Biossensores raciométrica que medem estado redox mitocondrial e ATP em células vivas de levedura

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Bioengineering

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Summary

Descreve-se a utilização de dois raciométrica, biossensores codificados geneticamente, que são baseados em GFP, para monitorar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP na resolução subcelular em células vivas.

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Vevea, J. D., Alessi Wolken, D. M., Swayne, T. C., White, A. B., Pon, L. A. Ratiometric Biosensors that Measure Mitochondrial Redox State and ATP in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (77), e50633, doi:10.3791/50633 (2013).

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Abstract

As mitocôndrias têm um papel em muitos processos celulares, a partir do metabolismo da energia e homeostase do cálcio para controlar o tempo de vida de celular e morte celular programada. Esses processos afetam e são afetados pelo estado redox e de produção de ATP pela mitocôndria. Aqui, descrevemos o uso de dois, biossensores geneticamente codificados raciométrica que podem detectar estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em resolução subcelular em células de levedura viva. Estado redox mitocondrial é medida usando Proteína Fluorescente Verde redox-sensível (roGFP) que é direcionado para a matriz mitocondrial. Mito-roGFP contém cisteínas nas posições 147 e 204 da GFP, que sofrem oxidação e redução reversível e dependente do ambiente, que por sua vez altera o espectro de excitação da proteína. MitGO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância Förster (FRET) sonda em que a subunidade ε da F o F 1 ATP sintase é imprensada entre FRET doador e receptor fluoproteínas rescent. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador e aceitador de FRET em estreita proximidade e permitir a transferência de energia de ressonância de fluorescência do dador ao receptor.

Introduction

As mitocôndrias são organelos essenciais para a produção de ATP, a biossíntese de aminoácidos, ácidos gordos, heme, aglomerados de enxofre do ferro e pirimidinas. As mitocôndrias também desempenham um papel fundamental na homeostase do cálcio e na regulação da apoptose. Uma crescente evidência de ligações mitocôndrias ao envelhecimento e doenças relacionadas à idade, incluindo a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e doença de Huntington. 2 Enquanto as pessoas vivem suas vidas inteiras com mutações em proteínas mitocondriais que estão associadas a doenças neurodegenerativas, os sintomas da doença ocorrerem apenas mais tarde na vida. Isto indica que as mudanças ocorrem nas mitocôndrias com a idade, que permitem a patologia a emergir. De fato, aptidão mitocondrial está relacionada com a saúde geral e longevidade celular em leveduras e células de mamíferos 3,4 Aqui., Descrevemos como usar geneticamente codificados, biossensores fluorescentes raciométrica para avaliar dois aspectos críticos do mitochondria em células de levedura viva: o estado redox e os níveis de ATP.

Função mitocondrial na mobilização de energia aeróbica está bem estabelecida. Estado redox mitocondrial é um produto da redução e espécies oxidantes na organela, inclusive NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, glutationa / glutationa oxidada (GSH / GSSG) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Desacoplamento mitocondrial ou hipóxia afeta a atividade respiratória mitocondrial e altera a relação de NAD + para NADH na organela. ROS, que são produzidos a partir de transferência de electrões entre ineficiente complexos da cadeia de transporte de electrões na membrana mitocondrial interna, bem como a partir da desaminação de aminas através da monoamina oxidase na membrana mitocondrial externa 5, lípidos, proteínas, danos e ácidos nucleicos e têm foi associada ao envelhecimento e as doenças neurodegenerativas associadas à idade 6,7,8. ROS também desempenhar um papel na transdução de sinal em mitochondria, através da oxidação de GSH. Por exemplo, NADH desidrogenase não só contribui para a produção de ROS, mas também é regulada através de interações com o pool de glutationa 9,10. desidrogenase α-cetoglutarato e aconitase, componentes do ciclo do TCA, exibem uma actividade reduzida em ambientes oxidantes 11,12.

Na verdade, a regulação redox dependente da atividade aconitase é conservada de bactérias a mamíferos 13,14. Assim, o monitoramento do estado redox e os níveis de ATP das mitocôndrias é crucial para entender sua função e papel na patologia da doença.

Métodos bioquímicos têm sido usados ​​para avaliar o estado redox, ou os níveis de ATP de células inteiras ou mitocôndrias isoladas. Métodos amplamente utilizadas para avaliar o estado redox de células inteiras ou mitocôndrias isoladas são baseadas na medição dos níveis do par redox de GSH / GSSG 15. O sistema luciferina-luciferase é comumente usado para medir mitocondrialEm ambos os níveis de ATP de células inteiras permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. 16,17,18,19,20 Neste ensaio, liga-se a luciferase de ATP e catalisa a oxidação da luciferina e de quimioluminescência. 21 A intensidade da luz emitida é proporcional à quantidade de ATP na mistura reaccional 22.

Estes métodos têm revelado informação fundamental em relação a função mitocondrial, incluindo a descoberta de que os pacientes com doenças neurodegenerativas, tais como doença de Alzheimer, têm níveis anormalmente baixos de ATP 23. No entanto, eles não podem ser utilizados para a imagem de vida, as células intactas. Além disso, os métodos baseados na análise de célula completa fornecer uma média de estado redox, ou os níveis de ATP em todos os compartimentos da célula. Medidas em organelas isoladas são potencialmente problemático porque o estado redox mitocondrial ou níveis de ATP podem mudar durante o fracionamento subcelular. Finalmente, estudos recentes do nosso laboratório e outros indicam quemitocôndrias dentro das células individuais são heterogêneos em função, que por sua vez afeta a vida útil das células-mãe e filha. 3 Assim, há uma necessidade de medir os níveis de ATP mitocondrial e estado redox em células vivas com resolução subcelular.

Os biossensores para a função mitocondrial descrita aqui são ambos baseados em boas práticas agrícolas. GFP Redox-sensível (roGFP) 24,25 é uma variante da GFP em que superfície expostas cisteínas são adicionados à molécula. roGFP, como a GFP do tipo selvagem, que apresenta dois picos de excitação (em ~ 400 nm e ~ 480 nm) e um pico de emissão a 510 nm ~. A oxidação dos resíduos de cisteína em roGFP resulta em um aumento na absorção a 400 nm, ~. Redução dos cisteínas favorece excitação a 480 nm, ~. Assim, a razão de emissão de 510 nm após excitação de roGFP em 480 nm e 400 nm, revela a quantidade relativa de roGFP reduzida e oxidada, o que reflecte o estado redox do meio ambiente do fluoróforo.

Duas versiões de roGFP são amplamente utilizados: roGFP1 e roGFP2. Ambos contêm as mesmas inserções de cisteína. roGFP1 baseia-se na GFP do tipo selvagem e roGFP2 baseia-S65T GFP, que tem mais eficiente excitação a 480 nm e menos eficiente de excitação a 400 nm em comparação com wtGFP 24. roGFP1 é menos sensível do que o pH roGFP2 e a sua gama dinâmica estende ainda mais para o intervalo reduzido. Assim, roGFP1 pode ser mais útil para o monitoramento mais reduzindo compartimentos tais como mitocôndrias ou citosol, e compartimentos com pH variável, como endossomos. roGFP2 oferece sinal brilhante e, em alguns estudos, uma maior gama dinâmica do que roGFP1 24,26. Estudos em Arabidopsis thaliana indicam que o tempo necessário para responder a alterações no estado redox é similar para ambos os sensores (t ½ para oxidação, 65 e 95 s e t ½ para redução, 272 e 206 segundos, o que roGFP1 e roGFP2, respectivamente) 26.

MitGO-ATeam2 é minimamente invasivo, confiávelsensor que mede ATP mitocondrial no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam é uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) de sonda, que consiste na subunidade da ε o F F 1-ATP sintase ensanduichada entre dador FRET e proteínas aceitadoras fluorescentes GFP (proteína fluorescente e laranja (OFP), respectivamente), 27. A ligação de ATP para as subunidades ε resulta em mudanças de conformação na proteína que trazem o dador FRET em estreita proximidade com o receptor e para permitir a transferência de energia entre o dador eo aceitador. Existem duas variantes da GO-ATeam, GO-ATeam1 e GO-ATeam2. GO-ATeam2 tem uma maior afinidade para MgATP que GO-ATeam1, tornando-o mais adequado para medir o tipicamente inferior [ATP], em comparação com as mitocôndrias do citosol 27.

Para sondar estado redox mitocondrial, construiu-se uma proteína de fusão (mito-roGFP1) consistindo de roGFP1 fundido com a sequência líder de um ATP9nd expresso a partir de um centrómero baseado (baixo número de cópias) o plasmídeo de expressão de levedura sob o controlo do forte desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Usamos roGFP1 para sondar o estado redox de mitocôndrias no contexto do envelhecimento do modelo fungo Saccharomyces cerevisiae. Descobrimos que roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial que ocorrem durante o envelhecimento e em resposta a disponibilidade de nutrientes, mas não tem nenhum efeito prejudicial aparente em células de levedura. Vemos também a variabilidade no estado redox de mitocôndrias nas células de leveduras vivas individuais, o que reafirma a importância de um biosensor com resolução espacial subcelular.

MitGO-ATeam2 é uma variante da GO-ATeam2, que tem a sequência de sinal mitocondrial do citocromo c oxidase subunidade VIII inserido no terminal amino da GO-ATeam2 27. Nós modificamos o mitGO-ATeam2 sonda (gentilmente cedido pelo laboratório de H. Noji, o Institutof Scientific e Industrial Research, Universidade de Osaka, Japão), para utilização em levedura por subclonagem-lo, através de Xba1 e locais HindIII, no vector de expressão de levedura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EUA), que é um plasmídeo de cópia de baixa contendo o promotor GPD constitutivo forte. Expressamos mitGO-ATeam2 em levedura de brotamento, e encontrar, pela coloração de contraste com o DNA-binding corante DAPI, que localiza exclusivamente para a mitocôndria, onde ele serve como uma sonda eficaz para medir as mudanças fisiológicas em níveis de ATP mitocondrial.

roGFP e GO-ATeam ambos são geneticamente codificado. Como resultado, eles podem ser introduzidos e mantidos de forma estável em células intactas, e fornecem informações sobre o estado redox, ou os níveis de ATP, em células vivas individuais. Além disso, ambos os biossensores monitorar as alterações no estado redox ou níveis de ATP que ocorrem sob condições fisiológicas. 28 Ambas as sondas são também raciométrica. Como resultado, as medições feitas com estes testes não são afetados por changes na concentração biosensor ou iluminação da amostra ou espessura. Finalmente, ambos os biossensores fornecer resolução espacial subcelular. Com efeito, roGFP foi orientada de mitocôndrias, ER, endossomas e peroxissomas 24, e pode detectar alterações no estado redox de cada um destes organelos, em grande parte independentes do pH.

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Protocol

1. Transformação de células de levedura com o Biossensores

  1. Transformar a estirpe de levedura com o plasmídeo desejado Mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 usando o método do acetato de lítio 27.
  2. Para confirmar a transformação com o plasmídeo de biossensor de origem e para evitar a perda do plasmídeo, seleccionar e manter os transformantes no meio completo sintético selectivo apropriado (SC-Ura para Mito-roGFP, ou SC-Leu por mitGo-ATeam2). Se a sonda fluorescente foi subclonado num plasmídeo diferente do que os descritos aqui, o uso do meio selectivo apropriado. Visualiza transformantes por microscopia de fluorescência para confirmar que elas expressam o biossensor fluorescente e exibem morfologia mitocondrial normal.

2. Crescimento das células e preparação para a imagem

A função celular e da resposta ao tratamento com medicamentos são altamente dependentes da densidade da célula e actividade metabólica. Os melhores resultados são obtidos quando as célulasestão dividindo activamente (fase mid-log, ~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). A maneira mais fiável para gerar culturas de densidade consistente de fase mid-log é para inocular de uma pré-cultura em fase estacionária.

  1. Prepare uma pré-cultura estacionária-fase: escolher uma única colônia de células transformadas a partir de uma placa e inocular meios líquidos seletivos (5 ml em um tubo de 50 ml cônico-bottom). Crescer a 30 ° C com agitação a 225 rpm até a densidade óptica da cultura a 600 nm (OD 600) atingiu um patamar (24-48 h).
  2. Prepare uma cultura fase mid-log para a observação: use o volume adequado de pré-cultura para inocular 5 ml de meios seletivos em um tubo de 50 ml cônico-bottom. Meios YPD é autofluorescente e não devem ser utilizados para estes estudos. Use, glicose base, abandono (SC-Ura) media completos sintéticos. Crescer as células a 30 ° C, agitação a 225 rpm, durante 4-16 horas, até que eles atinjam fase mid-log (~ 0,5-1 x 10 7 células / ml). A densidade celular pode ser determinadamedindo a OD 600; calibrar o espectrofotómetro para determinar a leitura de OD 600 correcto. No nosso Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), a fase semi-log corresponde a uma DO 600 de 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 detecta flutuações no organelo em resposta a alterações metabólicas. Por exemplo, neste ensaio mitocondriais alterações de estado redox quando a levedura crescer em fontes de carbono fermentável (por exemplo, glucose, como em meio SC) em função das fontes de carbono não fermentáveis ​​(por exemplo, glicerol, tal como em meios SGlyc), e mesmo em diferentes lotes da mesma mídia. Consequentemente, a utilização do mesmo lote de meios para todas as experiências.

  1. Células estão prontas para a concentração (veja o passo 2.4) e imagem se nenhum tratamento está sendo realizado. Se as células estão a ser tratados, incubar as células com o tratamento adequado e continuar para a próxima etapa.
  2. Concentre-se 1 ml de cultura por centrifugação a 6000 xg durante 15 seg eressuspensão do sedimento celular em 20 ul de meio. Estas condições de maximizar o número de células distintas no campo de visão.
  3. Aplicar 2 ul das células ressuspensas para uma lâmina. Cobrir com uma lamela (n º 1.5, de preferência de alto desempenho 170 ± 5 m de espessura) e selar as bordas da lamínula com claro unha polonês ou valap (ver Reagentes). Para selar com valap, derreter uma pequena quantidade de uma espátula de metal, mantendo-a sobre uma chama de bico de Bunsen, em seguida, espalhar uma pequena quantidade ao longo das arestas da lamela.
  4. Manter as células a 30 ° C durante a imagiologia. Um aquecedor objectiva sobre a lente de imersão em óleo 100x usado para geração de imagens funciona bem para esta aplicação. Sob estas condições, a morfologia mitocondrial, estado redox, e os níveis de ATP permanecem inalterados durante a imagem durante 10-15 min.

3. Configuração de imagem

  1. Configuração para imagens mito-roGFP1 em um microscópio de fluorescência de campo amplo
    Os passos aqui são adaptados para o AxioObserver.Z1 microscópio equipado com um LED fonte de excitação Colibri, um amplo campo de Orca ER câmera e software de aquisição Axiovision. Fotodegradação dos dois canais e fotoconversão de oxidados mito-roGFP1 é significativamente reduzido com uma iluminação LED em comparação com arco iluminação da lâmpada de mercúrio (veja abaixo).
    Para maximizar o sinal e resolução, usar a maior abertura numérica possível no objetivo, eo menor ampliação que fornece resolução espacial suficiente. Além disso, para imagiologia de mito-roGFP, verificar que o objectivo transmite bem a 365 nm. O 100x/1.3NA PlanNeofluar objetivo CE (Zeiss) funciona bem para esta aplicação.
    Configure o software de aquisição para capturar as espécies mito-roGFP1 oxidadas e reduzidas. Usamos as seguintes condições.
    1. Configure o canal de oxidado mito-roGFP usar excitação em 365 nm (100% LED de alimentação) e um filtro de emissão adequada para GFP, como o 38 HE filtrar set (Zeiss), com o excitatio incluídon filtro removido do cubo. A remoção do filtro de excitação permite excitação a 365 nm, ambas e 470 nm, sem a necessidade de mudar os filtros, aumentando assim a resolução de tempo possível.
    2. Configurar o canal para a redução de mito-roGFP utilizar a excitação a 470 nm (100% da potência do LED) e, como mencionado acima, o mesmo cubo de filtro de emissão usado para a oxidação de mito-roGFP. Defina a câmara para 1x1 binning para otimizar resolução espacial.
    3. Definir software para adquirir pilha az composto por 11 fatias com 0,5 mM espaçamento, coletando os dois canais em cada posição z. Este modo de aquisição é mais lenta do que a aquisição de cada pilha por sua vez, z, mas evita que o movimento de artefactos decorrentes mitocondrial entre a aquisição dos canais oxidados e reduzidos.
    4. Imagem de várias células para determinar um tempo de exposição apropriado, produzindo um sinal forte, mas não de saturação. É importante manter a relação dos tempos de exposição para oxidada e reduzida de mito-roGFP1 para todos experimentos. Por exemplo, se os tempos de exposição para oxidada e reduzida de mito-roGFP1 são de 300 e 100 ms, respectivamente, então o tempo de exposição para oxidada Mito-roGFP1 deve ser de 3 vezes maior que para a redução de mito-roGFP para todas as experiências.
  2. Configuração para imagens mitGO-ATeam2 em um microscópio confocal espectral
    Para quantificar os níveis de ATP, utilizando mitGO-ATeam2, a fluorescência da GFP (máximos de emissão 510 nm) deve ser diferenciado de que a partir de OFP (emissão máxima de 560 nm). Há conjuntos de filtros de fluorescência que resolvem a fluorescência emitida a partir destes fluoróforos. No entanto, descobrimos que um detector espectral, disponível em microscópios de varredura confocal muitos laser, funciona melhor para esta aplicação. Um detector espectral separa a emissão de fluorescência em diversos componentes (normalmente 32 ou mais) com base no comprimento de onda. Várias bandas de comprimentos de onda adjacentes, podem ser combinados em um canal de imagem. Os comprimentos de onda a serem combinados são seleccionadas empiricamente de modo a maximizar o sinal de GFP e OFP, evitando cruzamento de sinal que iria confundir o traste medição. Utilizar a abertura numérica da lente mais elevada disponível. Nós usamos um 100x/1.49 ou 60x/1.49 lente Apo-TIRF. Usamos a Nikon A1R microscópio confocal executando o software NIS Elements. Configure o software de aquisição para capturar as espécies mitGO-ATeam2 ATP-bound e ATP-desacoplado. Usamos as seguintes condições.
    1. Definir pinhole de 1,0 unidades de Airy (UA), que no nosso sistema corresponde a resolução az de cerca de 0,42 mM.
    2. Definir zoom digitalização para se aproximar do limite de amostragem de Nyquist, que irá maximizar a informação espacial na imagem. No nosso sistema o tamanho do pixel é de 0,12 um.
    3. Como as mitocôndrias podem se mover durante o exame, pode ser útil para aumentar a velocidade de imagem, cortando o campo para 512 x 256 pixels. O tempo total requerido para a imagem de uma estrutura do nosso sistema, é de 1,0 segundos, incluindo uma média de varredura de 2 vezes. Dependendo da resolução espacial desejado, o campo pode ser posteriormente cortada para crese resolução de tempo.
    4. Excite a 488 nm, e recolher emissão de 500-520 nm para GFP e 550-580 nm para OFP. Valores ideais reais podem variar de acordo com as características do sistema de imagem.
    5. A potência do laser óptima para o nosso sistema situa-se entre 6,0 e 6,4%. A potência do laser óptima irá variar para cada sistema de microscópio, mas irá ser idealmente tão baixa quanto possível e ainda produzir uma imagem interpretável. Use um medidor de energia interna ou externa para monitorar mudanças na potência do laser, que ocorrem normalmente ao longo do tempo, em qualquer sistema óptico.
    6. Ajuste o ganho do detector de intensidade de luz e iluminação para maximizar a gama de valores de pixel detectada mas evitar a saturação do sinal, para o maior número possível de células. Não analise todas as células que contenham mais de 1% pixels saturadas. Imagem todas as amostras utilizando o mesmo objectivo, a potência do laser, digitalização de zoom, tamanho do pixel, ganho e offset.

4. Aquisição de Imagem

  1. Localize o pla focal ne de células de interesse, utilizando luz transmitida para minimizar o branqueamento da sonda fluorescente.
  2. Depois de localizar uma ou mais células de interesse, recolher um z-série, através de toda a espessura de uma célula típica (aprox. 7 mM), utilizando um tamanho de passo de 0,5 micron.
  3. Imagem outras células de interesse no slide, mas não uma imagem de único slide por mais de 15 min. Depois de 15 minutos sobre a lâmina, as células perdem a viabilidade.

5. Análise

Nível de ATP mitocondrial é determinada pela medição da proporção da emissão mitGO-ATeam2 a 560 nm a 510 nm em que 27 O estado redox do organelo é medida como a redução de oxidação (R / S) rácio de mito-roGFP,. Isto emissão a 510 nm a excitação a 470 nm dividido pela emissão a 510 nm a excitação a 365 nm. Antes de calcular a razão, nós subtrair fundo e determinar um valor limiar para os pixels que pertencem ao mitocôndrias fluorescente.

tenda "> domínio público (por exemplo, ImageJ 30) ou comercialmente disponíveis (por exemplo Volocity, Perkin-Elmer) de software pode ser utilizado para a análise de mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam2. Dependendo do software utilizado para a aquisição de imagens e para a análise, as imagens pode necessitar primeiro de ser convertido num outro formato, como TIFF, antes de abri-los no software de análise. Se as imagens são convertidas, é essencial para verificar que os valores de pixel não são mudadas durante a conversão. Análise de MITO-roGFP1 dados, usando ambos os programas é descrito abaixo. menus programa e as opções para selecionar dentro de cada menu são destacadas em negrito e itálico.

5.1 análise ImageJ

  1. Imagens abertas e tipo de alteração para 32 bit: Imagem → Tipo → 32 bits.
  2. Desenhe uma região de interesse (ROI) em uma área onde não há células. Calcule a intensidade média nesta ROI: Analisar → Measure.
  3. Subtrair o fundo média calculada a partir da pilha: Processo → Matemática → subtrair.
  4. Usando o z-stack subtraídos, encontrar a fatia média e limiar em mitocôndrias: Imagem → Ajuste → Threshold e clique em Aplicar na janela do Threshold. Aplicar a todas as fatias na pilha. Verifique Definir fundo pixels de NaN.
  5. Criar a relação z pilha: Processo → Image Calculator Divida a pilha reduzida pela pilha z oxidado para análise mito-roGFP1. Divida a imagem 560 nm (ATP bound) pelos 510 nm imagem (ATP não ligada) para análise mitGO-ATeam2.
  6. Desenhe um ROI em torno da área de interesse. Escolha Analisar → Ferramentas → ROI Manager, e clique em Adicionar para registrar o ROI. Múltiplas regiões podem ser armazenadas no gestor. Em ROI Manager, selecione todos ROIs, em seguida, escolha Mminério → Multi-Measure para medir todas as fatias de pilha. Exportar dados para uma planilha para análise.

5.2 análise Volocity

  1. Importar imagens em uma biblioteca Volocity e criar uma sequência de imagens com 2 canais.
  2. Desenhe uma região de interesse (ROI) em uma área onde não há células. Escolha: Tools → Ratio.
  3. Use Volocity para calcular o background: Obter do ROI.
  4. Ajustar o limiar para incluir estruturas mitocondriais.
  5. Marque a opção de aplicar uma LUT arco-íris para o canal de relação. O canal de intensidade modulada pode produzir uma imagem menos barulhenta para apresen-tação, mas não deve ser usado para a quantificação da proporção média.
  6. Selecione a guia de medição, selecione o canal de relação e desenhar um ROI em torno da área de interesse. Meça o canal de relação, excluindo os valores zero. Múltiplas regiões podem ser seleccionados e mediuao mesmo tempo. Exportar dados para uma planilha para análise.

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Representative Results

Medindo estado redox mitocondrial com mito-roGFP

Aqui, mostramos que mito-roGFP1 tem a gama dinâmica para detectar alterações no estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reduzida em células de levedura viva, sem afetar o crescimento de células de levedura ou morfologia mitocondrial. Primeiro, encontramos células que expressam GFP mitocôndrias-alvo e roGFP1 crescer a taxas normais (Figura 1A). A taxa de crescimento máxima, tal como medido pelo declive máximo da curva de crescimento durante a fase de crescimento log e o tempo para atingir a taxa máxima de crescimento, é semelhante em células que expressam GFP e Mito-mito-roGFP1. Além disso, as mitocôndrias em levedura expressando Mito-roGFP1 exibem morfologia de tipo selvagem (Figura 1B). Especificamente, eles são tubulares, alinhe ao longo do eixo-mãe broto, e se acumulam nas pontas de células mãe e filha. Como a disfunção mitocondrial, muitas vezes induz a fragmentação, esta morfologia normal suporta a idéia de que mito-roGFP1 faznão perturbar a função mitocondrial.

Para avaliar a gama dinâmica do mito-roGFP1, tratamos de fase de células de levedura do tipo selvagem mid-log com peróxido de hidrogénio (H 2 O 2), e ditiotreitol (DTT), respectivamente, e mede a relação R / S mitocondrial significativo para avaliar mitocondrial estado redox (Figura 2). A titulação com H 2 O 2 ou DTT 0-10 mM resulta numa alteração dependente da dose significativo na proporção celular R / S com uma gama de medição de 0,6 (em condições de oxidação) para 1,23 (sob condições de redução). Assim, Mito-roGFP1 um biossensor é eficaz para análise de estado redox mitocondrial em células vivas.

Mito-roGFP1 também oferece subcelular resolução de estado redox mitocondrial. Esta resolução subcelular revela que as mitocôndrias em células de levedura individuais diferem no estado redox relativo. Se mitocôndria dentro de uma única célula de levedura são funcionalmente distinto, é possível que oy é passiva ou activamente segregada (Figura 3). Tal segregação pode contribuir para mãe e filha idade assimetria eo rejuvenescimento das células-filhas. Esta constatação reforça a necessidade de um biossensor com subcelular resolução de estado redox mitocondrial.

Tem sido desde há muito conhecido que a luz 31 pode induzir mudanças no cromóforo de GFP. Após a exposição a elevada intensidade de luz de 400 nm, roGFP1 fotoconversão submetido a uma espécie com um espectro de emissão diferente 26. Quando fotoconversão ocorre, há uma diminuição na emissão verde oxidado de mito-roGFP1 e um aumento na emissão verde por excitação de mito-roGFP1 reduzida, o que altera a razão de R / S de mito-roGFP1 (Figura 4B). Usando excitação (por exemplo, a iluminação em 40% usando os 400 nm LED da fonte de luz Colibri) de baixa intensidade, não há fotoconversão significativa durante o período analisado (Figura 4C). O p referida maneira de reduzir fotoconversão é excitar a forma oxidada da roGFP a 365 nm (ver discussão).

Medição mitocondrial ATP com mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 localiza a mitocôndria, quando expressos em células de mamíferos. 27 Descobrimos que mitGO-ATeam2 colocalizes com DNA mitocondrial DAPI manchada em levedura, e é encontrado em estruturas tubulares típicos do tipo selvagem de mitocôndria de levedura (Figura 5A). Assim, verificou-se que a seqüência de direcionamento mitocondrial da citocromo c oxidase de mamíferos subunidade VIII localiza a sonda para a mitocôndria em leveduras, sem perturbar a morfologia mitocondrial. Além disso, descobrimos que a taxa de células que expressam mitGO-ATeam2 crescimento é semelhante à das células que expressam a GFP mitocôndrias segmentada em ambos os meios de glicerol e de glucose (Figura 5B). Assim, a expressão de mitGO-ATeam2 não parece serem prejudiciais para a célula ou mitocôndrias.

_content "> Em seguida, testou-se o mitGO-ATeam2 FRET responde a mudanças nos níveis de ATP mitocondrial. fazê-lo, nós tratamos as células com antimicina A, um agente que se liga à citocromo c redutase, inibe a oxidação de ubiquinol na cadeia de transporte de elétrons , interrompe o gradiente de protões, e inibe a produção de ATP mitocondrial. 20 A mediana FRET proporção diminui em células tratadas com antimicina A (Figura 6C).

Dado que a evidência mitGO-ATeam2 é um biossensor eficaz para ATP mitocondrial, utilizou esta sonda para monitorar os níveis de ATP mitocondrial em leveduras que foram propagadas através de uma fonte de carbono fermentável ou não fermentável (Figura 6A e 6B). A redução da área total de fluorescência da glicose em células crescidas confirmaram que a glicose repressão resulta numa diminuição na abundância mitocondrial. Notamos variação de célula para célula ao nível de mitGO-ATeam2. Curiosamente, os dados preliminares indicam que existe ma y haver diferenças nos níveis de ATP mitocondrial em diferentes dentro da mesma célula (Figura 6D).

Figura 1
Figura 1. Mito-roGFP1 detecta estado redox mitocondrial sem afectar a taxa de crescimento celular ou na morfologia mitocondrial. (A) Crescimento de levedura que expressam a GFP mitocôndrias segmentada ou ro-GFP1 foi medida como uma mudança na densidade óptica a 600 nm como uma função do tempo de crescimento em meio líquido SC-Ura a 30 ° C. (b) Os painéis superiores: morfologia mitocondrial normal e localização no canal de imagens em bruto. Menores painéis: imagens Relação mostrar o canal reduzida dividido pelo canal oxidado (referência de cor à direita). As imagens mostram o efeito da escolha de limiar em resultados. O limite ideal inclui estruturas mitocondriais e exclui fundo.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 2

Figura 2. Mito-roGFP1 detecta alterações no estado redox mitocondrial em resposta ao tratamento com peróxido de hidrogénio ou ditiotreitol. (AB), as células de levedura em fase semi-log expressando Mito-roGFP1 foram incubadas em meio SC-Ura sem tratamento (0) ou com as concentrações indicadas de H 2 O 2 ou DTT, durante 20 min a 30 ° C. (A) projecções máximo de intensidade das imagens de relação de mito-roGFP1 R / S são sobrepostas nas imagens de luz transmitida, que mostram os contornos das células. A referência de cor para o mito-roGFP1 é mostrado no canto superior direito. Bar:. 5 mM (B) Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 3
Figura 3. Mito-roGFP1 oferece subcelular resolução de estado redox mitocondrial. Uma projeção de intensidade máxima do canal relação mito-roGFP1 R / S é sobreposta a uma imagem de luz de transmissão. A referência de cor para o mito-roGFP1 é mostrado no canto superior direito. Barra: 5 uM. Esta célula particular tem uma razão média de mito-roGFP1 de 0,88 R / S. No entanto, dentro deste indivíduo mitocôndria celular mostram diferentes estados redox. Os números apresentados são a razão-roGFP1 mito calculado R / O para diferentes re mitocondrialregiões. Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 4
Figura 4. Excitação de alta intensidade leva a fotoconversão e MITO-roGFP1 proporções alteradas R / S. Levedura fase Mid-log expressando Mito-roGFP1 foram iluminadas com luz a 400 nm, a 40% (A) ou 100% (B) a partir de uma fonte de energia de luz LED , e a fluorescência a partir de oxidada e reduzida de mito-roGFP1 foi captada cada 4 s. As imagens mostradas são projeções máximo em que as cores representam a relação R / S de mito-roGFP1 (ver escala de cores no canto inferior direito). Barra: 5 uM. (C) A proporção de mito-roGFP1 R / S permaneceu constante durante o período de imagem mediante a iluminação de 40% de energia LED. No entanto, após a iluminação 100% LED de energia, nósobservada uma alteração dependente do tempo em relação de mito-roGFP1, que reflecte photoswitching do fluoróforo R / S. Quadrados pretos, 40% de energia LED;. Diamantes cinza, 100% de potência LED Clique aqui para ver a figura maior.

Figura 5
Figura 5. MitGO-ATeam2 se localiza na mitocôndria de levedura e não afecta as taxas de crescimento de células de levedura. (A) As células de levedura que expressam mitGO-ATeam2 foram cultivadas até à fase mid-log, fixada usando paraformaldeído e coradas com o corante de ligação a ADN DAPI, como descrito anteriormente . 19 imagens mostradas são projeções de intensidade máxima de deconvolved z-series. Por simplicidade, as imagens mitGO-ATeam2 foram obtidos utilizando um filtro convencional GFP, de forma que apenas representam o desacoplado população em ATP. Celular foralinhas são mostradas em branco. N: ADN nuclear. mtDNA: DNA mitocondrial. Barras: 1 um (B) Curvas de crescimento de células de levedura do tipo selvagem, expressando GFP ou mitocôndrias segmentada mitGO-ATeam2 baseado em glucose (SC), e com base em glicerol (SGlyc) meios líquidos a 30 ° C.. Estes dados são a média de quadruplicado para cada estirpe em cada ponto de tempo, e é representativo de duas experiências independentes. clique aqui para ver figura maior.

Figura 6
Figura 6. Medidas MitGO-ATeam2 mudanças nos níveis de ATP em mitocôndrias de levedura na resolução subcelular e suborganellar. (AB) Emissão de mitGO-ATeam2 de GFP (510 nm) e DOF (560 nm) e quantificação da taxa de emissão de fermento 560/510 nm As células cresceram durante a noite em glucoSE-base (SC) (A) ou com base em glicerol (SGlyc) (B) meios de comunicação. A referência de cor para o canal de relação 560/510 é mostrado no canto inferior direito. Barras: 1. UM (C) Quantificação do rácio 560/510 em células propagadas em meios com ou sem SGlyc antimicina A (2 ug / ml) durante 1 hora a 30 ° C. A diminuição dos níveis de ATP sobre antimicina um tratamento é estatisticamente significativa (teste de significância Kruskal-Wallis). (D) 560 nm/510 relação nm de mitGO-ATeam2 de uma fase de célula do tipo selvagem mid-log propagada na mídia SC. A referência de cor para o canal de relação 560/510 é mostrado no canto inferior direito. O esquema é mostrado na célula branco. A média da relação 560/510 nm para toda a célula é de 0,43. Os números mostrados são as razões 560/510 Nm de regiões específicas dentro da mitocôndria. Bar: 1 mícron. Clique aqui para ver a figura maior.

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Discussion

Aqui, descrevemos métodos para usar mito-roGFP1 e mitGO-ATeam2 como biossensores para avaliar o estado redox mitocondrial e os níveis de ATP em células de levedura viva. Nós achamos que a expressão de plasmídeo de origem mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam resulta em quantitativo direcionamento para mitocôndria, sem qualquer efeito óbvio sobre a morfologia e distribuição mitocondrial ou nas taxas de crescimento celular. 3 Mito-roGFP1 pode detectar alterações no estado redox mitocondrial de altamente oxidado a estados muito reduzidos. Da mesma forma, mitGO-ATeam pode medir mudanças nos níveis de ATP mitocondriais que ocorrem em leveduras em crescimento respiração orientada e fermento tratado com um inibidor da respiração. Além disso, uma vez que ambos os biossensores oferecer resolução subcelular, que pode detectar a heterogeneidade no estado redox, ou os níveis de ATP de mitocôndrias no interior das células individuais. Finalmente, uma vez que ambos os biossensores são sondas raciométrica, eles não são afetados por mudanças na concentração ou variabilidade na espessura da amostra ou para o malumination. Essas sondas fornecem uma abordagem minimamente invasiva para estudo da função mitocondrial, com resolução subcelular em células vivas.

Para aplicar este método com sucesso, as imagens devem ser adquiridos com a taxa máxima possível de sinal-ruído. Um primeiro passo importante é examinar células 10-20 colônias transformantes sob o microscópio e selecionar aqueles com fluorescência robusto e morfologia mitocondrial normal e as taxas de crescimento. Ainda, as condições de imagiologia devem ser optimizados para produzir alta, mas não saturante, intensidades, sem causar fotodano à proteína fluorescente ou as células. Algumas células de uma população (<1%) pode ter invulgarmente elevada ou baixa fluorescência total, devido à variação do número de cópias de plasmídeo, que podem ser tidas em conta em favor de capturar imagens interpretáveis ​​da maioria das células.

Embora os benefícios da mito-roGFP são claras, também é importante estar ciente dos perigos potenciais. Nós detectamosdiferenças de potencial redox mitocondrial não apenas com diferenças fonte de carbono induzidas pelo metabolismo celular, mas também contra a propagação de fungos em diferentes lotes do mesmo meio. Assim, o cuidado deve ser tomado quando a seleção da mídia de crescimento celular para medições redox mitocondrial. Além disso, apesar de Mito-roGFP oferece resolução espacial sem precedentes do estado redox mitocondrial, a resolução temporal de roGFP não é suficiente para detectar picos de ROS, que estão associados com a transdução de sinal de ROS 31. Finalmente, é preciso ter cuidado ao escolher o comprimento de onda de excitação e intensidade para a forma oxidada da roGFP. Iluminação em 400 nm ideal excita as espécies oxidadas de roGFP. No entanto, também excita roGFP reduzida a uma maior extensão em comparação com excitação a 365 nm. Isto leva a uma redução da sensibilidade na medição estado redox mitocondrial. Além disso, a exposição de mito-roGFP1 de iluminação de alta intensidade a 400 nm conduz a fotoconversão da proteína para uma especificaçãos com alterados propriedades espectrais. Nós não vimos fotoconversão sobre iluminação de alta intensidade em 365 nm. Portanto, recomendamos o uso de excitação 365 nm, se possível.

MitGO-ATeam2 também tem limitações. Por exemplo, desde mitGO-ATeam2 é em si uma proteína que pode ser danificado por insultos celulares, incluindo espécies reativas de oxigênio, o que pode prejudicar a sua actividade biosensor. Além disso, a GFP e comprimentos de onda de emissão de OFP (510 e 560 nm), tem de ser resolvido para FRET análise, o que pode ser difícil em microscópios de fluorescência convencionais.

Ao contrário da enzima em ensaios in vitro, estes ensaios em células vivas, reportar mudanças relativas de ATP mitocondrial ou do estado redox, e não medir a concentração absoluta de ATP ou a cisteína reduzida. Embora uma curva padrão poderia, teoricamente, ser gerado medindo a resposta do sensor de proteínas em solução, esta pode não se aplicar ao ambiente molecular diferente dentro da mitocôndria. Lá ntes, estes ensaios fornecem um meio de comparar células sob condições diferentes. Além disso, as condições de imagem variam, de modo que os valores das razões exactas adquiridos numa configuração de imagem não pode ser replicado em outro.

Estas técnicas de imagiologia proporção pode ser adaptado para outros indicadores raciométrica, incluindo outros roGFP ou GO-ATEAM isoformas funcionais e outras sondas. A escolha de uma microscopia de campo amplo ou confocal dependerá da sonda e a resolução espacial exigida. O método de campo amplo foi utilizado aqui para Mito-roGFP porque permite a excitação a 365 nm, o que melhora a sensibilidade e estabilidade do sensor. O método confocal com um detector espectral, tal como utilizado aqui para mitGO-Ateam, proporciona uma forma conveniente para eliminar a passagem de emissões ajustando as janelas de detecção espectrais. No entanto, é possível realizar experiências semelhantes em microscopia de campo largo usando filtros personalizados ou eliminando cruzado computacionalmente.

ntent "> A dificuldade mais comum neste tipo de experimento de imagem é sinal insuficiente. hardware de imagem (especialmente a lente objetiva e detector) é fundamental para a coleta de sinais para interpretar os dados suficientes.

Os passos limiarização têm grande influência sobre os resultados, como a inclusão de fundo pixels pode umedecer todas as tendências nos índices obtidos. Métodos automáticos são preferíveis, mas devido a um sinal limitado, limiarização manual é muitas vezes o melhor método disponível. Se forem utilizados os limiares manuais, os critérios utilizados devem ser articulados, bem como possível, e análise pode ser necessário realizar cego ou por diferentes pesquisadores para demonstrar a reprodutibilidade. As experiências de controlo com antimicina A (para mitGO-Ateam2) e H 2 O 2 ou DTT (por mito-roGFP) pode ser utilizado para confirmar as mudanças previstas nos rácios de fluorescência.

Mito-roGFP e mitGO-ATeam2 são não-invasivos, sondas raciométrica para monitoramento mitoaptidão mitocondrial em células de levedura viva. Os sensores raciométrica aqui utilizados foram alvejados para mitocôndrias através da fusão de sequências de sinal específicas da mitocôndria. Outros compartimentos celulares podem ser estudadas, com a adição de sequências de direccionamento adequadas para os sensores originais. Além disso, é possível combinar qualquer um destes sensores com marcadores fluorescentes complementares (por exemplo, para organelos ou factores de sinalização) ou sensores (por exemplo, o cálcio) para medir simultaneamente vários processos em células vivas.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por prêmios de HHMI 56006760 para JDV, o National Institutes of Health (NIH) (2 TL1 RR 24158-6) para DMAW, e da Fundação Médica Ellison (AG-SS-2465) e do NIH (GM45735, GM45735S1 e GM096445) para LP. GM45735S1 foi emitido a partir do NIH sob a Recuperação Americana e Reinvestimento de 2009. Os microscópios utilizados para estes estudos foram apoiados, em parte, através de uma subvenção NIH / NCI (5 P30 CA13696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagents
Antimycin A Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) 1397-94-0 Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave.

Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glycerol
0.05% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura
**omit for SGlyc-Leu
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients:
0.67% Yeast nitrogen base without amino acids
3% Glucose
2 mg/ml adenine
2 mg/ml uracil*
1 mg/ml L-arginine
1 mg/ml L-histidine
1 mg/ml L-leucine**
3 mg/ml L-lysine
2 mg/ml L-methionine
4 mg/ml L-phenylalanine
2 mg/ml L-tryptophan
3 mg/ml L-tyrosine
Valap Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients:
Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
  Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) 3050 Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm Zeiss (Thornwood, NY) 474030-9000-000 These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 12-545E Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective Nikon (Melville, NY)  
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)  
Volocity 3D Image Analysis software Perkin Elmer (Waltham, MA) Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software National Institutes of Health (Bethesda, MD) http://rsb.info.nih.gov/ij/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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