비행의 레이저 탈착 / 이온화 시간 본래대로 단백질의 (MALDI-TOF) 질량 분광 분석 매트릭스를 이용한 큰 100 kDa의

Chemistry
 

Summary

정확한 질량 측정이 단백질의 조사 기간 동안 중요한 단계를 나타냅니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분석 (MS)은 이러한 결정을 위해 사용될 수 있고, 그것의 주요 장점은 염, 세제 및 오염물에 대한 내성이다. 여기에서 우리는 MALDI-MS 100 kDa의보다 큰 단백질의 분석을위한 접근 방법을 보여줍니다.

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Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. (79), e50635, doi:10.3791/50635 (2013).

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Abstract

효과적으로 단백질의 질량을 결정하는 (구조 생물학 조사를 위해 예를 들어) 많은 생물학 연구에 매우 중요합니다. 정확한 질량 판정 한 단백질 일차 서열의 정확성을 평가할 수 있으며, 돌연변이 및 / 또는 번역 후 변형, 가능한 단백질 분해, 샘플 균질성, 및 라벨의 경우 동위 원소 내장의 정도 (예를 들면 13 C 라벨의 존재 ).

전기 분무 이온화 (ESI) 질량 분석법 (MS)가 널리 변성 단백질의 질량 측정을 위해 사용 되나, 그 효율성은 샘플 버퍼의 조성에 의해 영향을 받는다. 특히, 염, 세제 및 오염물의 존재는 심각한 ESI-MS에 의한 단백질 분석의 효율성을 저해. 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MS는 그것의 내염성 및 데이터 수집 및 해석에의 단순성, 매력적인 대안기. 또한, 대형 이종 단백질 (보다 큰 100 kDa의)의 질량 판정 인해 ESI 스펙트럼에 존재하는 높은 충전 상태 분포를 중첩의 부재에 MALDI-MS에 의해 용이하다.

여기에서 우리는 비행 (TOF)의 MALDI-시간 100 kDa의보다 큰 단백질을 분석하기위한 접근 방법을 제시한다. 우리는이 행렬 (즉, 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 및 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산)의 혼합물과 샘플 증착을위한 방법으로서 박막 방식의 유틸리티를 사용할 때의 장점을 설명한다. 또한 레이저 에너지의 교정에 사용되는 표준의 매트릭스 및 용매의 순도가 중요한 역할을 논의하고, 획득 시간. 전반적으로, 우리는 MALDI-MS에 의하여 100 kDa의 단백질보다 더 큰 손상을 분석 초보자에게 필요한 정보를 제공한다.

Introduction

구조 생물학 고품질 단백질의 생산에 의존하고, 따라서 단백질 분석 2,3위한 효율적이고 신뢰성있는 기술로 결합 될 필요가있다. 구조 생물학 연구소 내의 우리의 질량 분석 (MS) 실험실에서 우리는 단백질의 기본 순서를 확인해야합니다, 돌연변이 및 전사 후 변형의 존재를 평가하고, 단백질의 분해, 샘플 균질성, 동위 원소 표지의 질 (예를 들면 중수 소화 핵 자기 공명 연구를위한 단백질 4). 구조 생물학 유연한 부분에서 구조적 강성 도메인을 구분하기 위해 제한된 단백질 분해를 사용하기 때문에, 우리는 안정적으로 MS를 사용하여 이러한 잘린 단백질을 특성화 할 필요가있다.

생체 분자가 MS에 의해 분석되는 경우, 두 가지 접근 방법은 부드럽게 무거운 및 불안정한 분자를 이온화하기 위해 사용된다. 전기 분무 이온화 (ESI)는 직접 분자를 이온화액상 5, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI)은 생체 분자가 자외선을 흡수하는 유기 분자 (즉, 매트릭스 분자) 6와 공동 결정화되어 있어야합니다.

그것은 (50 PPM ≤) 고정밀 질량 측정을 가능하게하기 때문에 ESI의 비행 시간 (TOF) MS 액체 크로마토 그래피에 결합하면, 본래의 단백질 분석 용 루틴의 기술이되었다. 그러나, (염 및 세정제에 관한 것이다) 시료 완충액의 조성 및 분석 신호의 억제를 일으키는 때로는 제거하기 어려운 오염 물질 (즉, 중합체)에 매우 민감하다.

MALDI-TOF MS는 성능이 적은 버퍼 구성 요소, 세제 및 오염 물질에 의해 영향을 받으므로 ESI-MS에 효과적인 대안을 나타냅니다, 시퀀스 확인을위한 (500 PPM ≤) 충분한 정확도를 그대로 단백질 질량 결정을 할 수 있습니다. PROTEI 후N 소화, MALDI-TOF MS는 또한 소위 "펩티드 질량 지문"에 의해 상기 기본 시퀀스 확인을 얻은 펩타이드를 분석하는 데에 이용 될 수있다.

우리 손에, 100 kDa의보다 크고 (의한 변경 또는 잘림에) 이질적 그대로 단백질의 질량 결정, ESI-MS에 의해보다 MALDI-MS에 의해 쉽습니다. 이 ESI 스펙트럼에 존재하는 중복 충전 상태 분포의 부족 때문이다. 또한, MALDI 프로세스가 분석 크기 7, 이러한 방법의 수율 높은 감도에 의존하지 않기 때문에 생체 분자 질량이 100 kDa의 이상인 경우. 본래 단백질의 현저한 분석은 1980 년대 말과 1990의 8-11 초 사이에 집에서 만든기구를 사용하여 수행 하였다.

이 샘플 준비를위한 시간이 덜 필요하고 interferen에 덜 민감하기 때문에 MALDI-TOF는 단백질 시료의 품질을 평가하는 검사 도구로 사용될 수있다일반적인 불순물 (예를 들면 염)에 의한 CES. MALDI-MS에 의하여 제, 퀵 평가 후, 샘플은 더 높은 정확도로 질량을 결정하기 위해 ESI-TOF로 분석 될 수있다. 또한, MALDI는 ESI보다 적은 비용을 포함하는 이온을 생성하고, 따라서 더 간단 MALDI 데이터를 수집하고 해석한다. 이 구조 생물학에서 일하는 학생들은 그냥 간단한 교육 후 자신의 재조합 단백질을 분석 할 수 있습니다.

매트릭스 및 매트릭스 증착 (예를 들어 건조 된 액적 (8) 및 박층 12-16,17,18)에 사용되는 기술의 두 핵심 요소가 MALDI 스펙트럼의 품질에 영향을 미친다. 하나의 유기 매트릭스 [예 sinapinic 산 (SA) 19 ~ 21 또는 α-시아 노 -4 - 히드 록 산 (α-CHCA) 14,22,23]가 자주 손상 단백질과 가교 단백질 복합체의 MS 시험에 사용되는 . α-CHCA를 사용 Chait 그룹은 이전에 P에 대한 자세한 프로토콜을 제시이전의 가용성 및 막 단백질 (14, 15)의 MALDI 분석에 매우 얇은 층을 reparing를. 최근, 고르 카 등 알. 매트릭스 (24)로 α-CHCA를 사용하여 펩타이드와 단백질의 MALDI 분석을 개선하기 위해 흑연 기반의 대상 코팅을 보여줍니다.

2,5 - 디 히드 록시 벤조산 (DHB)와 α-CHCA 25 : 여기서 우리는 두 행렬의 혼합물을 사용, MALDI-TOF MS에 의한 손상 단백질의 분석을위한 간단한 프로토콜을 제시한다. 우리는 체계적으로 그대로 단백질의 제어, SA 및 α-CHCA 행렬에 비해 DHB-CHCA 믹스의 성능을 평가 하였다. 매트릭스 혼합물을 더 나은 해상도 (단백질 피크가 훨씬 선명 즉)한다. 또한, 강렬한 체류 전하 이온의 존재 (즉, M +2 H 2 +, M +3 H 3 + 등)은 축 MALDI-TOF 계기의 해상도는 전하 위에 낮은 질량으로 높기 때문에 (더 정확한 질량 측정을 가능하게m / z) 26. 이것은 100 kDa의 단백질보다 더 큰 분자량을 결정하는 데 특히 유용하다.

높은 감도는 DHB-CHCA 혼합물 (MALDI 대상에서 발견 단백질의 0.5 pmole의)를 사용하여 도달한다.

위에서 언급 한 바와 같이, MALDI 기기를 사용할 때 고려되어야하는 중요한 요인은 증착 행렬이다. Laugesen 외.는 건조 액체 방울 증착을 이용하여, 처음 25 DHB-CHCA 혼합물의 사용을 제안했다. 우리는 첫 번째 층을 아세톤에 용해 된 α-CHCA 의해 형성되는 박막 법을 이용하면 그러나, 우리는 더 나은 결과 (예, 더 높은 감도)를 관찰했다. 박층 방법 12,27 이전 15 주피터 비디오에서 설명 하였다 MALDI 표적에 매트릭스 결정의 균일 하층의 형성을 의미한다. 그 후, 샘플은 마침내 기질 상에 증착되고,추가 행렬 (아래 참조)에 증착된다. 이 문서에서는, 우리는 또한 MALDI 대상에서 샘플을 입금하는 방법을 보여줍니다뿐만 아니라, 대상 (15)를 청소하는 방법, 재결정하고, 행렬을 준비합니다.

우리 모두가 (특히, 구조 생물 학자) 과학자에 그대로 단백질 분석에 필요한 정보를 신속하고 간단한 방법으로 생산 된 단백질의 품질을 평가해야하고 누구를 제공하는 것을 목표로 결론을하려면 MALDI-TOF MS에 아주 익숙하지 않다. 1990 년대 중반 28에서 예측으로, MS는 생물 학자들과의 접근성이 증가로, 생물학 연구에 증가 영향을 미쳤습니다. 우리는 우리가 제공하는 정보는 질량 분석기를 사용하여 시작하고 싶습니다 생물 학자와 과학자에 MALDI-TOF에 액세스 할 수 있도록하는 것이 유용 할 수 있기를 바랍니다.

Protocol

1. 단백질 시료 준비 : 버퍼 거래소 (선택 사항)

단백질 (1 ~ 20 μM)의 마이크로 몰 농도의 5-25 μL가 필요합니다. 버퍼 교환은 원심 한외 여과 장치 (예 Vivaspin,는 Sartorius) 또는 마이크로 원심 겔 여과 컬럼 (예를 들면, 마이크로 바이오 스핀 6 컬럼 크로마토 그래피, 바이오 라드) 29, 30을 사용하여 수행 될 수있다. 완충액 교환 단계는 2 - 3 회 반복 될 수있다. 버퍼 교환의 자세한 설명은 이전에 (29, 30)를 발표했다. 예를 들어, 우리는 20 mM의 최종 트리스 버퍼 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (즉 트리스) pH가 8을 이용한다.

참고 :이 단계는 대부분의 경우에 생략 할 수있다. 단백질 시료는 강하게 MS 검출을 방해 할 수있는 분자 또는 버퍼 포함 때 수행되어야한다 [예 : 글리세롤, 4 - (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산, HEPES]. 그것은 한때를 개선하기 위해 유용합니다스펙트럼의 ality.

2. 행렬의 재결정 이들의 순도 (선택 사항)을 개선하기 위해

  1. 파이렉스 플라스크에 40 % 에탄올 (EtOH로) 10 ㎖를 붓는다.
  2. 매트릭스의 600 밀리그램을 추가합니다.
  3. 수조 및 저항 히터를 사용하여, 매트릭스 용액을 따뜻하게 행렬이 완전 유리로드 또는 자석 교반기를 사용하여 용해 될 때까지 교반.
  4. 당신이 포화 용액이 될 때까지 2 단계를 반복합니다.

참고 : 용매의 너무 큰 볼륨을 사용하거나 작게 용액의 비점 이하 행렬 일절 결정 또는 결정 없음 나쁨 수율 발생할 용해.

  1. 용액을 천천히 냉각 할 수 있습니다. 당신은 4 ° C에서 하룻밤 후 몇 시간 동안 실온에두고 할 수 있습니다. 주 : 결정이 형성되어 있지 않은 경우, 결정화 유리 교반 막대를 사용하여 (저스트 인 솔루션면 아래) 비이커 내를 긁기에 의해 유도 될 수있다.
  2. 여과에 의해 매트릭스 결정을 수집합니다.
  3. 빙냉 용매의 최소량을 결정 헹구고 그들을 여과.
  4. 결정이 건조하도록 허용합니다. 이 단계 진공을 사용할 수 있습니다.

3. MALDI 스테인리스 대상의 청소

  1. 메탄올 (메탄올)와 MALDI 플레이트를 씻어 특수 실험실 응용 프로그램 (예를 들어, 킴 와이프)을 위해 만든 세정 티슈로 가볍게 닦아냅니다.
  2. H 2 O와 대상을 씻어 청소 티슈로 닦아냅니다.
  3. 600 ㎖의 비이커에 MALDI 플레이트를 삽입하고 50 % EtOH로 커버.
  4. 초음파 욕조에서 10 분 동안의 EtOH 솔루션에서 대상을 초음파 처리.
  5. 접시에 남은 잔여 물이있는 경우에, 다시 한번 1-4 단계를 반복한다.
  6. 마지막으로, (또는 물과 함께 아래의 메모를 참조) 메탄올과 목표를 씻어, 모든 액체가 청소 조직에 수집되는 방법으로 그것을 기울이십시오. 실온 또는 사용하여 질소 -에 목표를 건조 시키가스 흐름.

참고 : 유사한 절차는 이전 15 설명했다.

참고 : 대상의 마지막 헹굼에 사용되는 용매 (메탄올 또는 물) 일부 대상 기능을 결정합니다. 목표는 메탄올로 세정하는 경우, 샘플은 물을 사용하는 경우보다 훨씬 더 많은 대상에 퍼집니다.

4. α-CHCA 얇은 레이어 솔루션 : MALDI 대상에 대한 준비 및 증착

  1. 포화 용액을 만들기 위해 아세톤에 α-CHCA을 녹입니다.
  2. 손으로 (모든 피펫없이) α-CHCA 포화 용액에 10 ㎕의 팁 (예 : GELoader 팁, 에펜 도르프)을 찍어 : 용액의 소량 (때문에 모세관 현상에) 끝으로 흐를 것이다.
  3. 피펫 팁으로 매우 빠르게 (즉, 1 초) MALDI 대상을 터치 MALDI 대상에 α-CHCA의 아세톤 용액을 예금. 이것은 매트릭스 박막, 단백질을 구성 할 것이다샘플 적립됩니다. 가능한 한 작은 얇은 층의 자리를 생성하려고합니다.

주 : 매트릭스로서 SA를 사용하는 경우, 우리는 아세톤 SA의 포화 용액을 사용하여 박막을 제조.

5. SA, α-CHCA, DHB 및 CHCA_DHB 혼합물 25 : Natrix 솔루션의 제조

  1. , ACN에서 0.1 % TFA (70:30 권 / 권)을 20 ㎎ / ㎖ SA 솔루션을 준비합니다.
  2. 20 ACN의 ㎎ / ㎖ α-CHCA 솔루션 및 5 % 포름산 [ "α-CHCA 솔루션"으로 명명 (70:30 권 / 권)을 준비합니다.
  3. ACN 20 ㎎ / ㎖ DHB 용액 [ "DHB 솔루션"으로 명명 된 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) (70:30 권 / 권)을 준비합니다.
  4. "CHCA_DHB 솔루션"을 얻기 위해 1:1 비율 (권 / 권)의 "α-CHCA 솔루션"과 "DHB 솔루션"을 섞는다.

참고 : 대량 미만 100 kDa의 단백질의 발현을 분석 할 때 하나는 서로 다른 비율로 "α-CHCA 솔루션"과 "DHB 솔루션"을 혼합 할 수 있습니다. EXA에 대한엠플 α-CHCA과 DHB (권 / 권) 사이에 40:60의 비율이 더 나은 해상도, 그러나 더 적은 감도 (설명 참조) 산출합니다.

6. MALDI 대상에 샘플 증착

  1. 이전에 제조 된 α-CHCA 얇은 층의 단백질 샘플의 예금 0.5 μL. 즉시 그 후, 매트릭스 솔루션 (즉, SA 용액 또는 α-CHCA 솔루션 또는 "CHCA_DHB 믹스")의 0.5 μl를 추가합니다. 이것은 대상 시료와 매트릭스를 혼합하는 것을 의미한다.

참고 : 보통 사람은 1:1의 비율로 매트릭스 단백질 샘플을 혼합. 이 비율은 MALDI 스펙트럼의 좋은 품질에 대한 중요합니다. 서로 다른 샘플의 농도를 테스트하려는 경우, 당신은 샘플을 희석 ACN_formic 산 용액 (전술)를 사용할 수 있습니다.

참고 : 원하는 경우, 당신은 튜브에 시료와 매트릭스를 혼합 한 후 혼합 "sample_matrix 솔루션을 입금 할 수 있습니다얇은 층에 기 ".

참고 : 우리는 샘플을 희석하는 것은 당신이 오염 물질의 간섭을 줄일 수 있기 때문에 다양한 샘플의 농도를 테스트하는 것이 좋습니다. 샘플을 희석하기 위해 샘플을 희석 ACN_formic 산 용액 (전술)를 사용할 수 있습니다.

7. Calibrant 증착

  1. 예금 calibrant 표준의 0.5 μL (예 : "단백질 표준 II", 브루 커 달 토닉, 브레멘) 다음 매트릭스 솔루션의 0.5 μl를 추가합니다.

참고 : 단백질 샘플 반점 옆에 MALDI 플레이트 (설명 참조)에 calibrant을로드합니다.

8. Calibrant의 MALDI 스펙트럼 수집 및 단백질 샘플

샘플 및 calibrant 건조 후에는 현미경으로 "장소"를 관찰 할 수 있습니다. 이 관찰은 선택 사항이며, 초보자에 주로 관심있는 내용 일 수. 샘플의 스펙트럼을 획득하려면 일을 삽입전자 MALDI-TOF 악기의 대상 및 장비의 각 유형에 대해 다른 적절한 수단이 매개 변수를 선택합니다. 가장 적절한 셋업을 얻으려면 하나는 제조 업체의 권장 사항을 따라야합니다. 그대로 단백질을 분석 할 때 일반적 고려 사항으로, 하나는 (펩티드 분석에 적합하지 반사 모드) 선형 모드에서 기기를 사용한다. 일반적으로 우리는 긍정적 인 이온 모드에서 우리의 악기를 사용합니다. 또한, 키 매개 변수는 쓸모 해상도 31 향상 "펄스 이온 추출"입니다. 간단히 말하면, "펄스 화 이온 추출은"샘플 이온의 생성과 이온이 검출기를 향해 가속된다 시간 사이 일시 정지로 정의 될 수있다. 본래 단백질을 분석 할 때, 하나의 펩티드를 관찰 할 때보다 큰 "펄스 화 이온 추출"(예를 들어 500 나노초)을 이용 (예, 80 나노초).해야

해당 M / Z의 범위를 선택, 스펙트럼 (을)를 취득F calibrant, 악기를 보정합니다. 당신은 당신의 샘플의 스펙트럼을 획득 할 때, 적절한 레이저 강도를 (설명 참조)를 사용합니다.

Representative Results

서로 다른 두 행렬, 두 증착 방법과 동일한 레이저 강도 (그림 1)를 사용하여 :, 우리는 그대로 단백질 (123,386 다 분자량 염색체 영역 유지 보수 1 단백질, Crm1)을 분석 하였다. SA 및 CHCA_DHB 혼합물 행렬로서 이용 하였다. 혼합물 (그림 1A 및 B) 신호 대 잡음 비의 민감도 측면에서 높은 품질의 질량 스펙트럼을 얻었다. 특히, 우리는 MALDI 대상 (그림 1C)에 부착 단백질의 0.5 pmole의를 감지 할 수 있습니다. 단백질의 동량은 SA (도 1D)을 사용하여 거의 검출이었다. 더욱이, 행렬의 혼합물을 사용하여, 행렬 증착을위한 선택의 방법은 "박층"접근 (도 1a)이었다. "건조 액적"방법을 사용하여, 우리는 질량 이상 100 kDa의 (데이터는 미도시)와 함께 임의의 단백질을 검출하지 못했다. CHCA_DHB 혼합물 (그림 1A와 1C)를 이용, 곱셈 PROTEI의 이온 충전N 축 MALDI-TOF 계기에서 최대 해상도는 m / z (26)에 반비례하기 때문에보다 높은 정밀도로 대량 판정을 가능하게 관찰되었다.

우리는 또한 단량체 베타 - 갈 락토시다 아제 (116,300 다) (그림 2)을 분석 하였다. CHCA_DHB 스펙트럼 감도와 해상도 측면에서 SA 스펙트럼보다 더 있었다. 또한, 곱셈으로 하전 된 이온 (M 2 +, 3 + M 및 M 4 +)의 존재는 우리가 더 높은 정확도를 가진 단백질의 질량 (그림 2A와 2C)를 확인 할 수있었습니다. 박층 접근법을 사용하여, 우리는 면역 글로불린, IgG에 대한 분석 (148500 다) (도 3)에 대한 CHCA_DHB 혼합물, SA 단독 α-CHCA의 성능을 비교 하였다. 우리가 다른 데이터를 상관하면 단백질 신호 높았고 CHCA_DHB 스펙트럼에서 더 나은 해상도. 결론적으로 CHCA_DHB 혼합물 및 박막 증착 방법의 사용 MALDI TOF 계기를 사용하여 취득한 큰 손상 단백질 질량 스펙트럼의 품질에 상당한 개선을 보였다.

그림 1
그림 1. 123,386 다 : 본래 염색체 영역 유지 보수 1 단백질 (Crm1), 분자량의 MALDI-TOF 분석. . Crm1의) 1 pmole는 행렬 B) 양으로 DHB_CHCA 믹스를 사용하여 분석 하였다 : 1 pmole, 매트릭스 :. SA C) 양 : 0.5 pmole, 매트릭스 :. DHB_CHCA D) 양 : 0.5 pmole, 매트릭스 : SA. 피크의 신호는, 임의의 강도 단위 눈금으로 표시 한 각 스펙트럼에서 최대 값으로 정규화 본이다.

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그림 2. 그대로 베타 - 갈 락토시다 아제 (116,300 다)의 MALDI-TOF 분석. A) 양 : 20 pmole의, 매트릭스 DHB_CHCA B) 양 :. 20 pmole의, 매트릭스 :. SA C) 금액 : 5 pmole의, 매트릭스 :. DHB_CHCA D) 양 : 5 pmole의, 매트릭스 : SA.

그림 3
그림 3. 그대로 면역 글로불린 IgG에 (148,500 다)의 MALDI-TOF 분석, 양 :. 1.7 pmole의 스펙트럼 CHCA_DHB 혼합물을 사용하여 얻은 훨씬 더 강렬했다 (최대 : 8200 임의 단위 AU) SA 스펙트럼 이상 (최대 1,200 AU) 및 α-CHCA 스펙트럼 (최대 : 4500 AU)

Discussion

우리는 MALDI-TOF 악기를 사용하여, 100 kDa의보다 큰 분자량에 큰 손상 단백질의 높은 품질의 질량 스펙트럼을 얻기 위해 세부 프로토콜을 제시했다. 샘플 준비에 관한 중요한 측면의 개수 정중 질량 스펙트럼의 품질을 개선하기 위해 고려되어야한다. 행렬 및 용매에있는 모든 오염 물질이 용매를 증발시킨 후 MALDI 대상에 집중되어 있기 때문에 행렬 및 고순도 용매는 매우 중요하다. MALDI 행렬의 순도를 향상시키기 위해 그것 (상기 참조) 고전 재결정 방법을 사용하여 정제 할 수있다. 우리는 또한 갓 매트릭스 결정을 개선하고 매트릭스 저하를 방지하기 위해 (적어도 일주일에 한 번) 매트릭스 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다.

매트릭스 증착 방식은 스펙트럼의 최종 품질에 매우 중요하다. 전술 한 바와 같이, 박막 법은 우리의 방법이다 OF 선택 12. 더욱이, 우리는 첫 번째 층을 증착하기위한 방법을 최적화. 매트릭스가 포화 용액을 수득 아세톤되면 파논은 용매의 빠른 증발을 허용하지만, 또한 제어하는​​ 제 1 층의 크기가 매우 어렵게 만든다. 우리는 당신이 신속하게 대상에 입금 최소한의 볼륨을 얻을 수있는 matrix_acetone 용액에 담그는 작은 브러시로 GELoader 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 제 1 층의 크기는 어떻게 든 MALDI 스팟의 최종 크기를 제어한다 :이 경우 시료 농도가 큰 곳의 경우보다 높기 때문에 작은 스폿 (지름 0.5-0.75 mm)가 바람직하다. 작은 자리를 얻기 이전에 조브 비디오 15에서 제안 된 매우 얇은 층의 접근 방식과 다릅니다. Fenyo에서는 외. 박층 용액 모두 피펫 팁의 측면을 이용하여 MALDI 표적 퍼진다. 이 접근법은 특정 기준을 만족해야 박층 테스트 필요(용매 증발의 예를 들어 속도). 기준이 충족되지 않으면, MALDI 대상은 세정되어야하고, 새로운 얇은 층을 제조한다. 이것은 초보자를위한 준비는 매우 힘든합니다. 또한, 접시에 샘플 / 매트릭스 혼합물의 증착 Fenyo 등. 준비 우리의 접근 방식보다 조금 더 어렵게, 진공 라인 및 TFA (15)를 사용하여 세척 단계를 사용하여 여분의 용매의 흡입을 필요가 필요합니다.

매트릭스 및 샘플 간의 용적비는 MALDI-TOF에 의한 손상 단백질의 성공적인 분석에 매우 중요하다. 다른 비율을 테스트 한 후 우리는 1:1 비율을 사용하는 것이 좋습니다. 다른 매트릭스 : 표본 비율은 아마 동질이 아닌 이유로 결정화, 스펙트럼의 품질을 손상시킬 수 있습니다. 매트릭스 및 샘플이 증착되는 순서는 중요하다. 매트릭스 박막을 증착 한 후, 샘플은 증착되고 바로 SAMP 이전 (이후르 지점)이 건조되고 CHCA_DHB 혼합물을 첨가한다. 이 절차는 단독으로 샘플이 매트릭스 층 사이에 침착된다 "샌드위치 법"(27)로 정의되었다. 대안으로 CHCA_DHB 용액 및 시료 0.5 ㎖ 튜브에 혼합 될 수 있으며, 다음 CHCA 얇은 층 (12) 상에 발견. 이것은 고품질 스펙트럼에서 생성 된 결정의 균질 층으로 자리를 산출한다. 이 예리한 피크를 생성 할 수 있지만, 측정 감도 (즉, 덜 강한 피크)를 손상시킬 수; 질량보다 낮은 100 kDa의, DHB의 농도로 단백질을 분석 할 때 (CHCA 60:40 DHB)을 증가시킬 수있다.

정확한 계측기 교정의 경우, 하나보다 질량 정확도를 얻을 수 있도록 시료 스폿에 매우 근접 calibrant 표준을 증착하는 것이 필수적이다. "의사 내부 교정 절차는"이전에 15를 제안했다 : 샘플의 스펙트럼, calibrant 자리 나 인수 후calibrant의의 레이저 샷 신호는 샘플의 스펙트럼에 추가됩니다. 이것은 당신에 내부적으로 calibrant 피크를 사용하여 샘​​플의 스펙트럼을 보정 할 수 있습니다.

레이저 에너지는 신중 스펙트럼 획득 동안 제어되어야한다. 대부분의 경우에, 높은 에너지는 감도를 증가 시키지만 해상도를 낮춘다. 우리는 인수의 감도를 저하시키지 않고 가능한 최소 레이저 에너지를 사용하여 제안한다. 또한, 스펙트럼의 품질을 개선하기 위해, 하나는 각각의 샘플에 대한 추가 스폿 발포를 획득 할 수있다. 일반적으로 더 명중하면 (1,000-2,000 발포)을 취득, 신호의 강도 높은. 레이저로 자리를 타격하는 경우, 하나의 샘플이 균일하게 분산되지 않기 때문에, 올바른 위치 (예 : "스위트 스팟")를 찾을 필요가있다. 당신은 신호가 증가 될 때까지 같은 지역에서 촬영 한 다음 샘플을 포함하는 또 다른 영역을 찾기 위해 시도 할 수 있습니다.

행렬과 SOLV의 결론, 고순도엔트 샘플 및 대상 행렬 증착에 사용되는 방법은, 교정, 레이저 에너지의 강도, 취득 시간 (발포 / 스팟의 개수)에 사용되는 표준의 위치는 하나의 고려해야 할 중요한 요인 MALDI-TOF MS에 의해 손상 단백질을 분석.

저자 포스트

LS 및 EBE는 실험 설계 질량 분석 실험을 수행하여 데이터를 분석하고, 원고를 썼다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

우리는 원고의 비판적 평가를위한 유용한 토론을위한, IBS 박사 크리스토프 Masselon (iRTV, CEA, 그르노블) 및 바이러스 성 감염의 회원들과 암 그룹 감사합니다. 우리는 단백질 Crm1의 종류 선물을위한 시릴 다이애나에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 과학적인 연구는 그르노블에 지시 센터 (; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL ISBG)의 질량 분석 시설에서 일어났다. 그것은 경제적으로 통합 된 구조 생물학 이니셔티브 (FRISBI, ANR-10-된 InSb-05-02)에 대한 프랑스의 인프라에 의해 지원되었다, GRAL (ANR-10-LabX에-49-01) [그르노블 공동체 내에서 구조 생물학]와로 과학 연구에 대한 프랑스의 국립 센터 (CNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Trizma hydrochloride Sigma T3253
Trizima Sigma T6066
Micro Bio-Spin 6 chromatography columns Bio-Rad 732-6221
Vivaspin 500 Sartorius VS0122 various molecular weight cut off
Methanol Fluka 14262
Ethanol Fluka 02860
KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers Kimberly Clark 05511
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma Aldrich C8982
Acetone Sigma Aldrich 650501
2,5-dihydroxybenzoic acid Fluka 39319
GELoader Tips Eppendorf 0030 001.222
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Formic acid Fluka 09676
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031
Protein Standard II Bruker Daltonics 207234 It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine
Immunoglobulin G ABSciex GEN602151
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Water purifier PURELAB Ultra Analytic ELGA LabWater 89204-052
Autoflex MALDI-TOF instrument Bruker Daltonics
MALDI-TOF target Bruker Daltonics

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References

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