under alkaline-saline conditions. Bioresour Technol. 104, 593-599 (2012).
  25. Mulders, K. J. M., Weesepoel, Y., et al. Growth and pigment accumulation in nutrient-depleted Isochrysis aff. galbana T-ISO. J. Appl. Phycol. (2012).
  26. Kliphuis, A. M., Klok, A. J., et al. Metabolic modeling of Chlamydomonas reinhardtii: energy requirements for photoautotrophic growth and maintenance. J. Appl. Phycol. 24, (2), 253-266 (2012).
  27. Lamers, P. P., Janssen, M., De Vos, R. C. H., Bino, R. J., Wijffels, R. H. Carotenoid and fatty acid metabolism in nitrogen-starved Dunaliella salina, a unicellular green microalga. Journal of Biotechnology. 162, (1), 21-27 (2012).
  28. Wang, Z., Benning, C. Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC). J. Vis. Exp. (49), e2518 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics