在单酵母细胞MAPK诱导表达的时空定量

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Biology

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Summary

基于流式细胞术和显微术的两个互补的方法给出,使定量基因表达的诱导通过MAPK途径在酵母的激活的动力学,在单细胞水平。

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Pelet, S., Aymoz, D., Durandau, E. Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells. J. Vis. Exp. (80), e50637, doi:10.3791/50637 (2013).

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Abstract

基因表达在单细胞水平进行定量揭示了掩盖在在群体水平上进行测量,新的监管机制。基于显微镜和流式细胞仪两种方法都表现出这样的数据怎么可以被收购。荧光报道诱导活化时的高渗透压甘油MAPK途径在酵母中的表达被用来作为一个例子。每种方法的具体优点突出。流式细胞术测量大量细胞(10,000),并提供了直接的措施独立的荧光蛋白的慢动力学成熟的蛋白表达的动力学。通过显微镜活细胞成像是通过对比限于记者在较少的细胞的成熟形式的测量。然而,通过这种技术产生的数据集可以是非常丰富得益于多个记者的组合,以及在空间和时间信息从单个细胞中获得。这两种测量方法的结合,可以通过信号传导通路兑现蛋白表达的调控新的见解。

Introduction

通过转导级联信号常常达到高潮蛋白的表达。这种表达谱中的表征对于理解生物学途径的功能的关键因素。上调的蛋白及其活化的动态频谱的识别可以通过例如微阵列,RNA印迹或蛋白质印迹1-3的各种技术来实现。然而,这些技术平均细胞的全体人民的响应。了解蛋白质的表达的精细调节,理想的是收集的测量在单细胞水平。理想情况下,这些测量还应提供定量数据服从发展的基本途径的数学模型。

显微镜和流式细胞仪两种技术,这是非常适合提供这样的定量单细胞测量。蛋白质与荧光蛋白质的内源性标记可以bÉ用来量化其4表达水平。然而,由于在该蛋白质的末端增加了一个大的荧光部分可以使其不起作用的,它往往是更可取的,以产生根据一个启动子驱动的荧光构建体的表达特异性表达记者。此报告蛋白是外生给蜂窝系统,因此不影响正在发生在细胞内信号转导事件。

既显微镜和流式细胞仪已经被广泛应用于酵母的信令字段。作为例子;科尔曼-雷纳和同事相关的,在单个细胞中,配合特定的和组成性表达,记者通过显微镜来量化在酵母交配信号转导级联5的噪声的表达,阿贾尔和使用流式细胞仪来研究调控网络的同事控制的GAL基因6的表达。在先前的研究7,我们已经使用了一个化合物-关于这两种技术从高渗透压甘油(HOG)途径在芽殖酵母研究的表达输出。这有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)途径是由超渗透胁迫触发。它导致MAPK Hog1,这转位到细胞的核的活化,诱导产生大约300个基因的表达的转录程序。为了研究这个过程,我们设计了一个基于该STL1启动子(响应Hog1活动8特异性诱导基因)驾驶一辆四金星荧光蛋白(P STL1-QV)的表达表达记者。流式细胞术测量露天细胞的两个群体的存在下,在中间应力水平(0.1M NaCl)中以表达荧光报道人口的一小部分。我们用显微镜来进一步研究这个问题,并发现这种噪声的蛋白质表达,内在因素9管辖。我们凑LD进一步观察到细胞Hog1活动的一个类似的水平可能显示明显不同的表达效果。这两种技术的结合允许我们来演示如何的应激反应基因的慢重塑的影响表达产物在单细胞水平7。

在本文中,我们使用p STL1-QV记者通过超渗透休克诱导如通过显微镜蛋白表达的定量的一个例子中的表达和流式细胞术。一脉相承受到0.2M的NaCl胁迫,研究了这两种技术。这将允许我们强调在这两个高度互补的技术,一些关键的差别。

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Protocol

1。显微镜测量

  1. 接种5毫升合成培养基中的酵母。
  2. 细胞生长于30℃过夜。
  3. 测量过夜培养物的OD 600,第二天早上。
  4. 稀释过夜培养在5毫升合成培养基,以OD 600 0.05。
  5. 生长的稀释的培养在30℃下为至少4小时。
  6. 制备3倍浓缩在合成培养基(0.6 M)的NaCl溶液。
  7. 准备1毫克/毫升的溶液刀豆蛋白A(刀豆)的PBS中。
  8. 滤液〜200微升的溶液刀豆入井幻灯片。
  9. 静置30分钟。
  10. 删除刀豆解决方案。
  11. 加入150μlH 2 O至井。
  12. 除去H 2 O
  13. 测量细胞培养的外径600。
  14. 在1.5ml微管中制备300μl的细胞培养物在OD 600 = 0.02。
  15. 超声处理水浴中45秒的单元格。
  16. 涡简要英里crotube。
  17. 超声处理水浴中45秒的单元格。
  18. 短暂涡旋微管。
  19. 加入200μl细胞培养的好。
  20. 等待30分钟,以让细胞沉降到井的底部。
  21. 放置在显微镜的良好滑动。
  22. 选择照明设置的荧光信道进行记录。
  23. 选择两个亮场图像的照明设置(一个关注的焦点:3微米以下的焦平面以允许细胞的适当分割)。
  24. 选择的时间间隔的延时测量
  25. 选择视图图像的字段。
  26. 开始采集数帧。
  27. 暂停收购以添加100微升0.6 M氯化钠介质。
  28. 恢复成像。

2。流式细胞仪测量

  1. 接种5毫升合成培养基中的酵母。
  2. 生长于30℃过夜。
  3. 措施外径600过夜培养的第二天早晨。
  4. 稀释过夜培养在5毫升合成培养基,以OD 600 0.1。
  5. 生长在30℃至少4小时到达外径600 0.2-0.4。
  6. 准备在H 2 O放线菌酮溶液1毫克/毫升
  7. 制备3倍浓缩在合成培养基(0.6 M)的NaCl溶液。
  8. 制备1 1.5mL微管加入100μl的0.6M的NaCl的培养基中对每个时间点进行测量。
  9. 在时间0,加入200μl细胞培养到每个微管。
  10. 孵育振荡在30℃下
  11. 在时间T,加入30微升放线菌酮的微管。
  12. 对于所有想要的时间点重复步骤2.11。
  13. 所有孵育微管至少45分钟,最多3个小时,在30℃振荡。
  14. 准备FACS管400微升PBS。
  15. 超声处理的细胞在水浴中1分钟。
  16. 短暂涡旋微管。
  17. 儿子icate细胞在水浴中放置1分钟。
  18. 短暂涡旋微管。
  19. 加入100μl细胞培养在每个微管到其相应的FACS管。
  20. 选择488 nm激发激光和三十〇分之五百三nm的带通滤波器进行检测。
  21. 测试非表达,充分表达样品,以确认他们是否落在探测器的灵敏度范围。
  22. 测量10,000个细胞的每个样品。

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Representative Results

显微镜

酵母细胞轴承表达式记者p STL1-QV(ySP9 7)被附连到良好的滑动件的底部并在显微镜下放置。将细胞通过加入应力介质的成像会话的过程中刺激直接进入井。这使我们能够通路诱导前获得细胞的一些图片,并按照他们的命运刺激后。在本案中,随访细胞为〜2小时,以10分钟的时间间隔。 图1A是诱导和图1B前非荧光的细胞的图像显示2小时后的应力相同的细胞时,表达报道有被诱导,并已成为荧光。

以提取存在于这些图像的量化信息,一个复杂的图像分析处理,必须执行。它包括细胞的分割到第i定义对象法师,这些对象的跟踪从一帧到下一帧,并为这些对象(形状和强度特性)的特征的测量。我们已经开发了一个名为YeastQuant自己的平台来进行这种分析10。其他一些非商业软件可用来执行这些任务。CellProfiler 11,CELLID 12或CellX 13 图1C显示与YeastQuant进行分析的结果。每个红色迹线代表单个细胞的平均荧光强度随时间的演化。蓝线显示500多个细胞进行分割和跟踪整个五年时间推移电影从来自同一个很好的看法五个不同领域获得的20帧的中位数。淡蓝色区域表示在给定时间点测量所有强度的第25和第75百分位。

流式细胞仪

对于流式细胞术measuremENTS,细胞培养液洒在含压力介质的微管。为了研究在p STL1-QV表达的时间演化,翻译被抑制在不同时间点(5到10分钟的间隔)与放线菌酮( 图2)。这种药物的块合成新的蛋白质,但已表达的荧光蛋白的成熟不被干扰。因此,45分钟至孵育一小时后,该细胞可以在流式细胞仪测定使蛋白质在放线菌酮添加时产生的量的定量。这种策略规避荧光蛋白成熟的问题,以及由此量化的荧光蛋白质合成的真实动态。

这两种技术的比较

图3A比较表达式记者通过显微镜和流式细胞仪的动态。而荧光信号开始上升30-40最小应力与显微镜后,流式细胞仪测量清楚地证明该蛋白质是10至15分钟之间已经产生的刺激之后。这个半小时的延迟是由于荧光蛋白14的缓慢成熟。虽然这两种方法定量的细胞的荧光强度,人们必须牢记,在这种研究中,他们不测量相同的生物学过程。同时,显微镜下的荧光信号的幻影,流式细胞仪实际上是定量的蛋白的合成。重要的是进行活细胞成像时要考虑到这一点成熟的一步。在一个情况下的内源蛋白被标记有荧光的蛋白质,内源性蛋白将表达和活性可以检测其标记的荧光之前。

如上文所示,这两种方法提供补充信息。流式细胞仪可以测量大量细胞的非常迅速(10,000或更多)。因此,它可以提供在两个重叠的群体可以被识别或一些罕见的事件可以观察到统计上丰富的数据集。显微镜提供了对细胞的数目有限(100级)的信息。但是,由于该数据集包含的时间和空间信息,并允许在同一单元多次测量的相关性,它可以提供非常有价值的见解所研究的生物过程。

图1
图1。测量显微镜记者表达。细胞带有荧光表达记者p STL1-QV刺激前用0.2 M氯化钠(B)C试验(A)和2小时的A和B。图片。流感的时间过程 orescence幽灵。红色曲线代表的几个有代表性的单细胞痕迹的平均细胞的荧光强度。蓝色曲线代表的550单细胞痕迹平均荧光。淡蓝色区域表示细胞群的荧光表达在各时间点的第25和第75百分位。 点击这里查看大图

图2
图2。通过流式细胞术报告基因表达的测定。细胞轴承荧光表达记者p STL1-QV用0.2M NaCl和抑制与放线菌酮在不同时间点处理的细胞的荧光直方图。www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

图3
图3。通过显微镜和流式细胞仪的表达动态的比较。荧光强度的平均数A.通过流式细胞术(实线)和显微镜(虚线)测量的时间为3次生物学重复的功能。误差棒代表平均值,B和 120分钟的归一化荧光强度C.直方图的标准误差应力显微镜(B)和应力流式细胞仪(C)三个重复后的60分钟后。 点击这里查看大图。

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Discussion

显微镜

井经ConA的治疗是一个重要的步骤,以确保电池的正确成像。因为刀豆具有低溶解度的在PBS中的(5毫克/毫升)中,过滤过程可以去除大的聚集体存在于未过滤溶液,并干扰成像。细胞相对强烈地附着到被处理的表面和在加入诱导溶液不应妨碍细胞的定位,从而允许连续跟踪之前和之后的刺激。这个处理也可以应用到流动通道或微流体装置进行的细胞进行的恒定流量7,15。如果油井是不正确的处理后用水冲洗,将细胞将不能正确附着在玻璃,大概是因为在ConA的溶液直接结合到细胞中,并防止它们形成在玻璃表面上的强粘合。在洗涤步骤之后,该井可保持干燥3 -在加入细胞前4小时,而不影响显着的细胞至玻璃的结合。

的曝光时间的荧光信道的选择是用于实验的成功的一个关键的设置。由于细胞的荧光将在整个时间推移增加,测试事先与诱导样品是什么,可以用来避免在采集过程中的图像的饱和度的最大曝光时间是很重要的。另一个参数选择曝光时间时要考虑到的是荧光信号的漂白。对于每个样品,就必须找到信号的图像和退化的亮度之间的权衡,由于漂白时间推移过程中。每个采集之间的时间间隔也影响强烈的荧光团的漂白。由于蛋白的表达是​​一个相对缓慢的过程,我们通常使用10-15分钟。间隔。如果其他更快的流程需要为followed在平行于蛋白的表达,它可能是可取的在整个时间间隔短片(开头和5-15分钟后收购1-2分钟),以使用不同的时间步长。

细胞密度的控制是一个重要的参数考虑到。如果密度太低,只有少数细胞将存在于视导致该数据集的统计差的各字段。然而,如果密度过高,则可能会阻碍分割,跟踪和细胞的定量,因此很难从图像中提取所需的信息。以确定的接种密度,一个额外的参数,考虑到是在实验的持续时间。如果实验持续了多个分裂周期,最好是先从视图稀疏字段,将所述成像的时间过程中逐渐填满由于细胞分裂和细胞的溶液中沉淀下来。在协议中,我们建议使用0.02外径600,根据实验,我们执行我们使用外径600 0.05短的时间推移电影以0.005较长的类型。

细胞分析的数量显然在实验的有效性的关键参数。有时少至20-30细胞被组合以生成一个数据集。然而,开始有统计学显著数据集,100个细胞以上的可能是必要的。物镜的放大倍数决定的成像区域的尺寸和成像的细胞,从而数目。用于蛋白质表达的测量,其中的目的是测定细胞的平均荧光,高数值孔径40X油浸物镜是最好的解决方案同时提供良好的信噪比和的大视场。如果亚细胞结构必须被分析,高放大倍率(60X或100X的目标)是经常需要,从而减少电池的测量。 sCMO的来临S摄像机,探测器尺寸比传统的CCD的一个较大的近四倍显然更有优势,获得每场更多的细胞的观点。

用电动XY阶段,有可能在图像的视图平行的多个字段,以增加细胞中的最后数据集的数目。然而,有访问的XY位置的数量和图像采集的速度之间的权衡。取决于该级的速度和记录灯饰的数目,它通常是可行的图像在不到一分钟的10位置上。量化快速信号事件,这可以成为一个限制因素。用于蛋白质表达的测量,其中的荧光变化发生在一个较慢的时间刻度,它通常不是一种限制。或者,因为这些表达实验持续,因为所需要的慢时间分辨率为几个小时,并且它变得有利于并行图像的多个样品。多个相邻井的CAn为接种了野生型和突变型的细胞,不同的刺激可以应用到每个孔或生物学重复可以并行计算。通过从96孔板各孔扫描与常规显微镜屏幕16空中目标实现。由于内源性蛋白在酵母中的低丰度,它们的量化需要具有高数值孔径的油浸物镜。这限制严重,可以与目标可行驶的范围。然而,我们经常像四个相邻井以力求贴近他们共同的角落。然而它是更具挑战性的图像井的数量较多。与自动售货机水的目标可能在亮度轻微损失作为代价,绕过这个问题。

流式细胞仪

收集单元有足够数量几乎与流式细胞仪的一个问题。通常情况下10,000-100,000细胞可以在一分钟内被收购。然而,因为T没有图像他小区被收购,正确选择的细胞群体进行分析是很重要的。基于测得的前向和侧向散射的细胞的门控可以允许选择单个细胞而不是细胞群,并从分析去除细胞碎片。在图2中,每个直方图代表大约5,000个细胞,这是基于测量到的10,000个事件的散射特性选定的人口。

通过破坏细胞簇成单个细胞,细胞培养物超声处理是一个额外的方式来改善获取的数据的质量。这对于显微镜,其中细胞群可以是非常困难的段适当地成立。该步骤的持续时间,必须通过实验测试。我们通常进行两轮超声处理在30秒的水浴中以一分钟后的细胞悬浮液涡旋。延长超声处理可能会导致一些细胞的裂解。然而,我们确实不是Observe的上调胁迫反应基因,由于这个实验的步骤。注意,该细胞的凝集是背景依赖性表型,例如W303细胞显示出强的聚集倾向比S288C细胞。

变异单细胞测量

图3A中 ,平均值和标准误差为通过流式细胞术和显微术进行3次独立实验绘制。产生的三条曲线之间的细微差别的事实,在实验误差都比较小,这些简单的测量,而且许多细胞被测量(超过5000进行流式细胞术,370-550显微镜之间)。在显微镜曲线的时间演化比流式细胞术数据的1平滑。其中一个可能的原因这种行为是在样品制备过程。显微镜,在一个实验中各时间点从相同的压力事件造成,而对于在流式细胞仪中,样品在每个时间点都单独强调。小的变化的应力和培养液的体积可导致在基因表达输出小的差异。一种替代的策略是将强调5ml培养细胞和除去等分试样在所需的时间,以抑制它们与放线菌酮。这两种方法都工作良好,我们使用微管的制备方法,因为它提供更大的灵活性,并且还非常适合的剂量 - 反应曲线,其中多个NaCl的浓度具有沿平行于被测量的测量结果。

在这些平均曲线的低噪音然而,这并不反映在单细胞水平的全方位的变异性。在图3B和3C中,表达的显微镜和流式细胞仪在单个时间点的直方图绘制。这两个面板说明以及一个事实,即重复之间的技术差异是相对小的,ESPECially相比,在个体细胞中的表达中观察到的大的可变性。在显微镜和流式细胞仪测量之间的分布形状的差异源自一个事实,即流式细胞仪的细胞总强度,而在显微镜图像的平均细胞密度计算量化。这后测量出的平均变化细胞的大小,因此导致了窄分布。

这里介绍的两种技术允许定量地研究单个细胞的行为。通常该功能是隐藏在在群体水平上进行传统的生物测量。理解如何在各个单元的响应的变异性的出现可以提供重要的见解生物过程的复杂的调节。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争的财务权益。

Acknowledgments

作者感谢马蒂亚斯彼得和他的小组在生物化学研究所在ETH苏黎世这些方法已被开发的地方。这项工作已经由瑞士国家科学基金会的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base ForMedium CYN6202
CSM amino-acid mix ForMedium DCS0011
Concanavalin A GE Healthcare 17-0450-01
Cycloheximide Fluka Aldrich Sigma C7698 Toxic
ySP9 W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34 pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope Nikon Ti-Eclipse
Microscope control software Micro-manager Ver 1.4.11
Incubation chamber LIS The Box
Fluorescence light source Lumencor SpectraX
Camera Hamamatsu Flash 4.0
Flow cytometer BD FACS calibur
Sonicator bath Telesonic TUC-150
8-well-slide Thermo Lab-tek 155409
96-well-plate Matrical bioscience MGB096-1-2-LG
FACS tube BD Falcon 352054

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References

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