모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

Immunology and Infection

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Summary

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

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Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

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Abstract

Bioprinting은 신속한 프로토 타입 산업에서 그 기원을 가지고 새로운 기술입니다. 다른 인쇄 공정은 접촉 bioprinting 1-4 (압출, 딥 펜과 소프트 리소그래피), 비접촉식 bioprinting 5-7 (레이저 앞으로 전송, 잉크 제트 증착)와 같은 두 개의 광자 광중합 8로 레이저 기반 기술로 나눌 수 있습니다. 그것은 등 다른 세포 유형 17의 공동 배양의 영향으로 기본적인 생물 학적 질문에 대답하는 등 조직 공학 9-13, 바이오 센서 미세 14-16로와 도구로 많은 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다. 일반적인 포토 리소그래피 나 소프트 리소그래피 방법과는 달리, 압출 bioprinting은 별도의 마스크 나 스탬프를 필요로하지 않는 장점이 있습니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 구조의 설계를 신속하게 운영자의 요구 사항에 따라 변경 및 조정될 수있다. 이 리소그래피 기반의보다 유연 bioprinting합니다방법.

여기에 우리가 예를 들어 하이드로 겔 내에서 기둥의 배열을 사용하여 다중 소재 3D 구조를 만들려면 희생 금형의 출력을 보여줍니다. 이 기둥은 신경 가이드 도관 내의 혈관 네트워크 또는 튜브에 대한 중공 구조를 나타낼 수 있습니다. 희생 형을 위해 선택된 재료는 폴록 사머 407, 4에 액체 우수한 인쇄 특성을 가진 thermoresponsive 폴리머이었다 ° C 및 겔화 온도 이상으로 고체 ~ 20 ° C 24.5 % W / V 솔루션 18. 이 속성은 폴록 사머 기반의 희생 금형 수요에 용출 될 수 있으며, 특히 좁은 형상에 대한 고체 물질의 느린 분해에 장점이 있습니다. 폴록 사머를 희생 금형을 만들 현미경 유리 슬라이드에 인쇄되었다. 아가는 금형에 피펫 및 겔화 될 때까지 냉각 하였다. 얼음 냉수에있는 폴록 사머의 용출 한 후, 아가로 오스 금형 보이드 알지네이트 메타 크릴 레이트 SP로 가득 차 있었다FITC 표시 피브리노겐과 iked. 채워진 빈 공간은 다음 UV와 교차 연결되었고, 구조는 에피 형광 현미경으로 몇 군데 있었다.

Introduction

조직 공학 접근 방법은 인간의 조직과 장기 19,20의 재생과 관련하여 지난 몇 년 동안 많은 진전을 만들었습니다. 그러나, 지금까지 조직 공학의 초점은 종종 단순한 구조 또는 방광 21,22 또는 피부를 23-25으로 작은 치수가 조직에 한정되어있다. 인간의 몸은, 그러나, 세포와 세포 외 기질이 공간적으로 정의 된 방식으로 배열되어 많은 복잡한 3 차원 조직을 포함하고 있습니다. 이러한 조직을 제조하는 기술은 특정 위치에서 3 차원 구조 내에서 세포와 세포 외 기질 발판을 배치 할 수 있어야합니다. Bioprinting는 제조 복잡한 3 차원 조직의 비전 10,11,26-28을 실현 할 수있는 그런 기술이 될 가능성이있다.

Bioprinting은 패터닝 소재 전송 프로세스의 사용 "으로 정의 생물학적으로 상대를 조립합니다evant 재료 - 분자, 세포, 조직, 생분해 성 생체 -. 하나 이상의 생물학적 기능 "4 달성하기 위해 소정의 조직과 그것은 여러 가지 기술을 포함 두 개의 서브 마이크론 해상도에 이르기까지 서로 다른 해상도 및 길이의 비늘에서 작동하는 압출 인쇄 1,12,30위한 420 μM ~ 150 ㎛의 해상도 광자 중합 29. 아니 하나의 재료 또는 재료의 조합이 각각의 방법 (31)의 요구 사항을 만족시킬 것이다. 압출 인쇄의 주요 매개 변수는 점도 겔화 시간이다 높은 점도와 빠른 겔화가 바람직하다 32.

3D 프린팅은 복잡한 형상에게 30,33,34를 만들기위한 희생 금형 쉽게 만들 수있는 기술입니다. 이 과정은 압출 bioprinter 등 신속한 프로토 타이핑 기술을 사용하여 금형의 구조를 기반으로합니다. 만든 희생 형이 사용됩니다그들의 낮은 점도와 느린 겔화 시간으로 인해 인쇄하기 어려운 물질로부터 복잡한 구조를 형성한다. 여기에 제시된 방법은 낮은 온도에서 빠르게 용해하고 정확하게 압출 될 수있는 물질로 이루어진 희생 곰팡이의 생성을 포함한다. 블록 공중 합체 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 - 폴리 (프로필렌 글리콜) 67 - 폴리 (에틸렌 글리콜) 99 (또한 플루로 닉 F127 또는 폴록 사머 407라고도 함) 이러한 요구 사항을 충족. 그것은 이미 우리의 지식, 액체 환경에서의 불안정성으로 인해 수정되지 않은 버전의 인쇄에 사용 된 적이 있으며, 압출 인쇄 1 수정 버전에서 사용되었지만. 폴록 사머 407도 반전 열 반응 문제 18 즉, 냉각시 보솔 겔에서이 변화를 보여줍니다. 가장 중요한 것은, 그것은 매우 높은 충실도 복잡한 임의의 곡선 구조로 인쇄 할 수 있습니다. 이렇게하면에서 구조화 된 하이드로 겔의 생성저점도 물질이 경우 느린 겔 아가, 인쇄 희생 금형에 솔루션을 피펫 있습니다. 높은 충실도와 주조 구조화 된 하이드로 젤로부터 빠른 용출 그것은 마스크 또는 자주 리소그래피 방법에서 요구되는 스탬프를 사용하지 않고 다른 형상으로 금형을 만들 수있는 빠르고 유연한 방법을 만들어 함께 희생 형 인쇄의 조합. 주조 구조화 된 하이드로 젤은 더욱 낮은 점도로 인해 압출 인쇄에 적합하지 않은 다른 물질로 채워질 수있다. 이것은 우리의 경우 저점도 알긴산 메타 크릴 레이트 솔루션입니다. 여기에 우리가 기둥 배열의 예제를 사용하여 하이드로 겔 패턴에 대한 thermoresponsive 역 희생 금형의 방법을 제시한다.

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Protocol

1. 폴록 사머 407 용액의 조제

가능한 경우, 냉장실 (4 ° C)의 폴록 사머 솔루션의 준비를 수행합니다. 사용할 수없는 경우, 얼음처럼 차가운 물이 가득 비커에 유리 병을 놓습니다. 높은 온도에서 폴록 사머가 젤 점 이상이어야하며 제대로 분해되지 않습니다.

  1. 유리 병에 얼음 차가운 PBS 용액 60 mL를 추가하고 자석 교반기를 사용하여 적극적으로 저어.
  2. 폴록 사머의 24.5 그램 무게와 차가운 PBS에 소량에 추가합니다. 폴록 사머 부분적으로 더 추가하기 전에 해산 될 때까지 기다립니다.
  3. 모든 폴록 사머이 녹을 때까지 저어.
  4. 100 ML의 최종 볼륨에 도달 할 때까지 차가운 PBS를 추가합니다. 최종 농도는 24.5 % W / V 될 것입니다
  5. 솔루션을 교반 중지하고 ° C가 용액에서 거품과 거품 때까지 사라 4에서 휴식을 할 수 있습니다. 젤 안에 갇혀 거품이 P로 전송됩니다rinter 카트리지 및 인쇄 희생 금형의 결함으로 이어질 것입니다.
  6. 필터 (0.22 μm의 필터) 바늘을 방해 할 수있는 불필요한 입자를 제거하기 위해 직접 인쇄 카트리지에 솔루션을 제공합니다. 필터링 단계 필터 폴록 사머의 겔화를 방지하기 위해 (또는하지 않을 경우 냉각 팁, 필터 사용 가능) 추운 방에서 수행해야합니다. ° C까지 30 분 실험을하기 전에 4시에로드 된 카트리지를 보관하십시오.

2. 3D 프린터의 준비

이 작품에 사용되는 3D 프린터는 regenHU에서 "BioFactory"입니다. 시스템의 돌출 부분은 여러 부분으로 구성되어 있습니다. 상단의 압력 카트리지는 루어 잠금 어댑터를 통해 커넥터에 연결합니다. 커넥터는 카트리지의 출구와 솔레노이드 밸브의 입구 사이의 공백을 메워. 솔레노이드 밸브의 출구에서 직경이 다른 바늘을 사용할 수 있습니다. 소재는 하위에 압출진공 청소기를 이용하여 이동하는 단계에 개최되는 strate. 시스템의 주요 부분은 그림 1에 묘사되어 있습니다. 기타 압출 기반 시스템은 인쇄 과정에 사용하고, 최적화 프로세스는 각 시스템에 대해 수행해야 할 수 있습니다.

  1. 초순수로 채워 별도의 1.5 ML 테스트 튜브 솔레노이드 밸브 (노즐 직경 0.3 mm)와 바늘 (내경 0.15 mm) 놓고 30 분 동안 청소하는 가열 초음파 욕조에 넣습니다. 에탄올로 세척 밸브를 세척하고 질소 총을 건조.
  2. 밸브와 니들 프린터뿐만 아니라 빈 카트리지 청소를 설치합니다.
  3. 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 압축 공기로 설치된 밸브와 니들에서 잔여 액체를 날려. 작은 바늘 직경, 그것은 바늘을 방해 할 수있는 작은 입자의 항목을 방지하기 위해 압축 공기의 출구에 설치된 필터 (공통 주사기 필터 0.45 μm의 기공 크기)를 가지고하는 것이 좋습니다. 폴록 사머와 함께로드 카트리지 압력을 해제하고 설치합니다. 폴록 사머 실내 온도와 겔에 도달 할 수 있도록 카트리지는 카트리지를 설치하기 전에 냉장고에서 약 30 분을 이동해야합니다.
  4. 시스템에 3 줄의 압력을 적용하고 바늘 끝을 도달하고 지속적인 물가에서 돌출 될 때까지 폴록 사머를 분배.

3. 인쇄 매개 변수의 최적화

정확한 3D 구조를 만들려면 인쇄 과정은 선택한 재료와 농도 최적화 할 수 있습니다. 점도와 3D 인쇄 시스템에 따라 각 재료 매개 변수의 고정 세트에 대한 특정 분배 볼륨과 선 두께를 얻을 것입니다.

  1. 적합한 CAD 소프트웨어 (그림에서 ISO 파일을 생성 할 수)와 함께, 당신은 인쇄하고자하는 구조로 같은 길이에 대한 하나의 라인을 그립니다.
  2. 현미경 유리 슬라이드 25mm X 75mm X 1 배치mm 또는 프린터에 다른 기판과 진공을 ON하여 고정합니다.
  3. 프린터 소프트웨어에서 50 Hz의 높은 주파수로 솔레노이드 밸브를 설정하고 3 줄의 높은 압력을 설정합니다.
  4. 300mm / 분의 단계 속도를 가진 단 하나 줄 하나의 레이어를 인쇄합니다.
  5. 원하는 라인 폭에 도달 할 때까지 압력을 줄일 수 있습니다. 또한 밸브의 개방 시간을 통해 돌출 볼륨을 제어 할 수 있습니다.
  6. 어떤 연속 선이 더 이상 인쇄 할 수 없습니다 때까지 밸브의 빈도를 줄일 수 있습니다. 이 값 이상의 주파수를 선택합니다.

참고 : 원하는 라인 폭과 지속적인 라인이 달성되면, 하나의 인쇄 층을 한 후 최적의 단계 속도와 바늘의 상승 즉, 층 두께를 결정합니다.

  1. 서로의 상단에 여러 레이어를 인쇄하고 바늘이 여러 인쇄 층 후 이전 레이어 위에 올바른 위치에 있는지 확인합니다. 층의 두께 (바늘 리프트를 조정) 이렇게 각 계층은 다음 중 하나 (그림 3)의 상단에 인쇄되어 있는지 확인합니다.
  2. 300mm / 압출 레이어가 이전의 것들 (그림 4)와 같은 위치에서 시작하고 종료하도록 분 단계적에서 무대의 무대의 속도를 감소시킵니다. 너무 높은 단계의 속도는 압출 재료가 이전 레이어를 터치하기 전에 단계는 이동 될 수.
  3. 인쇄 기둥 구조. 단계 3.1.-3.8를 수행하는 대신 하나의 선 그리기의 단일 지점을 그립니다. 기둥을 인쇄 할 때에 집중하는 매개 변수는 기둥이 입금되어야 위치에서 프린트 헤드의 압력 (층 두께와 폴록 사머의 기둥의 직경을 조절) 밸브의 개방 시간 (압출 볼륨) 및 체류 시간입니다 .
  4. 매개 변수가 최적화 될 때, 라인의 여러 레이어를 인쇄하는 단단한 벽 또는 포인트, 기둥의 경우가 발생합니다. 나중에 사용하기 위해 매개 변수를 저장합니다.

이 시점에서의 최적화 과정 동안 발견 매개 변수를 사용합니다.

  1. 유리 현미경 슬라이드에 내부 구조 (여기에는 기둥 배열)를 인쇄하고 밤새 건조하자. 이)는 구조물의 크기와 두께를 줄이고 b)는 피할 수 리프트 오프 백필 동안, 그래서 구조와 기판 사이 더 나은 접착력을 제공합니다.
  2. CAD 소프트웨어로, 당신은 멀리 용출 채운하려는 구조를 둘러싼 외벽의 구성 구조를 그려라. 폴록 사머와 구조를 인쇄합니다. 벽의 인쇄 6 분 소요됩니다.

주의 : 벽 때문에 바늘의 크기의 내부 구조로부터 최소 3.5 mm 떨어져 인쇄 할 수 있습니다. 그렇지 않으면 외벽의 인쇄가 내부 구조를 파괴 할 것이다

  1. 당신의 SACR를 백필 할 솔루션을 준비합니다와 ificial 형 (탈 이온수 여기에 1 % 아가로 오스). 아가로 오스 솔루션은 35 ° C와 45 ° C. 사이의 온도를 가지고 있어야 이 온도 아래, 아가가 너무 빨리 응고 것이다 폴록 사머 구조가 부드럽게 때문에이 온도 이상, 그것은 인쇄 된 기둥을 파괴 할 수 있습니다.
  2. 천천히 피펫을 사용하여 되메우기 솔루션을 희생 형을 입력합니다. 이 벽 내부 구조의 파괴를 방지하기 위해 천천히 수행해야합니다.
  3. 채워질 솔루션 젤을하게하거나 사용 폴리머에 따라 가교. 아가의 경우 응고가 10 분 동안 4 ° C에서 열렸다.
  4. 폴록 사머 구조를 용출하는 10 분 동안 얼음 목욕 채워질 희생 형을 놓습니다.
  5. 종이 티슈로 채워질 구조를 몰아 내고 새로운 유리 현미경 슬라이드에 배치합니다. 사이의 공간에 빈에서 세 번째 하이드로 젤의 누설을 방지하기 위해 유리 현미경 슬라이드에주의 구조를 누르면채워질 구조와 유리 현미경 슬라이드.

5. 보이드의 작성

  1. 용출 폴록 사머에 의해 왼쪽 빈 공간을 채우기 위해, 30 G 바늘을 장착 한 주사기로 의도 된 고분자 용액을 채운다. 이 예제에서, 우리는 0.05 %의 추가로 0.15 M 염화나트륨 용액에 1 % 알긴산 메타 크릴 레이트를 사용하여 W / V 리튬 페닐 -2,4,6 - trimethylbenzoylphosphinate (LAP)와 2.5 %의 v / V를 사용 알렉사 - 488 복합 피브리노겐 . 알렉사 - 488 복합 피브리노겐은 시각화 목적을 위해 추가되었습니다.
  2. 5 분 및 이미지에 대한 고강도 UV 램프 (100 와트, 365 nm의 기판에서의 거리 3.5 cm이었다)와 폴리머를 Photopolymerize 에피 형광 또는 공 촛점 현미경을 사용하여 구성.

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Representative Results

대표 결과는 반전 형 기술은 (그림 2) 제 2 물질로 채워질 수 구조화 된 젤을 만드는 것을 보여줍니다. 모든 인쇄 과정의 시작 부분에 인쇄 매개 변수가 먼저 최적화되어 있습니다. 매개 변수의 단계적 조정은 그림 3과 하나의 선이 인쇄 그림 4에 나와 인쇄 다층 구조가 발생합니다. 층의 두께는 (하나의 인쇄 층 후 바늘) 이용하실 너무 낮은 경우, 하나는 바늘이 위의 레이어를 만질 것을 알 것입니다. 바늘이 너무 높은 경우, 인쇄 구조의 표면에 물결 무늬가 나타납니다. 이 그림 테스트 된 모든 층의 두께가 주어진 단계의 속도가 너무 크다고 3A-3D에서 볼 수 있습니다. 높은 단계의 속도는 층의 두께를 줄일 수 있기 때문에, 세트와 실제적인 층의 두께 사이의 작은 차이가 축적 웨이브 패턴이 시작됩니다구조 증가의 높이로 표시합니다. 층의 두께를 낮추는 방법으로, 차이가 작아와 웨이브 패턴은 이전보다 높은 위치 (그림 3C와 그림 3D에서 점선으로 표시)에 나타납니다. 단 속도가 너무 빠른 경우에서와 같이 고정 된 층의 두께를 들어,이 위로 향한 좁고은 구조 (인쇄 구조의 오른쪽 가장자리)의 시작 부분에 부푼를 가지고 어느 웨이브 패턴이나 구조에서 발생합니다 그림 4A-4C. 폴록 사머에 최적화 매개 변수는 0.2 밀리의 개방 시간, 31.14 Hz의 주파수, 0.15 mm, 1.5 바의 압력과 75mm / 분의 속도의 층 두께했다. 이러한 매개 변수로 인쇄 그림 4D처럼 부드러운 고체 벽을 만들었습니다. 그러나 100mm / 분의 높은 단계의 속도는 벽의 생산 시간을 줄이기 위해 프로세스 선택되었다.

Pi를 위해 최적화 된 매개 변수그림 5A와 같이 llar 인쇄는 (시간이 0.2 밀리 초, 주파수 31.14 Hz의 층 두께 0.08 mm, 압력 1.5 막대기, 단계 속도 200mm / 분, 거주 시간이 0.3 초를 열기) 우리는 기둥의 배열을 만들었습니다. 기둥 배열의 건조 효과는 중심을 향해 기둥의 휨습니다. 이 효과는 서로 더 떨어져 기둥을 배치하여, 감소, 그러나 피할 수는 없습니다. 그림 5b와 같이 벽 그 기둥 주위에 인쇄됩니다.

차가운 물에 희생 폴록 사머 형의 용출 한 후, 그림 5C에 표시된 것과 같은 구조 아가로 오스 하이드로 겔이 만들어졌습니다. 형광 알긴산 메타 크릴 레이트 솔루션 및 이후의 가교와 같은 새로운 하이드로 겔 인 하이드로 겔 기둥 배열과 빈 공간을 채운 후 그림 6과 하나가 될 수 있습니다. 3D Z-스택 재건 명확하게 생성 된 형광 기둥을 보여줍니다. 그림 7 강해>는 임의의 곡선 형을 만들려면이 기술의 가능성을 보여줍니다.

그림 1
그림 1. bioprinter의 묘사. bioprinter "BioFactory"의 A) 그림. 바늘과 밸브)이 이미지에 표시되지 않습니다하지만, B에 그려져있다. 최대 8 개의 프린트 헤드에 하나의 신속 물질 사이에서 변경할 수있는 회전 포탑에 장착되어 있습니다. 인쇄는에 이동할 수있는 이동 무대로 이루어집니다 X-, Y-및 z 방향. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 2. 구조화 된 하이드로 겔의 제조를 위해 희생 금형의 생산 과정의 계획.

그림 3
그림 3. 층의 두께 감소와 층 두께를 최적화. 고정 된 단계 속도로 인쇄 폴록 사머 층 (250mm / 분). 층의 두께가 너무 높은 경우, 물결 무늬가 나온다. 이 점차적 층의 두께 감소로 사라집니다. 빨간색 점선 라인이 인쇄 된 구조의 결함 무료 부분의 높이를 나타내는 반면 붉은 색 실선은 인쇄 된 구조의 바닥을 나타냅니다. 층) A) 0.18 mm, B이다 C) 0.15 mm와 D) 0.13 mm 0.16 mm의 두께. 빨간색 막대 2 밀리미터를 나타냅니다.

"> 그림 4
그림 4. 단계 속도 최적화. 단계의 서로 다른 속도) 250mm / 분, B) 200mm / 분, C) 150mm / 분, D와 0.15 mm의 층 두께로 인쇄 폴록 사머 층) 75mm / 분. 단계 속도를 낮추는 방법으로, 인쇄 과정의 출발점은 모든 레이어에 대해 동일하며 견고한 벽을 인쇄 할 수 있습니다. 빨간색 막대 2 밀리미터를 나타냅니다.

그림 5
그림 5. 기둥은 서로 1.75 mm를 분리 말린 폴록 사머의 패턴 하이드로 겔의 제조. A) 기둥 배열입니다. 기둥의 휨은 영향을 건조에 의해 발생합니다. 아가. C를 피펫 전에 폴록 사머 만든 벽으로 둘러싸인 B) 기둥 배열) 구조화희생 곰팡이 제거 후 아가로 오스 겔.

그림 6
그림 6. 찬란 분류 기둥의 3D Z-스택 재건 아가 발판에 포함.

그림 7
그림 7. 동심원은 폴록 사머에서 인쇄. 단일 레이어를 볼 수 있습니다. 빨간색 막대 2 밀리미터를 나타냅니다.

설계 기준 인쇄 매개 변수
미세한 층의 두께
  • 압력 ↓
  • 단계 속도 ↑
  • 개관 시간 ↓
  • 주파수 ↓
작은 선 두께
  • 압력 ↓
  • 단계 속도 ↑
  • 개관 시간 ↓
  • 주파수 ↓
연속 압출
  • 압력 ↑
  • 단계 속도 ↓
  • 타임 ↑를 열어
  • 주파수 ↑
빠른 건설 속도
  • 압력 ↑
  • 단계 속도 ↑
  • 타임 ↑를 열어
  • 주파수 ↑

표 1. 폴록 사머 라인의 압출 방법과 서로 다른 인쇄 매개 변수에 의해 영향을받을 수있는 네 개의 설계 변수.

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Discussion

여기에 우리가 처음 제시 빠르게 때문에 ~ 20 ° C의 폴록 사머의 젤 - 졸 전환 차가운 물에 용출 될 수있는 희생 금형 thermoresponsive 폴리머의 사용 전체 프로세스의 속도가 적절한 해상도로 인쇄 할 수 없습니다 생체 고분자 구조의 빠른 생성을위한 폴록 사머 재미 있습니다. 여기에 설명 된 기술은 다른 하이드로 겔 내에서 또는 이전에 다른 물질 35에 대해보고 되었기 때문에 미세 유체 채널의 생성을위한 패턴 하나의 하이드로 겔을 사용할 수 있습니다. 희생 형으로 폴록 사머의 장점은 채워지고 나중에 용출 할 수있는 고체 계층별로 계층 구조에 임의의 형상에 인쇄 할 수 있다는 것입니다.

우리는 여기에 구조화 된 하이드로 겔을 만드는 두 번째 히드로 겔의 후속 백필과 폴록 사머와 희생 금형을 만드는 과정을 설명합니다. 구조화 된 하이드로 겔의 재료는 채널이 될 수 있습니다작성 시점에서 점도와 온도에 관해서는 제한 OSEN. 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 36,37, 알긴산 38,39, 아가 40 methacrylated 생물 고분자 물질로 일반적으로 사용되는 고분자의 낮은 점성 전구체 용액은 41-43 적절한 충전 재료에 대한 몇 가지 예입니다. 높은 점성 물자는 그러나 좁은 형상을 채우기하지 않을 수 있습니다 또는 여기에 인쇄 된 기둥처럼 약하게 깨지기 쉬운 구조의 경우 희생 곰팡이를 파괴 할 수 있습니다. 낮은 비율 아가로 오스 솔루션은 따라서 백필을 위해 선택되었다. 폴록 사머와 함께 아가로 오스를 사용하는 또 다른 장점은 냉각에 의해 구체화하는 것입니다. 따라서 차가운 물에 잠긴 경우, 아가 로스는 겔 상태로 정확하게 반전 인쇄 폴록 사머 패턴을 반영하는 상태를 유지합니다.

이 절차에서 중요한 단계는 인쇄 매개 변수의 최적화, 희생 금형의 충전과를 포함보이드의 작성. 최적화 된 인쇄 매개 변수는 밸브, 압력, 단계 속도와 층 두께의 주파수 개방 시간이었다. 층의 두께는 모든 인쇄 층 후 바늘의 상승으로 정의됩니다. 기둥의 경우, 거주 시간은 조정도, 시간 물질이 무대를 이동하지 않고 지점에 돌출 한 즉. 하나의 매개 변수의 변화가 압출 라인의 다양한 설계 변수에 영향을 미칠 수 있기 때문에 최적화 과정은 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 다른 설계 기준의 주요 매개 변수는 표 1에 설명되어 있습니다.

프로세스의 두 번째 중요한 단계는 희생 금형의 충전이다. 희생 금형의 충전은 섬세한 단계입니다. 작고 좁은 구조는 종종 수동으로 신중하게 채워 져야하고, 솔루션의 간단한 캐스팅은 항상 가능하지 않을 수 있습니다 필요합니다.

의주의 충전아가와 acrificial 금형 따라서 기둥의 파괴를 방지하기 위해 100 μL 피펫을 사용하여 수행 하였다. 마지막 단계, 공극의 충전은, 30 G 바늘을 장착 한 주사기의 사용이 필요합니다. 주의를 작성하는 동안 거품 형성을 방지하기 위해주의해야한다.

여기에 제시된 구조의 다른 젤은 세포를 포함 할 수 있습니다. 구조화 된 하이드로 젤 내부의 공극 및 다른 세포 유형에서 하이드로 젤에 하나의 셀 유형을 배치하여, 공간적 정의 공동 배양 설정을 만들 수 있습니다. 밀러 등의 발행에서와 같이 3 차원 네트워크를 상호 연결. 30, 혈관 또는 신경 네트워크도 가능합니다. 같은 네트워크에 가능한 방법은 주변의 벽에서 선을 인쇄하고 두 번째 히드로 겔, 가교 두 번째 히드로 겔로 빈 공간을 채우고 90 ° 다음 레이어 회전 인쇄를 계속하는 것입니다. 희생 형으로 인쇄 폴록 사머의 장점은 둘 다 필요 없다는 것입니다마스터 몰드 나 마스크입니다. 또한 가열 된 프린터 헤드가 시스템의 재료와 막힘이 우리의 실험에서 관찰되지 않은 돌출 할 필요가 없습니다.

같은 여기에 제시된 것과 같은 구조가 확산 기반 세포 - 세포 상호 작용, 약물 발견을위한 공부를 공동 문화 공간적 조직 차원으로 미래에 사용될 수 있습니다. 그러나 여기에 제시된 절차의 완전 자동화 된 버전은 약물 검사의 분야에서 성공적으로되기 위해 개발 될 필요가있다.

요약하면, 우리는 할 수 하이드로 겔로 채워지고 나중에 용출 될 수 있습니다 임의의 형상의 인쇄.에게 방법을 제시 한 그 방법은 구조화 된 하이드로 겔 인 하이드로 겔 구조가 간단하고 비용 효율적인 방식으로 생성 할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 선언 아무 상관이 없다.

Acknowledgments

우리는 bioprinter에 도움 데보라 STUDER 감사합니다.

작품은 부여 계약을 N에 따라 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013) ° NMP4-SL-2009-229292에 의해 투자되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

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