Temporal Kvantifiering av MAPK inducerat uttryck i Single jästceller

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Två kompletterande metoder baserade på flödescytometri och mikroskopi presenteras som möjliggör kvantifiering vid singelcellnivå, av dynamiken i genexpression som induceras av aktiveringen av en MAPK-reaktionsvägen i jäst.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pelet, S., Aymoz, D., Durandau, E. Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells. J. Vis. Exp. (80), e50637, doi:10.3791/50637 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantifieringen av genuttryck vid den enda cellnivå avslöjar nya regleringsmekanismer skyms i mätningar som utförs på befolkningsnivå. Två metoder baserade på mikroskopi och flödescytometri presenteras för att visa hur sådana uppgifter kan förvärvas. Expressionen av en fluorescerande reporter induceras vid aktivering av hög osmolaritet glycerol MAPK-vägen i jäst används som ett exempel. De specifika fördelarna med varje metod är markerade. Flödescytometri mäter ett stort antal celler (10000) och ger ett direkt mått på dynamiken av proteinexpression som är oberoende av den långsamma mognads kinetiken för det fluorescerande proteinet. Avbildning av levande celler genom mikroskopi är däremot begränsad till mätningen av den mognade formen av reportern i färre celler. Däremot kan de datamängder som genereras av denna teknik vara extremt rika tack vare en kombination av flera reportrar och till den rumsliga och tidsmässiga uppgiftererhållas från enskilda celler. Kombinationen av dessa två mätmetoder kan ge nya insikter om regleringen av proteinuttryck genom signalvägar.

Introduction

Signalering via transduktion kaskader ofta kulminerar i uttrycket av proteiner. Karakteriseringen av detta uttryck profil är en viktig del i att förstå funktionen av biologiska banor. Identifieringen av det spektrum av uppreglerad proteiner och dynamiken av deras aktivering kan åstadkommas genom olika tekniker, såsom mikro-arrayer, Northern blöts eller Western blöts 1-3. Emellertid är dessa tekniker i genomsnitt svaret hos en hel population av celler. För att förstå den fina regleringen av uttrycket av proteiner, är det önskvärt att samla mätningar vid enkelcellnivå. Helst bör dessa mätningar också ge kvantitativa data som kan bli föremål för att utveckla matematiska modeller av den underliggande vägen.

Mikroskopi och flödescytometri är två tekniker, som är idealiska för att leverera sådana kvantitativa mätningar encelliga. Den endogena märkning av proteiner med ett fluorescerande protein kan be för att kvantifiera deras uttrycksnivå 4. Eftersom tillsatsen av ett stort fluorescerande grupp vid änden av proteinet kan göra det icke-funktionella, är det ofta mer önskvärt att generera specifika expressions reportrar baserade på en promotor för att driva expression av en fluorescerande konstrukt. Detta reporter protein är exogena till det mobilnät och därför inte påverka signal händelser som äger rum i cellen.

Både mikroskopi och flödescytometri har ofta används inom området jäst signalering. Som exempel; Colman-Lerner och medarbetare korrelerade, i enskilda celler, expressionen av parning specifika och konstitutivt uttryckta reportrar genom mikroskopi för att kvantifiera buller i jästparande signaltransduktion kaskad 5, Acar och kollegor använt flödescytometri för att studera reglerande nätverk kontrollera uttrycket av GAL generna 6. I en tidigare studie 7, har vi använt en combinatiden av dessa två tekniker för att studera uttrycket ut från den höga osmolaritet glycerol (HOG) bana i spirande jäst. Denna mitogen aktiverat proteinkinas (MAPK) vägen utlöses av hyper-osmotisk stress. Det resulterar i aktiveringen av MAPK Hog1 som translokeras till cellkärnan för att inducera en transkriptionsprogram som resulterar i expression av ca 300 gener. För att studera denna process har vi konstruerat en expressions reporter baserad på STL1 promotorn (en gen induceras specifikt som svar på Hog1 aktivitet 8) som driver uttrycket av en fyrdubbel Venus fluorescerande protein (p ​​STL1-qV). Flödescytometri mätningar avslöjade närvaron av två populationer av celler på mellanspänningsnivå (0,1 M NaCl) med endast en del av befolkningen som uttrycker fluorescerande reporter. Vi använde mikroskopi för att ytterligare undersöka detta beteende och upptäckte att detta brus i proteinuttryck styrdes av inneboende faktorer 9. Vi could vidare konstatera att celler med en liknande nivå av Hog1 aktivitet skulle visa påfallande olika uttrycks utfall. Kombinationen av dessa två tekniker tillät oss att visa hur den långsamma ombyggnad stressresponsgener påverkade uttrycket utfallet på enskild cellnivå 7.

I detta dokument använder vi uttrycket av p STL1-qV reporter inducerad av hyper-osmotisk chock som ett exempel på en kvantifiering av proteinuttryck genom mikroskopi och flödescytometri. Samma stam utsattes för 0,2 M NaCl spänningen studerades med båda teknikerna. Detta ger oss möjlighet att lyfta fram några viktiga skillnader mellan dessa två mycket kompletterande tekniker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikroskopi Mätningar

  1. Inokulera 5 ml syntetiskt medium med jäst.
  2. Odla cellerna vid 30 ° C över natten.
  3. Mät OD 600 av natten kulturen nästa morgon.
  4. Späd natten kultur i 5 ml syntetiskt medium till OD 600 0,05.
  5. Odla den utspädda kulturen vid 30 ° C under minst fyra timmar.
  6. Bered 3-faldigt koncentrerad (0,6 M) NaCl-lösning i syntetiskt medium.
  7. Bered en 1 mg / ml lösning av konkanavalin A (ConA) i PBS.
  8. Filtrat ~ 200 l av ConA lösningen i brunnen slide.
  9. Låt stå under 30 minuter.
  10. Ta ConA lösning.
  11. Addera 150 ^ il H2O till brunnen.
  12. Remove H2O
  13. Mät OD 600 av cellodling.
  14. Bered 300 | il av cellkulturen vid OD 600 = 0,02 i ett 1,5 ml mikrorör.
  15. Sonikera cellerna i ett vattenbad under 45 sek.
  16. Vortex kort på milcrotube.
  17. Sonikera cellerna i ett vattenbad under 45 sek.
  18. Vortex kort mikroröret.
  19. Addera 200 pl av cellkulturen till brunnen.
  20. Vänta i 30 min för att låta cellerna sjunka till botten av brunnen.
  21. Placera väl glida på mikroskopet.
  22. Välj belysningsinställningar för den fluorescerande kanal som ska spelas in.
  23. Välj belysningsinställningar för två ljusa fältbilder (en något ofokuserad: 3 ^ m nedanför fokalplanet för att möjliggöra en korrekt segmentering av cellerna).
  24. Välj de tidsintervall för time-lapse mätning
  25. Välj synfälten till bilden.
  26. Starta förvärv av några ramar.
  27. Pausa förvärvet att lägga de 100 ul 0,6 M NaCl-medium.
  28. Återuppta avbildning.

2. Flödescytometri Mätningar

  1. Inokulera 5 ml syntetiskt medium med jäst.
  2. Odla vid 30 ° C över natten.
  3. ÅtgärdOD 600 av natten kulturen nästa morgon.
  4. Späd natten kultur i 5 ml syntetiskt medium till OD 600 0.1.
  5. Odla vid 30 ° C under åtminstone 4 h för att nå ett OD600 av 0,2-0,4.
  6. Förbered cykloheximid lösning 1 mg / ml i H2O
  7. Bered 3-faldigt koncentrerad (0,6 M) NaCl-lösning i syntetiskt medium.
  8. Förbered en 1,5 ml mikrorör med 100 pl 0,6 M NaCl-medium för varje tidpunkt som skall mätas.
  9. Vid tiden 0, tillsätt 200 l av cellodling till varje mikrorör.
  10. Inkubera under skakning vid 30 ° C.
  11. Vid tiden T, tillsätt 30 | il cykloheximid till ett mikrorör.
  12. Upprepa steg 2,11 för alla önskade tidpunkter.
  13. Inkubera alla mikrorör under minst 45 min och upp till 3 h vid 30 ° C med skakning.
  14. Förbered FACS rör med 400 l PBS.
  15. Sonikera cellerna i vattenbad under 1 min.
  16. Vortex kort mikrorören.
  17. Sonicate cellerna i vattenbad under 1 min.
  18. Vortex kort mikrorören.
  19. Tillsätt 100 l cellkultur från varje mikrorör till dess motsvarande FACS rör.
  20. Välj 488 nm excitation laser och 530/30 nm bandpassfilter för detektering.
  21. Testa icke-uttryckande och fullt uttrycka prov för att kontrollera om de faller i detektorn känslighetsområde.
  22. Mät 10.000 celler för varje prov förvärvad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mikroskopi

Jästceller som bär uttrycket reporter p STL1-qV (ySP9 7) fästes till botten av brunnen-slide och placeras under mikroskop. Cellerna stimulerades genom tillsättning av stressen mediet direkt i brunnen under loppet av avbildningssessionen. Detta tillåter oss att skaffa några bilder av cellerna innan vägen induktion och följa deras öde efter stimulering. I förevarande fall, cellerna följdes under ~ 2 h med ett tidsintervall av 10 min. Figur 1A är en bild av icke-fluorescerande celler före induktion och Figur 1B visar samma celler 2 h efter stress när uttrycket reportern har inducerats och har blivit fluorescerande.

För att extrahera den kvantitativa informationen som finns i dessa bilder, har en komplex bildanalysprocess som skall utföras. Det innefattar segmentering av cellerna för att definiera objekt i image, spårning av dessa objekt från en ram till nästa och mätningarna av funktionerna i dessa objekt (form och intensitet egenskaper). Vi har utvecklat en egen plattform som heter YeastQuant att utföra denna analys 10. Några andra icke-kommersiella programvaror finns tillgängliga för att utföra dessa uppgifter. CellProfiler 11, CelllD 12 eller CellX 13 Figur 1C visar resultatet av en analys utförd med YeastQuant. Varje röd spår representerar tidsutvecklingen av den genomsnittliga fluorescensintensiteten hos en enda cell. Den blå linjen visar medianen av mer än 500 celler som segmenterade och spårade hela 20 ramar av fem tidsförlopp filmer som förvärvats från fem olika områden av åsikter från samma brunn. Det ljusblå området representerar den 25: e och 75: e percentilen av samtliga ljusstyrkor som uppmätts vid en given tidpunkt.

Flödescytometri

För flödescytometri measuremföräldrar, var cellkultur spillts i mikrorör innehåller stressmediet. För att studera tidsutvecklingen av p STL1-qV uttryck, var translation inhiberas vid olika tidpunkter (5-10 min mellanrum) med cykloheximid (Figur 2). Detta läkemedel blockerar syntes av nya proteiner, men mognaden av det fluorescerande proteinet redan uttryckt inte störs. Därför, efter 45 min till en timme av inkubering av cellerna kan mätas i flödescytometern tillåter kvantifiering av mängden av protein som produceras vid tidpunkten för cykloheximid tillsats. Denna strategi kringgår problemet med fluorescerande protein mognad och därigenom kvantifierar den verkliga dynamiken i fluorescerande proteinsyntes.

Jämförelse av de två teknikerna

Fig. 3A jämför dynamik uttrycket reporter mätts genom mikroskopi och flödescytometri. Medan den fluorescerande signalen börjar stiga från 30 till 40min efter stressen med mikroskopi, mätningarna flödescytometri visar tydligt att proteinerna redan produceras mellan 10 till 15 minuter efter stimulans. Denna halvtimme förseningen beror på den långsamma mognaden av fluorescerande proteiner 14. Även om båda metoderna kvantifiera fluorescensintensiteten hos cellerna, måste man ha i åtanke att i denna studie, de inte mäter samma biologiska process. Medan följande mikroskopi uppenbarelse av den fluorescerande signalen, flödescytometri faktiskt kvantifierar syntesen av proteinet. Det är viktigt att ta hänsyn till denna mognadssteg när uppträder live-cell imaging. I en situation där ett endogent protein som är märkt med ett fluorescerande protein, kommer det endogena proteinet uttryckas och aktiv innan fluorescensen av dess etikett kan detekteras.

Som angivits ovan, båda teknikerna ger kompletterande information. Flödescytometri kan mäta ett stort antal celler mycket snabbt (10000 eller mer). Det kan därför leverera statistiskt rika datamängder där två överlappande populationer kan identifieras eller några sällsynta händelser kan observeras. Microscopy ger information om ett begränsat antal celler (i storleksordningen 100). Men eftersom denna datauppsättning innehåller tids-och rumsinformation och tillåter korrelation av flera mätningar i samma cell, kan det erbjuda mycket värdefull insikt i den undersökta biologiska processen.

Figur 1
Figur 1. Mätning av reporterexpression genom mikroskopi. A och B. Bilder från celler som bär den fluorescerande uttryck reporter p STL1-qV före (A) och 2 timmar efter stimulering med 0,2 M NaCl (B). C. Tidsförlopp för influensa orescence uppenbarelse. De röda kurvorna representerar den genomsnittliga cellfluorescensintensiteten av några representativa encelliga spår. Den blå kurvan representerar medianen fluorescens av 550 encelliga spår. Det ljusblå området representerar den 25: e och 75: e percentilen av den fluorescerande uttryck av cellpopulationen vid varje tidpunkt. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Mätning av reporter expression genom flödescytometri. Histogram av den cellulära fluorescensen från celler som bär den fluorescerande uttryck reporter p STL1-qV behandlades med 0,2 M NaCl och inhiberades med cykloheximid vid olika tidpunkter.www.jove.com/files/ftp_upload/50637/50637fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Jämförelse av uttrycks mätt genom mikroskopi och flödescytometri. A. Mean av fluorescensintensitet mättes med flödescytometri (heldragen linje) och mikroskopi (streckad linje) som funktion av tiden för tre biologiska replikat. Felstaplarna representerar standardavvikelsen för medelvärdet. B och C. Histogram av den normaliserade fluorescensintensiteten vid 120 min efter stress för mikroskopi (B) och 60 min efter stress för flödescytometri (C) för de tre replikat. Klicka här för attvisa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroskopi

Behandlingen av brunnen med ConA är ett viktigt steg för att säkerställa en korrekt avbildning av cellerna. Eftersom ConA har låg löslighet i PBS (5 mg / ml), gör det möjligt för filtreringsprocessen att avlägsna stora aggregat som är närvarande i den ofiltrerade lösning och interfererar med avbildning. Celler fäster relativt starkt till den behandlade ytan och tillsatsen av det inducerande lösningen bör inte störa lokaliseringen av cellerna, vilket möjliggör en kontinuerlig spårning före och efter stimulans. Denna behandling kan också tillämpas för att strömma kanaler eller mikrofluidikanordningar ades cellerna utsätts för ett konstant flöde 7,15. Om brunnen inte är ordentligt sköljdes med vatten efter behandlingen, kommer cellerna inte fäster ordentligt vid glaset, förmodligen på grund av att ConA i lösning binder direkt till cellerna och förhindrar dem att bilda en stark bindning vid glasytan. Efter tvättningssteget, kan väl vara torrt för 3 -4 h före tillsättning av cellerna utan att påverka märkbart den bindning av cellerna till glaset.

Valet av exponeringstiden för den fluorescerande kanal är en kritisk inställning för framgången av experimentet. Eftersom fluorescens i cellen kommer att öka under hela tidsförlopp, är det viktigt att testa i förväg med en inducerad prov vad är den maximala exponeringstid som kan användas för att undvika mättning av bilderna under förvärvet. En annan parameter att ta hänsyn till när man väljer exponeringstiden är blekningen av den fluorescerande signalen. För varje prov, måste man hitta en kompromiss mellan ljusstyrka och degradering av signalen på grund av blekning under time-lapse. Tidsintervallet mellan varje förvärv påverkar också starkt blekning av fluoroforen. Eftersom proteinuttryck är en relativt långsam process, använder vi oftast 10-15 min. intervall. Om andra snabbare processer måste followed parallellt med proteinuttryck, kan det vara lämpligt att använda olika tidssteg över hela tidsförlopp film (1-2 minuter i början och 5-15 min för senare förvärv).

Styrningen av celldensiteten är en viktig parameter för att ta hänsyn till. Om densiteten är alltför låg, kommer endast ett fåtal celler förekomma i varje synfält resulterar i dåliga statistik för datauppsättningen. Om densiteten är alltför hög, kan det hindra den segmentering, spårning och kvantifiering av celler, vilket gör det svårt att utvinna önskad information från bilderna. För att bestämma såddtäthet, är en ytterligare parameter för att ta hänsyn till varaktigheten av försöket. Om ett experiment varar i flera division cykler, är det lämpligt att börja med en gles synfält som gradvis kommer att fylla under tidsförloppet för avbildning på grund av delning av cellerna och slå sig ner i celler i lösning. I protokollet, föreslår vi att du använderen OD 600 av 0,02, beroende på den typ av experiment vi utför vi använder OD 600 från 0,05 för korta tidsförlopp filmer till 0,005 för längre sådana.

Antalet celler som analyserats är helt klart en viktig parameter för giltigheten av experimentet. Ibland så få som 20-30 celler kombineras för att skapa en datauppsättning. Men för att börja ha statistiskt signifikanta datamängder, hundra celler eller mer är förmodligen nödvändig. Förstoringen av målet avgör storleken på det avbildade området och därmed antalet avbildas celler. För proteinexpressions mätningar, där syftet är att mäta den genomsnittliga fluorescensen av cellen, är en hög numerisk apertur 40X immersionsobjektiv den bästa lösningen som ger både bra signalbrusförhållande och ett stort synfält. Om sub-cellulära strukturer måste analyseras, större förstoring (60x eller 100X mål) är ofta nödvändiga, vilket resulterar i mätningen av färre celler. Tillkomsten av sCMOS-kameror med en detektor storlek nästan fyra gånger större än den konventionella CCD är helt klart en fördel att få fler celler per synfält.

Med en motoriserad XY-scenen, är det möjligt att bilden i parallella flera fält för att öka antalet celler i den slutliga datasetet. Men det är en avvägning mellan antalet XY positioner besökt och hastigheten på bild förvärvet. Beroende på hastigheten på scenen och antalet belysningar registrerats, är det oftast möjligt att bilden tio positioner i mindre än en minut. För att kvantifiera snabba signaleringshändelser, kan detta bli en begränsande faktor. För proteinuttrycks mätningar, där fluorescens förändringar sker i en långsammare tidsskala, är det oftast inte en begränsning. Alternativt, eftersom dessa expressionsexperiment pågå i några timmar och på grund av den långsamma tidsupplösning krävs, blir det fördelaktigt att bild flera prover parallellt. Flera angränsande brunnar can ympas med vildtyp och mutanta celler kan olika stimulus anbringas till varje brunn eller biologiska replikat kan mätas parallellt. Scanning genom alla brunnar från en 96-brunnar rutinmässigt uppnås med luft mål för mikroskopi skärmar 16. På grund av den låga förekomsten av endogena proteiner i jäst, kräver deras kvantifiering ett oljeobjektiv med hög numerisk apertur. Detta begränsar allvarligt intervall som kan reste med målet. Ändå vi rutinmässigt image fyra angränsande brunnar genom att vistas nära deras gemensamma hörn. Det är dock svårare att bilden ett större antal brunnar. Vatten mål med automater kan kringgå detta problem på bekostnad av en mindre förlust i ljusstyrka.

Flödescytometri

Samla tillräckligt många celler är knappast ett problem med flödescytometrar. Normalt 10.000-100.000 celler kan förvärvas i en minut. Men eftersom ingen bild av tHan cell förvärvas, är det viktigt att välja rätt cellpopulationen som skall analyseras. Gating av celler baserat på de uppmätta framåt och sido skingrar kan tillåta att markera enskilda celler snarare än kluster av celler och för att ta bort cellrester från analysen. I figur 2 representerar varje histogram en befolkning på cirka 5.000 celler, som valdes ut baserat på deras spridningsegenskaper från de 10.000 evenemang mätta.

Genom att bryta kluster av celler till enskilda celler, är ultraljudsbehandling av cellodlings ytterligare ett sätt att förbättra kvaliteten på de uppgifter som erhållits. Detta gäller för mikroskopi där kluster av celler kan vara mycket svårt att segmentera korrekt. Varaktigheten av detta steg måste testas experimentellt. Vi utför vanligen två rundor av sonikering i ett vattenbad av 30 sek till en minut följt av virvling av cellsuspensionen. Långvarig sonikering kan leda till lys av ett fåtal celler. Men det gjorde vi inte oÚLJ en uppreglering av stress känsliga gener på grund av detta experimentella steg. Observera att aggregering av cellerna är en bakgrund beroende fenotyp, exempelvis W303 celler visar en starkare tendens att aggregera än S288C celler.

Variationen i enskilda mätningar cell

I figur 3A är medelvärdet och standardavvikelsen för tre oberoende experiment utförda genom flödescytometri och mikroskopi plottas. De mindre skillnader mellan de tre kurvorna härrör från det faktum att de experimentella felen är relativt små för dessa enkla mätningar och att många celler mäts (mer än 5000 för flödescytometri, mellan 370 till 550 för mikroskopi). Den temporala utvecklingen av mikroskopi kurvor är jämnare än en av de flödescytometri data. En trolig orsak till detta beteende är provberedningsprocessen. För mikroskopi, alla tidpunkter i ett experiment följa av samma stressen händelsen, medan det förFACS, provet för varje tidpunkt är stressad individuellt. Små variationer i volymen av de stress-och odlings lösningar kan resultera i en liten skillnad i genuttryck utgång. En alternativ strategi skulle vara att betona 5 ml kultur av celler och avlägsna alikvoter vid önskade tidpunkter för att hämma dem med cykloheximid. Båda metoderna fungerar bra, vi använder mikrorörsframställningsmetoden eftersom det erbjuder mer flexibilitet och är också väl lämpad för mätning av dos-responskurvor där multipla NaCl-koncentrationer måste mätas parallellt.

Den låga brus i dessa genomsnitt kurvor dock inte speglar hela skalan av variabilitet närvarande vid den enda cellnivå. I fig. 3B och 3C, histogrammen för uttrycket som mätts genom mikroskopi och flödescytometri vid en enda tidpunkt plottas. Dessa två paneler illustrerar väl det faktum att de tekniska variationer mellan replikat är relativt små, especially i jämförelse med den stora variabiliteten i expressionen av enskilda celler. Skillnaden i formerna på fördelningen mellan mikroskopi och flödescytometri mätningar uppstår från det faktum att med flödescytometri det totala cellulära intensitet kvantifieras samtidigt i mikroskopiska bilder den genomsnittliga cellulära intensiteten beräknades. Denna senare mätning jämnar ut variationer i cellstorlek och därför resulterar i smalare distributioner.

De två tekniker som presenteras här gör det möjligt att studera kvantitativt beteendet hos enskilda celler. Den här funktionen är oftast gömd i traditionella biologiska mätningar som utförs på befolkningsnivå. Att förstå hur variationen i svaret av enskilda celler framträder kan erbjuda viktiga insikter i komplexa reglering av biologiska processer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna tackar Matthias Peter och hans grupp vid institutionen för biokemi vid ETH i Zürich, där dessa metoder har utvecklats. Detta arbete har fått stöd av den schweiziska National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base ForMedium CYN6202
CSM amino-acid mix ForMedium DCS0011
Concanavalin A GE Healthcare 17-0450-01
Cycloheximide Fluka Aldrich Sigma C7698 Toxic
ySP9 W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34 pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope Nikon Ti-Eclipse
Microscope control software Micro-manager Ver 1.4.11
Incubation chamber LIS The Box
Fluorescence light source Lumencor SpectraX
Camera Hamamatsu Flash 4.0
Flow cytometer BD FACS calibur
Sonicator bath Telesonic TUC-150
8-well-slide Thermo Lab-tek 155409
96-well-plate Matrical bioscience MGB096-1-2-LG
FACS tube BD Falcon 352054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11, (12), 4241-4257 (2000).
  2. de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427, (6972), 370-374 (2004).
  3. Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425, (6959), 737-741 (2003).
  4. Wu, J. -Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310, (5746), 310-314 (2005).
  5. Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437, (7059), 699-706 (2005).
  6. Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435, (7039), 228-232 (2005).
  7. Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332, (6030), 732-735 (2011).
  8. de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23, (1), 229-237 (2003).
  9. Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297, (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, (10), 1274-1282 (2012).
  11. Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7, (10), R100 (2006).
  12. Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
  13. Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. (2012).
  14. Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7, (5), 557-562 (2003).
  15. Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (20), 7165-7170 (2008).
  16. Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7, (9), 690-696 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics