Skrive Thermoresponsive Omvendt Former for skapelsen av Mønstret To-komponent Hydrogeler for 3D Cell Culture

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En bioprinter ble brukt til å lage mønstrede hydrogeler basert på en oppofrende mold. Poloksameren Formen ble tilbakefylt med en andre hydrogel og deretter eluert, og etterlater hulrom som var fylt med en tredje hydrogel. Denne metoden bruker raske eluering og god trykkbarhet poloxamer å generere komplekse arkitekturer fra biopolymerer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting er en ny teknologi som har sin opprinnelse i det rapid prototyping bransjen. De ulike utskrift prosesser kan deles i kontakt bioprinting 1-4 (pressbolt, dip penn og myk litografi), kontaktløs bioprinting 5-7 (laser fremover overføring, ink-jet avsetning) og laser baserte teknikker som to foton fotopolymerisasjon åtte. Den kan brukes til mange applikasjoner som tissue engineering 9-13, biosensor microfabrication 14-16 og som et verktøy for å svare på grunnleggende biologiske spørsmål som påvirkninger av co-dyrking av ulike celletyper 17. I motsetning til vanlige fotolitografiske eller soft-litografiske metoder, har ekstrudering bioprinting den fordelen at den ikke krever en egen maske eller stempel. Ved hjelp av CAD-programvare, kan utformingen av strukturen raskt endres og justeres i henhold til kravene i føreren. Dette gjør bioprinting mer fleksibel enn litografi-baserttilnærminger.

Her kan vi demonstrere utskrift av en oppofrende mugg å lage en multi-materiale 3D-struktur ved hjelp av en rekke pilarer innenfor en hydrogel som et eksempel. Disse pilarene kunne representere hule strukturer for en vaskulær nettverk eller rørene i en nerve guide kanal. Materialet valgt for offer-formen var 407 poloksamer, et thermoresponsive polymer med gode-egenskaper som er flytende ved 4 ° C og en fast over sin gelatineringstemperatur ~ 20 ° C i 24,5% w / v 18 løsninger. Denne egenskapen gjør det mulig for poloksamer-baserte offer-mugg kan elueres etter behov og har fordeler fremfor den langsomme oppløsning av et fast materiale, spesielt for smale geometrier. Poloxamer ble trykt på mikroskop glassplater å skape den oppofrende mold. Agarose ble pipetteres i formen og avkjølt før gelation. Etter eluering av poloksamer i iskaldt vann, ble hulrommene i den på agarose formen fylt med alginat-metakrylat spiked med FITC merket fibrinogen. De fylte hulrom ble deretter kryssbundet med UV og konstruere ble fotografert med en epi-fluorescens mikroskop.

Introduction

Tissue engineering tilnærminger har gjort mye fremgang over de siste årene med hensyn til regenerering av menneskelig vev og organer 19,20. Men inntil nå, har fokuset i tissue engineering vært ofte begrenset til vev som har en enkel struktur eller små dimensjoner som blæren 21,22 eller huden 23-25. Menneskekroppen inneholder imidlertid mange komplekse tredimensjonale vev hvor celler og ekstracellulær matriks er anordnet i en romlig definert måte. For fremstilling av disse vev, er en teknikk som kreves som kan plassere celler og ekstracellulær matriks stillas innenfor en tredimensjonal konstruksjon ved angitte posisjoner. Bioprinting har potensial til å være en slik teknikk der visjonen om produksjon komplekse tredimensjonale vev kan realiseres 10,11,26-28.

Bioprinting er definert som "bruk av materiale overføre prosesser for mønster og montering biologisk relvante materialer - molekyler, celler, vev og biologisk nedbrytbare biomaterialer -. med en foreskrevet organisasjon til å gjennomføre én eller flere biologiske funksjoner "4 Den omfatter flere forskjellige teknikker som fungerer på forskjellige oppløsninger og lengde skalaer, alt fra det sub-micron oppløsning på to -foton polymerisasjon 29 til en oppløsning på 150 mikrometer til 420 mikrometer for ekstrudering utskrift 1,12,30. Ikke en eneste materiale eller kombinasjonen vil tilfredsstille kravene til hver metode 31. For ekstrudering utskrift, de viktigste parametrene er viskositet og gelation tid 32, der høy viskositet og rask gelation er ønskelig.

3D-utskrift er en teknikk som gjør det mulig enkelt å lage offerplasser former for å lage komplekse geometrier 30,33,34. Denne prosessen er basert på konstruksjonen av en form ved hjelp av en hurtig prototyper teknikk slik som en ekstrudering bioprinter. Den opprettede oppofrende mold brukesfor å danne komplekse strukturer fra materialer som er vanskelige å skrive ut på grunn av deres lave viskositet og langsom gelering tid. Metoden som presenteres her, må det opprettes en offer-formen som består av et materiale som oppløses raskt ved lav temperatur og kan ekstruderes nøyaktig. Den blokk-kopolymer av poly (etylenglykol)-99-poly (propylenglykol) 67-poly (etylenglykol) 99 (også kjent som Pluronic F127 eller poloksamer 407) fyller disse krav. Det har allerede blitt brukt i en modifisert versjon i ekstrudering utskrift 1, men til vår kunnskap, har aldri vært brukt for utskrift i sin umodifiserte versjonen på grunn av sin ustabilitet i flytende miljøer. Poloxamer 407 viser også en invers termisk responsive atferd 18 dvs. den endres fra en gel til en sol ved avkjøling. Viktigst, kan det bli skrevet inn i komplekse vilkårlig buede strukturer med svært høy nøyaktighet. Dette tillater etablering av et strukturert hydrogel fra enlav viskositet, og i dette tilfelle langsom geldannende agarose, ved å pipettere løsningen i den trykte offer-mugg. Kombinasjonen av å trykke den offer-formen med høy nøyaktighet og dens raske eluering fra den støpte strukturert hydrogel gjør det til en rask og fleksibel metode for å lage støpeformer med forskjellige geometrier uten bruk av en maske eller et stempel som det ofte kreves i litografiske metoder. Den støpte strukturert hydrogel kan videre fylt med et annet materiale som ikke er egnet for ekstrudering trykking på grunn av sin lave viskositet. Dette er i vårt tilfelle en lav viskositet alginat methacrylate løsning. Her presenterer vi metoden for thermoresponsive omvendt offerplasser støpeformer for hydrogel mønster ved hjelp av eksempel på en søyle array.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Fremstilling av Poloxamer 407 Løsning

Hvis tilgjengelig, utfører fremstillingen av poloksameren løsning i et kaldt rom (4 ° C). Hvis ikke tilgjengelig, plasserer en glass flaske i et beger fylt med iskaldt vann. Ved høyere temperaturer vil poloksameren være over gelen punkt og vil ikke oppløses ordentlig.

  1. Legg 60 ml iskald PBS-løsning inn i en glassflaske og rør kraftig ved hjelp av en magnetisk rører.
  2. Veie 24,5 gram poloxamer og legge den i små mengder til den kalde PBS. Vent til poloksameren har delvis oppløst før du legger mer.
  3. Omrør løsningen inntil alt poloksameren er oppløst.
  4. Legg kald PBS til et sluttvolum på 100 ml er oppnådd. Den endelige konsentrasjonen vil være 24,5% w / v.
  5. Stopp omrøring av oppløsningen og la den hvile ved 4 ° C inntil bobler og skum i oppløsningen er forsvunnet. Bobler som er fanget innenfor den gel vil bli overført til printer patron og vil føre til feil i den trykte offerplasser muggsopp.
  6. Filter (0,22 um filter) oppløsningen direkte inn i trykk patronen for å fjerne uønskede partikler som kan tette kanylen. Filtreringen trinnet bør utføres i et kaldt rom (eller hvis de ikke ligger med avkjølte tips, filter etc.) for å unngå geldannelse av poloksameren i filteret. Hold den lastede kassetten ved 4 ° C inntil 30 min før forsøket.

2. Utarbeidelse av 3D-skriver

3D-skriveren som brukes i dette arbeidet var "BioFactory" fra regenHU. Den ekstruderte del av systemet består av flere deler. En patron under trykk på toppen er festet til en kopling via en luer-lock-adapter. Koplingsstykket broer mellomrommene mellom utløpet av patronen og innløpet av en magnetventil. Ved utløpet fra magnetventilen, kan nåler med forskjellig diameter skal brukes. Materialet er ekstruderes på et subStrate som holdes til et bevegelig stadium ved hjelp av vakuum. De viktigste deler av systemet er vist i figur 1. Andre ekstruderte baserte systemer kan brukes for trykkeprosessen, og optimaliseringsprosessen må gjøres for hvert system.

  1. Plasser magnetventil (dyse diameter 0,3 mm) og nålen (indre diameter 0,15 mm) i separate 1,5 ml reagensglass fylt med ultrarent vann og legg dem i en oppvarmet ultralydbad å rydde i 30 min. Skyll de rensede ventiler med etanol og tørker dem med en nitrogen-pistol.
  2. Monter ventilen og nål i skriveren, samt en tom, ren patron.
  3. Påfør 3 bar trykk til systemet og blåse ut eventuelle gjenværende væske fra det installerte ventil og nål med trykkluft. For små nål diametre, er det anbefalt å ha et filter (vanlig sprøyte filter, 0,45 mikrometer porestørrelse) som er installert ved utkjørselen av den komprimerte luft for å unngå inntreden av små partikler som kan tette kanylen. Slå trykket av og installere kassetten lastet med poloksameren. Kassetten bør tas ut av kjøleskapet ca 30 min før du monterer kassetten slik poloksameren kan nå romtemperatur og gel.
  4. Påfør 3 bar trykk til systemet og dispensere poloksameren inntil den når nålespissen og ekstruderes i en kontinuerlig streng.

3. Optimalisering av utskrift parametere

For å lage nøyaktige 3D-strukturer, har trykkeprosessen å være optimalisert for det valgte materialet og konsentrasjon. Avhengig av viskositeten, og 3D-skriversystemet hvert materiale vil gi en spesifikk dispensering volum og linjetykkelse til et fast sett med parametere.

  1. Med en passende CAD-programvare (i stand til å lage ISO-filer fra tegningene), tegne en linje omtrent samme lengde som den strukturen som du har tenkt å skrive ut.
  2. Plasser et mikroskop glass lysbilde 25 mm x 75 mm x 1mm eller andre underlag i skriveren, og fest det ved å vri på vakuum.
  3. I skriverprogramvaren, setter magnetventil til en høy frekvens på 50 Hz og satt et høyt trykk på 3 bar.
  4. Skriv ut ett lag med en enkelt linje med en scene hastighet på 300 mm / min.
  5. Reduser trykket til den ønskede linje bredde er nådd. Du kan også kontrollere volumet som ekstruderes gjennom åpningen tid av ventilen.
  6. Redusere hyppigheten av ventilen, til noen kontinuerlig linje skrives lenger. Velg en frekvens over denne verdien.

Merk: Når ønsket linje bredde og sammenhengende linjer er oppnådd, bestemme optimal scenen hastighet og tykkelse dvs. løft på nålen etter en trykt lag.

  1. Ut flere lag på toppen av hverandre og se om nålen er i riktig posisjon over det foregående lag etter flere trykte lag. Juster tykkelsen (nål lift), Slik at hvert lag er trykket på toppen av den neste (figur 3).
  2. Reduser hastighet stadium av scenen fra 300 mm / min trinnvis slik at ekstruderte lag begynner og slutter ved de samme posisjonene som de forrige (figur 4). For høye scenen hastigheter føre til scenen for å være i bevegelse før det ekstruderte materialet har berørt forrige lag.
  3. For utskrift av pilar strukturer følg trinn 3.1.-3.8., Men i stedet for å tegne en linje tegne et enkelt punkt. Parametrene for å fokusere på når du skriver ut pilarene er trykket (regulerer tykkelsen og pilar diameter på poloxamer), den åpningstid av ventilen (ekstrudert volum) og oppholdstid av skrivehodet ved posisjonen der søylen skal deponeres .
  4. Når parameterne er optimert, bør ut flere lag av en linje resultere i en fast vegg, eller i tilfelle av punktene, en søyle. Lagre parameterne for senere bruk.

Bruk parametrene funnet under optimalisering prosedyren fra dette punktet.

  1. Skriv ut den indre struktur (her er det en søyle array) på et glass objektglass og la det tørke over natten. Dette a) reduserer størrelsen og tykkelsen av strukturene og b) gir bedre adhesjon mellom strukturen og substratet, slik at løfte-av under tilbakefylling kan unngås.
  2. Med CAD-programvare, tegne en struktur som består av en ytre muren rundt den strukturen du har tenkt å ha elueres bort og fylt. Skriv ut strukturen med poloxamer. Utskriften av veggen vil ta 6 min.

NB: Veggen har det skal skrives på minst 3,5 mm fra den indre struktur på grunn av dimensjonene av kanylen. Ellers trykking av den ytre veggen vil ødelegge den indre struktur

  1. Tilbered oppløsningen du ønsker å etterfylle din sacrificial formen med (her 1% agarose i avionisert vann). Agarose løsningen bør ha en temperatur mellom 35 ° C og 45 ° C. Under denne temperatur, vil agarosen stivner for raskt, over denne temperatur, kan det ødelegge de trykte søyler fordi poloksameren struktur vil mykne.
  2. Sakte fylle oppofrende mold med tilbakefylling løsning ved hjelp av en pipette. Dette bør skje langsomt for å unngå ødeleggelse av strukturen inne i veggen.
  3. La omfylte løsning gel eller tverrbinde den avhengig av polymer som anvendes. I tilfelle av agarose størkning fant sted ved 4 ° C i 10 min.
  4. Plasser omfylte offer-mugg i et isbad i 10 min for å eluere poloksamer struktur.
  5. Blot backfilled struktur med et papirlommetørkle og plassere den på et nytt glass objektglass. Trykk strukturen forsiktig inn på glass objektglass for å unngå lekkasje av det tredje hydrogelen fra tomrommet inn i rommet mellomden omfylte struktur og glasset objektglass.

5. Fylling av hulrommene

  1. For å fylle tomrom igjen av den eluerte poloksamer, fylle den tilsiktede polymer-løsning i en sprøyte utstyrt med en 30 G nål. I dette eksemplet er det benyttet en 1% alginat metakrylat i 0,15 M NaCl-oppløsning med tilsetning av 0,05% w / v litium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) og 2,5% v / v av Alexa 488-konjugert fibrinogen . Alexa-488 konjugert fibrinogen ble lagt for visualisering formål.
  2. Photopolymerize polymer med en høy intensitet UV-lampe (100 watt, 365 nm, avstand fra substratet var 3,5 cm) i 5 min og avbilde konstruere ved hjelp av et epi-fluorescens eller konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De representative resultater viser at den omvendte formen teknikk (vist i figur 2) vil skape en strukturert gel som kan fylles med et andre materiale. I begynnelsen av hver utskrift utskrift parametrene er første optimalisert. Trinnvis justering av parametrene vil resultere i flerlags trykte konstrukter som er avbildet i figur 3 og figur 4 når enkeltbundet linjer skrives. Om lagenes tykkelse (nålen løft etter en trykt lag) er for lav, vil man observere at nålen vil berøre de foregående lag. Hvis nålen er for høy, vil en bølge mønster på overflaten av det trykte konstrukt vises. Dette kan sees i figurene 3A-3D, hvor alle testede sjikttykkelse var for store for den gitte fasen hastighet. Fordi en høy stadium hastighet reduserer lagtykkelse, små forskjeller mellom den og den aktuelle lagtykkelse akkumuleres og bølge-mønster begynnerå fremstå som høyden av konstruksjonen øker. Ved å redusere lagtykkelsen, forskjellene blir mindre og den bølgemønsteret forekommer i en høyere posisjon enn før (angitt med de stiplede linjer på figur 3C og figur 3D). For en fast lagtykkelse, hvis fase er for rask vil dette resultere enten i et bølgemønster eller i konstruksjoner som smal seg mot overflaten og har en bule i begynnelsen av konstruktet (høyre kant av det trykte struktur) som vist i Tall 4A-4C. Optimaliserte parametere for poloksameren var en åpningstid på 0,2 msek, en frekvens på 31,14 Hz, en tykkelse på 0,15 mm, et trykk på 1,5 bar og en hastighet på 75 mm / min. Trykking med disse parametrene ført glatte solide vegger som i figur 4D. Imidlertid ble en høyere stadium hastighet på 100 mm / min valgt for prosessen for å redusere produksjonstid på veggene.

Med optimaliserte parametere for pillar utskrift (åpningstid 0,2 ms, frekvens 31.14 Hz, tykkelse 0,08 mm, 1,5 bar, scene 200 hastighet mm / min, bosted 0,3 time sek) vi skapt en rekke søyler som vist i figur 5A. Tørking effekter av søylen matrise resulterte i bøying av søylene mot sentrum. Denne effekten kan reduseres, men ikke unngås, ved å plassere søylene lenger fra hverandre. En vegg som så trykkes rundt søylene som vist i figur 5B.

Etter eluering av offer-poloksamer mugg i kaldt vann, ble det strukturerte agarose hydrogeler som den som er vist i figur 5C opprettet. Etter å fylle hulrommene med det fluorescerende alginat metakrylat-løsning og påfølgende tverrbinding, en roman hydrogeldannende in-hydrogelen søyle matrise slik som den som er vist i figur 6 kan foretas. 3D-z-stack gjenoppbygging illustrerer tydelig de fluorescerende pilarer som ble opprettet. Figur 7 sterk> illustrerer muligheten for denne teknikk også oppretter vilkårlig krummede former.

Figur 1
Figur 1. Skildring av bioprinter. A) Et bilde av bioprinter "BioFactory". Nålen og ventilen er ikke synlig i dette bildet, men er avbildet i B). Opptil 8 skrivehoder er montert på et vendepunkt turret som tillater en å raskt bytte mellom materialer. Trykkeriet er gjort på et bevegelig scene som kan flyttes i x-, y-og z-retning. Klikk her for å se større figur .

s.jpg "src =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
Figur 2. Reaksjonsskjema av prosessen med fremstilling av offer-støpeformer for fremstilling av strukturerte hydrogeler.

Figur 3
Figur 3. Lagtykkelse optimalisering. Poloxamer lag trykte på en fast scene hastighet (250 mm / min) med avtagende tykkelse. Når lagenes tykkelse er for høyt, oppstår et bølgemønster. Dette forsvinner gradvis med avtagende tykkelse. De røde heltrukne linjene viser undersiden av det trykte konstruktet mens de røde stiplete linjer angir høyden av defekten fri del av det trykte konstruktet. Sjikttykkelse er A) 0,18 mm, B) 0,16 mm C) 0,15 mm, og D) 0,13 mm. Den røde linjen viser 2 mm.

"> Figur 4
Figur 4. Trinn Kjørehastighetsoptimering. Poloksamer lag trykket med en tykkelse på 0,15 mm med forskjellige hastigheter på trinn A) 250 mm / min, B) 200 mm / min, c) 150 mm / min og D) 75 mm / min. Ved å senke scenen hastighet, er utgangspunktet for trykkeprosessen for alle lag det samme og en solid vegg kan skrives ut. Den røde linjen viser 2 mm.

Figur 5
Figur 5. Produksjon av mønstrede hydrogeler. A) Pillar utvalg av tørket poloksameren med søyler separert 1.75 mm fra hverandre. Bøyningen av søylene er forårsaket ved tørking effekter. B) Pillar matrise omsluttet av en vegg laget av poloksameren før pipettering agarose. C) Strukturertagarose hydrogelen etter fjerning av offer-mugg.

Figur 6
Figur 6. 3D z-stack rekonstruksjon av fluorescensmerkede søyler innebygd i en agarose stillaset.

Figur 7
Figur 7. Konsentriske sirkler skrives ut fra poloxamer. Enkelt lag er synlige. Den røde linjen viser 2 mm.

Prosjekteringskriterier Utskrift parameter
Finer tykkelse
  • Pressure ↓
  • Stage hastighet ↑
  • Åpningstid ↓
  • Frekvens ↓
Mindre senetykkelse
  • Pressure ↓
  • Stage hastighet ↑
  • Åpningstid ↓
  • Frekvens ↓
Kontinuerlig ekstrudering
  • Trykk ↑
  • Stage hastighet ↓
  • Åpningstid ↑
  • Frekvens ↑
Raskere bygging hastighet
  • Trykk ↑
  • Stage hastighet ↑
  • Åpningstid ↑
  • Frekvens ↑

Tabell 1. Fire design parametere for ekstrudering av Poloxamer linjer og hvordan de kan påvirkes av ulike utskrift parametere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer, for første gang, ved bruk av en thermoresponsive polymer for en offer-mugg som raskt kan elueres i kaldt vann på grunn av gel-sol overgang av poloksamer på ~ 20 ° C. Hastigheten på hele prosessen gjør poloksameren interessant for den raske etableringen av biopolymer strukturer som ikke kan skrives ut med tilstrekkelig oppløsning. Teknikken er beskrevet her kan brukes til mønster en hydrogel innen en annen hydrogel eller for etablering av microfluidic kanaler som tidligere er rapportert for andre materialer 35. Fordelen med poloksameren som en offer-formen er at den kan trykkes i vilkårlige geometrier til fast lag-for-lag-konstruksjoner som kan fylles og eluert etterpå.

Vi beskriver her prosessen med å lage en oppofrende mold med poloksameren med påfølgende tilbakefylling av et sekund hydrogel å skape strukturerte hydrogeler. Materialet for det strukturerte hydrogel kan være chOsen med restriksjoner i forhold til viskositet og temperatur på det punktet av fylling. Lave viskøse forløper løsninger på vanlige polymerer som polyetylenglykol 36,37 diakrylat, alginat 38,39, agarose 40 og Methacrylated biopolymerer 41-43 er bare noen få eksempler på egnede fyllingsmaterialer. Høye viskøse materialer derimot ikke kan fylle smale geometrier eller kunne ødelegge oppofrende mold i tilfelle tynne skjøre strukturer som søyler skrives her. En lav prosentandel agarose Løsningen ble derfor valgt for tilbakefylling. En annen fordel med å bruke agarose i kombinasjon med poloksamer er at den geler ved avkjøling. Derfor, når nedsenket i kaldt vann, beholder agarose sin gelled stat, en stat som nøyaktig gjenspeiler den inverse trykt poloksameren mønster.

De viktigste trinnene i denne fremgangsmåten innebære optimalisering av utskrift parametere, fylling av oppofrende mold ogfylling av hulrommene. Trykke-parametrene som ble optimalisert var frekvensen og åpningstid av ventilen, trykket, trinn hastighet og lagtykkelsen. Lagenes tykkelse er definert som heisen av nålen etter hvert trykte lag. I tilfelle av pilarene, bosted tid, dvs. tiden materialet er ekstrudert på et punkt uten å flytte scenen, hadde også justeres. Optimaliseringsprosessen kan være tidkrevende fordi endringer i en parameter kan ha effekter på flere design parametere av de ekstruderte linjer. De viktigste parametrene for ulike design kriterier er beskrevet i Tabell 1.

Det andre viktige trinn i prosessen er fyllingen av offer-mugg. Fylling av oppofrende mold er en delikat trinn. Små og smale strukturer må fylles nøye, ofte manuelt, og enkel støping av løsningene kanskje ikke alltid være mulig.

Nøye fylling av sacrificial formen med agarose ble derfor utført ved hjelp av en 100 mL pipette for å unngå ødeleggelse av pilarene. Det siste trinnet, fylling av hulrommene, kreves bruk av en sprøyte utstyrt med en 30 G nål. Forsiktighet bør utvises for å unngå bobledannelse under fylling.

De forskjellige geler i konstruktet som presenteres her, kan også inneholde celler. Ved å plassere en celletype i hydrogelene innenfor hulrom og en annen celletype inne i strukturert hydrogel, kan en romlig definert co-kultur oppsett bli opprettet. Interconnected 3D nettverk som i publikasjonen fra Miller et al. 30., vaskulære eller nevrale nettverk er også mulig. En mulig tilnærming til slike nettverk ville være å trykke linjer innenfor en omgivende vegg og fylle hulrommene med det andre hydrogel, kryssbindende den andre hydrogel og fortsette med å skrive det neste laget rotert ved 90 °. Fordelen med trykking poloksamer som en offer-formen er at den hverken kreveren master mold eller en maske. Det heller ikke kreve et oppvarmet skrivehodet for å ekstrudere materialet og tilstopping av systemet har ikke blitt observert i våre forsøk.

Konstruerer for eksempel de som presenteres her kan bli brukt i fremtiden som romlig organisert 3D co-kulturer å studere diffusjon-baserte celle-celle interaksjoner eller for drug discovery. Imidlertid må en helautomatisk versjon av prosedyren presentert her for å bli utviklet for å bli vellykket innen legemiddel-screening.

For å oppsummere, har vi presentert en metode som tillater trykking av vilkårlige geometrier som kan fylles med hydrogeler og eluert etterpå. På den måten kan strukturerte hydrogel-in-hydrogel arkitekturer lages på en enkel og kostnadseffektiv måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å fortolle.

Acknowledgments

Vi takker Deborah Studer for hjelp med bioprinter.

Arbeidet ble finansiert av EU Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) i henhold til stipend avtale n ° NMP4-SL-2009-229292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics