Skriva termoresponsiv Omvänd Formar för skapandet av mönstrad Tvåkomponentsemballage Hydrogels för 3D Cell Culture

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En bioprinter användes för att skapa mönstrade hydrogeler baserade på en uppoffrande mögel. Den poloxamer formen återfylldes med en andra hydrogel och eluerades därefter och lämnar hålrum som fylldes med en tredje hydrogel. Denna metod använder snabb eluering och god tryckbarhet poloxamer att generera komplexa arkitekturer från biopolymerer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting är en ny teknik som har sitt ursprung i rapid prototyping branschen. De olika tryckmetoder kan delas in i kontakt bioprinting 1-4 (extrudering, dip penna och mjuk litografi), kontaktlös bioprinting 5-7 (laser framåt transfer, bläckstråle-nedfall) och laserbaserade tekniker såsom två photon fotopolymerisation 8. Den kan användas för många applikationer såsom tissue engineering 9-13, Biosensor microfabrication 14-16 och som ett verktyg för att besvara grundläggande biologiska frågor som influenser av samodling av olika celltyper 17. Till skillnad från gemensamma fotolitografiska eller mjuk-litografiskt metoder, har extrudering bioprinting den fördelen att den inte kräver en separat mask eller stämpel. Använda CAD-program, kan utformningen av strukturen snabbt ändras och justeras i enlighet med kraven i operatören. Detta gör bioprinting mer flexibel än litografi-baseradtillvägagångssätt.

Här kan vi visa tryckning av en sacrificial gjutform för att skapa en multi-material 3D struktur med hjälp av en matris av pelare inom en hydrogel som ett exempel. Dessa pelare kan representera hålstrukturerna för en vaskulär nätverk eller rören inom en nerv styrpassagen. Det material som väljs för sacrificial mögel var poloxamer 407, en termoresponsiv polymer med utmärkta tryckegenskaper som är flytande vid 4 ° C och en fast substans över dess gelningstemperatur ~ 20 ° C i 24,5% w / v-lösningar 18. Denna egenskap gör att poloxameren-baserade uppoffrande mögel som eluerades på efterfrågan och har fördelar över den långsamma upplösningen av ett fast material speciellt för trånga geometrier. Poloxamer trycktes på objektglas glas för att skapa den förlorade formen. Agaros pipetterades in i formen och kyldes tills gelning. Efter eluering av poloxamer i iskallt vatten, hålrummen i agaros form fyllts med alginat metakrylat spIKED med FITC-märkt fibrinogen. De fyllda hålrum därefter tvärbands med UV och konstruktet avbildades med ett epi-fluorescensmikroskop.

Introduction

Tissue engineering metoder har gjort stora framsteg under de senaste åren när det gäller förnyelse av mänskliga vävnader och organ 19,20. Men fram tills nu, har fokus för tissue engineering har ofta begränsat till vävnader som har en enkel struktur eller små dimensioner såsom urinblåsa 21,22 eller huden 23-25. Den mänskliga kroppen innehåller dock många komplexa tredimensionella vävnader där celler och extracellulär matris är anordnade i ett spatialt definierat sätt. För att tillverka dessa vävnader, är en teknik som krävs som kan placera celler och extracellulär matris ställningar inom en tredimensionell konstruktion vid specificerade positioner. Bioprinting har potential att bli en sådan teknik där visionen för tillverkning av komplexa tredimensionella vävnader kan förverkligas 10,11,26-28.

Bioprinting definieras som "användning av processer material överförs till mönstring och montering biologiskt relvanta material - molekyler, celler, vävnader och biologiskt nedbrytbara biomaterial -. med en föreskriven organisation för att uppnå ett eller flera biologiska funktioner "4 Den omfattar flera olika tekniker som arbetar vid olika upplösningar och skalor längd, allt från den sub-micron upplösning av två -photon polymerisation 29 till en upplösning på 150 nm till 420 nm för extrudering utskrift 1,12,30. Inte ett enda material eller material kombination kommer att uppfylla kraven i varje metod 31. För extrudering utskrift, de viktigaste parametrarna är viskositet och gelningstiden 32, där hög viskositet och snabb gelning är önskvärda.

3D-utskrift är en teknik som gör det enkelt att skapa uppoffrande formar för att skapa komplexa geometrier 30,33,34. Denna process är baserad på konstruktionen av en form med användning en rapid prototyping teknik såsom en strängsprutning bioprinter. Den skapade sacrificial form användsatt bilda komplexa strukturer från material som är svåra att skriva ut på grund av sin låga viskositet och långsam gelningstid. Den metod som presenteras här innebär skapandet av en sacrificial form bestående av ett material som löser sig snabbt vid låg temperatur och kan extruderas exakt. Segmentsampolymeren poly (etylenglykol) 99-poly (propylenglykol) 67-poly (etylenglykol) 99 (även känd som Pluronic F127 eller poloxamer 407) uppfyller dessa krav. Det har redan använts i en modifierad version av extrudering utskrift 1 men, till vår kunskap, har aldrig använts för utskrift i dess omodifierade versionen på grund av dess instabilitet i flytande miljöer. Poloxamer 407 visar också ett omvänt termiskt lyhörd beteende 18, dvs den förändras från en gel till en sol vid kylning. Viktigast av allt, kan den tryckas in i komplexa godtyckligt krökta strukturer med mycket hög trohet. Detta möjliggör skapandet av en strukturerad hydrogel från enlåg viskositet material, i detta fall långsam gelbildande agaros, genom att pipettera lösningen i tryckta uppoffrande mögel. Kombinationen av att skriva ut uppoffrande formen med hifi och dess snabba eluering från gjutna strukturerade hydrogel gör det en snabb och flexibel metod för att skapa formar med olika geometrier utan användning av en mask eller en stämpel som det ofta krävs i litografiska metoder. Den gjutna strukturerade hydrogelen kan vidare fyllas med ett annat material som inte är lämplig för strängsprutning utskrift beroende på dess låga viskositet. Detta är i vårt fall ett lågvisköst alginat metakrylat lösning. Här presenterar vi den metod för termoresponsiv omvänd uppoffrande formar för hydrogel mönstring med hjälp av exempel på en pelare array.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Beredning av Poloxamer 407 Solution

Om tillgängligt, utföra beredningen av poloxamer lösning i ett kallt rum (4 ° C). Om sådan ej finns, placera en glasflaska i en bägare fylld med is-kallt vatten. Vid högre temperaturer poloxameren kommer att ligga över gelpunkten och löses inte upp på rätt sätt.

  1. Tillsätt 60 ml iskall PBS-lösning i en glasflaska och rör om kraftigt med användning av en magnetomrörare.
  2. Väg 24.5 gram poloxamer och lägga den i små mängder till kall PBS. Vänta tills poloxameren har delvis upplöst innan du lägger mer.
  3. Rör om lösningen tills all poloxamer har lösts upp.
  4. Tillsätt kallt PBS tills en slutlig volym av 100 ml uppnås. Den slutliga koncentrationen kommer att vara 24,5% vikt / volym
  5. Stoppa omröring av lösningen och låt den vila vid 4 ° C tills bubblor och skum i lösningen har försvunnit. Bubblor som är fångade inuti gelén kommer att överföras till printer patron och kommer att leda till fel i de tryckta uppoffrande formarna.
  6. Filter (0,22 pm filter) lösningen direkt i Tryckningskassett för att avlägsna eventuella oönskade partiklar som skulle kunna sätta igen nålen. Den filtrerande steget bör utföras i ett kallt rum (eller om det inte finns med kylda tips, filter etc.) för att undvika gelning av poloxamer i filtret. Håll den laddade patronen vid 4 ° C tills 30 minuter före experimentet.

2. Beredning av 3D-skrivare

Den 3D-skrivare används i detta arbete var "BioFactory" från regenHU. Extruderingen delen av systemet består av flera delar. En patron under tryck vid toppen är ansluten till ett kontaktdon via en Luer-Lock-adapter. Anslutningsdonet överbryggar utrymmena mellan utloppet av patronen och inloppet av en magnetventil. Vid utloppet av magnetventilen, kan nålar med olika diametrar användas. Materialet extruderas på en substrera som hålls till en rörlig scen med vakuum. De viktigaste delarna av systemet visas i Figur 1. Andra extrudering baserade system kan användas för utskrift, och att optimera processen måste göras för varje system.

  1. Placera magnetventil (munstycksdiameter 0,3 mm) och nålen (innerdiameter 0,15 mm) i separata 1,5 ml graderade provrör fyllt med ultrarent vatten och placera dem i ett uppvärmt ultraljudsbad att rengöra under 30 minuter. Skölj de rengjorda ventiler med etanol och torka dem med en kväve pistol.
  2. Installera ventilen och nål i skrivaren samt en tom och rengjord patron.
  3. Applicera 3 bar tryck till systemet och blåsa ut eventuella kvarvarande vätskor från den installerade ventilen och nål med tryckluft. För liten nål diametrar, är det rekommenderat att ha ett filter (gemensam spruta filter, 0,45 um porstorlek) installerad vid utloppet av tryckluft för att undvika införsel av små partiklar som kan täppa igen kanylen. Slå bort trycket och installera patronen laddad med poloxamer. Patronen ska tas ut ur kylskåpet cirka 30 minuter innan montering av patronen så poloxameren kan nå rumstemperatur och gel.
  4. Applicera 3 bar tryck till systemet och dispensera poloxamer tills den når nålspetsen och strängsprutas i en kontinuerlig sträng.

Tre. Optimering av utskriftsinställningarna

För att skapa exakta 3D-strukturer, har tryckprocessen kan optimeras för det valda materialet och koncentration. Beroende på viskositeten och 3D-utskrifter systemet varje material kommer att ge en specifik dosering volym och line tjocklek för en fast uppsättning parametrar.

  1. Med en lämplig CAD-program (kan skapa ISO-filer från ritningarna), rita en linje ungefär samma längd som den struktur som du tänker skriva ut.
  2. Placera ett mikroskop glasskiva 25 mm x 75 mm x 1mm eller något annat substrat i skrivaren och fäst den genom att vrida på vakuum.
  3. I skrivarprogrammet ställa magnetventilen till en hög frekvens av 50 Hz och ställa in ett högt tryck av 3 bar.
  4. Skriv ett skikt av en enda rad med en scen hastighet av 300 mm / min.
  5. Trycket minskas tills den önskade linjebredden nås. Du kan även styra volymen som extruderas via öppningen för ventilen.
  6. Minska frekvensen av ventilen tills ingen kontinuerlig linje kan skrivas ut längre. Välj en frekvens över detta värde.

Anmärkning: När önskad linjebredd och kontinuerliga linjer uppnås, bestämma den optimala scenen hastighet och skikttjocklek dvs lyftet av nålen efter en tryckta skiktet.

  1. Skriv ut flera lager ovanpå varandra och se om nålen är i rätt position ovanför det föregående lagret efter flera tryckta skikt. Justera skikttjocklek (nål hiss), Så att varje lager är tryckt på toppen av nästa en (figur 3).
  2. Minska scenen hastighet av scenen från 300 mm / min stegvis så att extruderade skikt börjar och slutar på samma plats som de tidigare (Figur 4). Alltför högt stadium hastigheter orsakar scenen vara på väg innan det extruderade materialet har berört det tidigare lagret.
  3. För utskrift av pelaren strukturerna följer stegen 3.1.-3.8., Men i stället för att dra en enda linje rita en enda punkt. De parametrar att fokusera på när du skriver pelarna är trycket (reglerar skikttjocklek och pelare diameter poloxamer), öppningstiden för ventilen (extruderade volym) och uppehållstiden på skrivhuvudet vid den position där pelaren skall deponeras .
  4. När parametrarna optimeras, borde skriva flera skikt av en linje resultera i en fast vägg, eller i fråga om de punkter, en pelare. Spara parametrarna för senare användning.

Använd parametrarna finns under optimeringen proceduren från denna punkt på.

  1. Skriv ut den inre strukturen (här är det en pelare array) på ett objektglas och låt den torka över natten. Detta a) minskar storleken och tjockleken av de strukturer och b) ger bättre vidhäftning mellan strukturen och substratet, så lättning under återfyllning kan undvikas.
  2. Med CAD-program, rita en struktur som består av en yttervägg som omger konstruktionen du tänker ha elueras bort och fylld. Skriv strukturen med poloxamer. Tryckningen av väggen kommer att ta 6 min.

Observera: Väggen har som ska skrivas ut på minst 3,5 mm bort från den inre strukturen på grund av dimensionerna hos nålen. Annars tryckning av den yttre väggen kommer att förstöra den inre strukturen

  1. Bered lösningen du vill återfylla din sacrificial form med (här 1% agaros i avjoniserat vatten). Agarosen lösning bör ha en temperatur mellan 35 ° C och 45 ° C. Under denna temperatur kommer agaros stelna för snabbt; över denna temperatur, kan det förstöra tryckta pelare eftersom poloxameren strukturen kommer att mjukna.
  2. Sakta fylla den förlorade formen med återfyllning lösningen med en pipett. Detta bör göras långsamt för att undvika förstörelse av strukturen inne i väggen.
  3. Låt den återfyllda lösningen gel eller tvärbinda det beroende på den använda polymeren. I fallet med agaros stelningen ägde rum vid 4 ° C under 10 min.
  4. Placera den återfyllda sacrificial mögel i ett isbad under 10 min för att eluera poloxamer struktur.
  5. Blot återfyllda struktur med en pappersnäsduk och placera den på ett nytt glas objektglas. Tryck strukturen försiktigt på glas objektglas för att undvika läckage av den tredje hydrogelen från tomrum i utrymmet mellanden återfyllda struktur och glaset objektglas.

Fem. Fyllning av Tomrum

  1. För att fylla de tomrum som lämnats av den eluerade poloxamer, fylla den avsedda polymerlösningen i en spruta försedd med en 30 G nål. I detta exempel använde vi en 1% alginat metakrylat i 0,15 M NaCl-lösning med tillsats av 0,05% vikt / volym litium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) och 2,5% volym / volym av Alexa-488 konjugerad fibrinogen . Alexa-488 konjugerade fibrinogen tillsattes för visualisering ändamål.
  2. Fotopolymerisera polymeren med en hög intensitet UV-lampa (100 Watt, 365 nm, avstånd från substratet var 3,5 cm) under 5 min och image konstruktionen med användning av en epi-fluorescens eller konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representativa resultat visar att den omvända formen tekniken (avbildad i figur 2) kommer att skapa en strukturerad gel som kan fyllas med ett andra material. I början av varje tryckprocessen tryckerier parametrarna först optimeras. Stegvis justeringar av parametrarna kommer att resultera i tryckta flerskiktade konstruktioner som visas i figur 3 och figur 4 när enstaka linjer skrivs ut. Om skiktets tjocklek (nålen hissen efter ett tryckt skikt) är för låg, kommer man se att nålen kommer att beröra de föregående lagren. Om nålen är för hög, kommer ett vågmönster på ytan av den tryckta konstruktionen visas. Detta kan ses i figurerna 3A-3D, där alla testade skikttjocklekar var för stora för det givna stadiet hastighet. Eftersom en hög scen hastighet minskar skikttjockleken, små skillnader mellan apparaten och den faktiska tjocklek ackumuleras och vågmönster startaratt framstå som höjden av konstruktionen ökar. Genom att sänka skikttjockleken är skillnaderna blir mindre och vågmönstret uppträder vid en högre position än tidigare (anges med de streckade linjerna i figur 3C och figur 3D). För en fast skikttjocklek, om steg hastigheten är för hög kommer detta att leda antingen till ett vågmönster eller i konstruktioner som smalnar av mot toppen och har en utbuktning i början av konstruktionen (högra kanten av den tryckta strukturen) såsom visas i fig. 4A-4C. Optimerade parametrar för poloxameren var en inledande tid av 0,2 msek, en frekvens på 31.14 Hz, en tjocklek av 0,15 mm, ett tryck på 1,5 bar och en hastighet av 75 mm / min. Skriva ut med dessa parametrar resulterade i släta solida väggar som i figur 4D. Emellertid observerades en högre stadium hastighet på 100 mm / min som valts för process för att minska produktionstiden av väggarna.

Med optimerade parametrar för PIllar utskrift (öppningstid 0,2 ms, frekvens 31.14 Hz, tjocklek 0,08 mm, 1,5 bar, scen hastighet 200 mm / min, uppehållstiden 0,3 sek) vi skapat en rad pelare som visas i figur 5A. Torkning effekterna av pelaren array resulterade i böjning av pelarna mot centrum. Denna effekt kan minskas, men inte undviks, genom att placera pelarna längre isär från varandra. En vägg trycks sedan runt pelarna, såsom visas i fig. 5B.

Efter eluering av sacrificial poloxamer mögel i kallt vatten, var strukturerade agaros hydrogeler som den som visas i figur 5C skapas. Efter fyllning av hålrummen med den fluorescerande alginat metakrylat lösning och efterföljande tvärbindning, en roman hydrogel-i-hydrogel pelaren array såsom den som visas i figur 6 kan göras. Den 3D-z-stack rekonstruktion illustrerar tydligt de fluorescerande pelarna som skapades. Figur 7 strong> illustrerar möjligheten att denna teknik för att också skapa godtyckligt krökta formar.

Figur 1
Figur 1. Skildring av bioprinter. A) En bild av bioprinter "BioFactory". Nålen och ventilen är inte synliga i denna bild, men visas i B). Upp till 8 skrivhuvuden är monterade på ett roterande torn som gör att man snabbt växla mellan material. Tryckningen sker på en rörlig scen som kan flyttas i x-, y-och z-riktningen. Klicka här för att visa en större bild .

s.jpg "src =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
Figur 2. Scheme av processen för framställning av sacrificial formar för tillverkning av strukturerade hydrogeler.

Figur 3
Figur 3. Skikttjocklek optimering. Skikt Poloxamer tryckt på en fast scen hastighet (250 mm / min) med minskande tjocklek. När skikttjockleken är för hög, framträder ett vågmönster. Detta försvinner successivt med minskande tjocklek. De röda heldragna linjerna indikerar botten av den tryckta konstruktionen medan de röda streckade linjerna anger höjden av defekten fria delen av den tryckta konstruktionen. Skikttjocklekar är A) 0.18 mm, B) 0,16 mm C) 0,15 mm och D) 0,13 mm. Den röda stapeln visar 2 mm.

"> Figur 4
Figur 4. Stage hastighet optimering. Skikt Poloxamer tryckt med en skikttjocklek av 0,15 mm med olika hastigheter på steg A) 250 mm / min, B) 200 mm / min, C) 150 mm / min och D) 75 mm / min. Genom att sänka scenen hastighet, är utgångspunkten av tryckprocessen för samtliga lager densamma och en solid vägg kan skrivas ut. Den röda stapeln visar 2 mm.

Figur 5
Figur 5. Tillverkning av mönstrade hydrogeler. A) Pillar samling av torkade poloxamer med pelare separerade 1,75 mm från varandra. Böjningen av pelarna orsakas av torkning effekter.) B) Pillar array omges av en mur av poloxamer innan pipettering agaros. C Structuredagaros hydrogel efter avlägsnande av uppoffrande mögel.

Figur 6
Figur 6. 3D z-stack rekonstruktion av fluorescerande pelare inbäddade i en agaros byggnadsställning.

Figur 7
Figur 7. Koncentriska cirklar ut från poloxamer. Enkla lager är synliga. Den röda stapeln visar 2 mm.

Design kriterier Utskrift parameter
Finer skikttjocklek
  • Pressure ↓
  • Stage hastighet ↑
  • Öppettider ↓
  • Frekvens ↓
Mindre linje tjocklek
  • Pressure ↓
  • Stage hastighet ↑
  • Öppettider ↓
  • Frekvens ↓
Kontinuerlig extrudering
  • Pressure ↑
  • Stage hastighet ↓
  • Öppettider ↑
  • Frekvens ↑
Snabbare konstruktion hastighet
  • Pressure ↑
  • Stage hastighet ↑
  • Öppettider ↑
  • Frekvens ↑

Tabell 1. Fyra konstruktionsparametrar för extrudering poloxamer linjer och hur de kan påverkas av olika trycktekniker parametrar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi, för första gången, användning av en termoresponsiv polymer för en sacrificial mold som snabbt kan elueras i kallt vatten på grund av gel-sol övergång av poloxamer på ~ 20 ° C. Hastigheten av hela processen gör poloxamer intressant för att snabbt skapa biopolymera strukturer som inte kan skrivas ut med tillräcklig upplösning. Den teknik som beskrivs här kan användas för mönstring en hydrogel i en annan hydrogel eller för skapandet av mikroflödessystem kanaler som tidigare har rapporterats för andra material 35. Fördelen poloxameren som ett offer mögel är att det kan skrivas ut i godtyckliga geometrier i fasta lager-på-lager-konstruktioner som kan fyllas och elueras efteråt.

Vi beskriver här processen för att skapa en uppoffrande gjutform med poloxamer med efterföljande återfyllning av en andra hydrogel för att skapa strukturerade hydrogeler. Materialet för den strukturerade hydrogel kan vara chOsen med begränsningar i fråga om att viskositet och temperatur vid punkten för fyllning. Lågviskös prekursorlösningarna av vanliga polymerer såsom polyetylenglykoldiakrylat 36,37, alginat 38,39, agaros 40 och metakrylerade biopolymerer är 41-43 bara några exempel på lämpliga fyllnadsmaterial. Högviskösa material men inte kan fylla smala geometrier eller kan förstöra uppoffrande mögel i händelse av tunna bräckliga strukturer såsom pelarna utskrivna här. En låg andel agaroslösningen valdes därför för återfyllningen. En annan fördel med användning av agaros i kombination med poloxamer är att det geler genom kylning. Därför, när nedsänkt i kallt vatten, behåller agaros sin gelat tillstånd, ett tillstånd som väl återspeglar den omvända tryckt poloxamer mönster.

De viktiga stegen i detta förfarande innebära en optimering av utskriftsinställningarna, fyllning av uppoffrande mögel ochfyllning av håligheter. De tryckparametrar som optimerade var frekvensen och öppningstiden av ventilen, trycket, steg hastighet och skikttjockleken. Skiktet tjocklek definieras som lyftet av nålen efter varje tryckta skiktet. Vid pelarna, hemvist tiden, dvs den tid materialet extruderas på en punkt utan att flytta scenen, hade också justeras. Optimeringen processen kan vara tidskrävande eftersom förändringar i en parameter kan ha effekter på flera design parametrar extruderade linjer. De viktigaste parametrarna för olika utformning kriterier beskrivs i tabell 1.

Det andra viktiga steget i processen är att fyllningen av uppoffrande mögel. Fyllningen av den förlorade formen är en delikat steg. Små och smala strukturer behöver fyllas noggrant, ofta manuellt och enkel gjutning av lösningarna kanske inte alltid är möjligt.

Noggrann fyllning av sacrificial mögel med agaros utfördes därför med en 100 l pipett för att undvika förstörelse av pelarna. Det sista steget, fyllning av hålrummen, krävde användning av en spruta försedd med en 30 G nål. Försiktighet bör vidtas för att undvika att bubblor bildas under fyllningen.

De olika geler i konstruktionen som presenteras här kan även innehålla celler. Genom att placera en celltyp i hydrogelema inom tomrummen och annan celltyp inuti strukturerade hydrogel kan ett rumsligt definierad samodling installationen skapas. Sammanlänkat 3D nätverk som i publikationen från Miller et al. 30, vaskulära eller neurala nätverk är också möjliga. Ett möjligt tillvägagångssätt till sådana nät skulle vara att skriva ut ledningar inom en omgivande vägg och fylla hålrummen med den andra hydrogelen, tvärbinda andra hydrogelen och fortsätta med att skriva ut nästa lager roteras med 90 °. Fördelen med utskrift poloxamer som ett offer mögel är att det varken kräveren master mögel eller en mask. Det kräver inte heller ett uppvärmt skrivarhuvud att extrudera materialet och igensättning av systemet inte har observerats i våra experiment.

Konstruktionerna såsom de som presenteras här kan användas i framtiden som rumsligt organiserade 3D samkulturer att studera diffusion-baserade cell-cell interaktioner eller för läkemedelsutveckling. Men en helt automatiserad version av förfarandet presenteras här utvecklas för att bli framgångsrika inom drug screening.

Sammanfattningsvis har vi presenterat en metod som möjliggör tryckning av godtyckliga geometrier som kan fyllas med hydrogeler och eluerades efteråt. På så sätt kan strukturerade hydrogel-in-hydrogelpartiklarna arkitekturer skapas på ett enkelt och kostnadseffektivt sätt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att förklara.

Acknowledgments

Vi tackar Deborah Studer för hjälpen med bioprinter.

Arbetet har finansierats av Europeiska unionens sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal nr NMP4-SL-2009 till 229.292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics