Долгосрочный Потенцирование перфорантных Pathway-зубчатой ​​извилине Synapse в свободно Поступая Мышей

1Department of Engineering and Neuroscience Program, Trinity College
Behavior

Your institution must subscribe to JoVE's Behavior section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Трансгенные и нокаут мышиные модели неврологических заболеваний полезны для изучения роли генов в нормальных и ненормальных нейрофизиологии. В этой статье описываются методики, которые могут быть использованы для изучения долгосрочного потенцирования, сотовый механизм, который может лежать в основе обучения и памяти, в трансгенных и нокаутом свободно себя модели мыши невропатологии.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Blaise, J. H. Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice. J. Vis. Exp. (81), e50642, doi:10.3791/50642 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Исследования долгосрочного потенцирования синаптической эффективности, зависимым от активности синаптической явление со свойствами, которые делают его привлекательным в качестве потенциального сотовой механизм, лежащий обучения и хранения информации, уже давно используются для выяснения физиологию различных нейронных цепей в гиппокампе, миндалине и другие лимбических и корковых структур. Имея это в виду, трансгенные модели мыши неврологических заболеваний представляют полезные платформы для проведения долгосрочного потенцирование (LTP) исследования в целях разработки более глубокое понимание роли генов в нормальных и ненормальных синаптической связи в нейронных сетей, участвующих в обучении, эмоций и информации обработка. В этой статье описываются методики надежно вызывая LTP в свободно ведет себя мыши. Эти методики могут быть использованы в исследовании трансгенных и нокаут свободно себя модели мыши нейродегенеративных заболеваний.

Introduction

Развитие технологии манипулировать генами произвела трансгенных и нокаут модели мыши почти каждый нейродегенеративных и неврологических заболеваний. Это потребовало перевод электрофизиологических методов исследования ранее использованных в больших видов грызунов в животной модели мыши. Один из таких методов нейрофизиологические исследование является использование долговременной потенциации (LTP), чтобы проверить эффективность синаптических соединений в пределах нейронных сетей, вовлеченных в различные нейропатологических расстройств. Этот протокол описывает методы для надежной электрофизиологического исследования LTP в свободно себя мышей. Преимущество этого протокола над другими в том, что это просто и легко осуществить, это также довольно дешевле, так как не требует ни использования дорогих управляемых компьютером Microdrive систем, ни полевой транзистор головкам, и, насколько нам известно, первое видео протокол хронических Электрофизиологические записи то изучить LTP в свободно себя мышей. С этой целью мы описываем в этой статье простые методики изучения долговременную потенциацию в свободно ведут себя мышей. Эти методики могут быть легко переведены на трансгенных и нокаут мышиных моделях нейропатологических расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол подходит для мышей 3 и 18 месяцев и приближенного массы тела 30-50 г). Мыши могут быть получены из Лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). Все хирургические и экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по Тринити-колледж уходу и использованию животных в общем и были в соответствии с Руководством по NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка животных и хирургические процедуры

  1. Подготовка анестезии коктейль, содержащий кетамином (25 мг / мл), ксилазина (2,5 мг / мл) и ацепромазина (0,5 мг / мл). Введите 1 мл / кг массы тела в нижнем правом квадранте брюшной полости, дополненной 0,2 мл / кг инъекций каждые 45 мин после этого, чтобы поддерживать стабильную глубину анестезии с помощью педали вывода рефлекс.
  2. Подготовка наркозом мышь для хирургии после бритья мех на его черепе с помощью электробритвы. Побрился площадь должна включать середину глаз до середины ушей. Убедитесь, что не брить whiskeRS, как они являются частью ствола мыши сенсорной системы.
  3. Используйте ватные тампоны, чтобы применить изопропиловый спирт с последующим Бетадин строганого области по голове. Тогда, также используя ватные тампоны, нанесите небольшое количество минерального масла на глазах, чтобы предотвратить глазные яблоки от высыхания.
  4. Используйте детские манжеты крыса уха вместо обычных баров уха смонтировать голову животного на стереотаксической рамы устройства. Чтобы сделать это, сначала установите левое ухо на левом ухе манжеты. Затем осторожно ослабить правое ухо на правое манжеты, осторожно поддерживая голову животного с одной стороны, и продвижение уха манжеты с другой стороны. Далее, поместите грелку под тела животного и установить его на 86 ° F для поддержания температуры тела.
  5. Затем проверьте двустороннего жесткости, пытаясь переместить головой из стороны в сторону. Животное правильно установлен на стереотаксической рамы, когда головка является жестким и не может быть перемещен из стороны в сторону, но может легко поворачиваться вверх и вниз.
  6. Аккуратно отдохнутьморда мыши на панели нос / зуб сборка убедившись, что резцы отдыхают мягко, но надежно в зубной апертурой баре нос / зуба.
  7. Используя стерильный скальпель, сделать срединный разрез, начиная с середины глаза до середины ушей. Убедитесь, что скальпель состоится под углом 45 ° и применять достаточно давления, чтобы прорваться через основной фасции, но не через череп, как это вызовет чрезмерное кровотечение.
  8. Используйте ватные тампоны, чтобы отделить фасции и подвергать черепа. Череп достопримечательностями брегмы и лямбда должен быть отчетливо виден (рис. 1А). Убедитесь, что животное находится в черепа плоским положение, регулируя бар нос / зуб такой, что брегмы и лямбда достопримечательности находятся на таком же дорсовентральной позиция (DV) (+ 0,1 мм).
  9. Нанесите небольшое количество стерильного физиологического раствора в пораженном участке и использовать ватные тампоны, чтобы аккуратно очистить череп. Затем подождите 2-3 мин для черепа, чтобы полностью высохнуть на воздухепрежде чем продолжить.
  10. Установите иглу на левом стереотаксической руку, чтобы измерить положение DV из брегмы и лямбда. DV позиционирование этих двух ориентиров должно быть в пределах 0,1 мм друг от друга. Если нет, то бар нос стереотаксической рамы можно отрегулировать вверх и вниз, чтобы добиться этого.
  11. Расположите иглу на темени, чтобы записать его передне-задней (AP), боковой (LAT) и дорсовентральных (DV) измерений. Убедитесь, что игла не коснется череп и не проникает его.
  12. Использовать мышь атлас мозга, такие как "мозга мыши в стереотаксической Координаты" 1, для определения координат для целевых структур: медиальной перфорантных пути (MPP) в угловом расслоения и зубчатой ​​извилине (ГД) гиппокампа, относительно лямбда и брегма соответственно (см. также таблицу 1). Затем с помощью тонкой ручкой или карандашом, чтобы отметить эти точки на черепе.
  13. Кроме того, отмечают еще две точки на противоположной стороне черепа. Эти точки шHICH будет служить землю (GND) и опорного (REF) должен быть около 3 мм от средней линии и расположены в продольном направлении относительно друг друга (рис. 1А, также табл. 1).
  14. Снимите игольную маркер от левого стереотаксической руку и заменить его с электрическим бормашины, оснащенного стереотаксической горе. Расположите дрель над каждой отмеченной точке и делать небольшие заусенцев отверстия примерно 0,5 мм в диаметре. Когда бурение, использовать повторяющиеся вверх и вниз движение и проверьте часто имеет ли дрель проникли в череп подвергать поверхность мозга.
  15. Осторожно, но твердо управлять винт электрода (# 0-80 1/8 в крепежных винтов из нержавеющей стали, щелевые Винт) в каждом из контралатеральных отверстия (GND и REF), что они просто коснуться поверхности коры, не проникая его (рис. 1А ). Эти два винтовых электроды служат землю и ссылки.
  16. Mount стимулирующие и записи электроды в электроде держатели на левой и правой стереотаксической оружия, соответственно.
  17. Подключение стимулирующий электрод клеммы для электрофизиологического стимулятора с действующим изоляции и терминалом записи электрода к электрофизиологического дифференциального усилителя (усиление = 1,000, полосовой фильтр = 1 Гц, 3 кГц), а затем цифровой осциллограф для визуального осмотра вызванных ответов. Кроме того, подключить GND и REF электродных выводов для дифференциального усилителя.
  18. Аккуратно и медленно опустите одновременно стимулирующее и записи электроды с шагом 0,5 мм в то время как визуально мониторинга вызванной реакции на раздражитель шока 600-800 мкА. Продолжайте опускать каждый электрод, пока они не достигают соответствующих целевой позиции DV и стереотипное сигнал наблюдается на экране осциллографа (рис. 1В).
  19. После этого используйте зубную акриловый цемент сделать крышку для хранения электродов терминалов в месте, любой зубной цемент, который соприкасается с кожей должен быть стертнемедленно. После того, как зубной цемент полностью вылечить передать животное от стереотаксической рамы на чистую клетку с грызунами. Используйте нагревательную лампу или прокладку для поддержания внутренней температуры.
  20. Монитор животному каждый час, пока он не приходит в сознание. Впрыска флуниксина можно вводить в качестве анальгетика.

2. LTP индукции

  1. Позволяют животному 5-7 дней, чтобы оправиться от операции. Поместите животное в среде записи, состоящей из клетки Фарадея (122 см х 43 см х 43 см), оснащенного звукоизолирующим материалом и вращающимся коммутатора 5-канального соединительного электрода приводит к установке стимулирующим / записи.
  2. Разрешить животное, чтобы акклиматизироваться в течение 1-2 ч в среде записи, прежде чем подключать электроды к стимулирующих и регистрирующих приборов (см. шаг 1,17).
  3. Установите регуляторы стимулятор для вывода 400 мкА и записать амплитуду в среднем на 10 вызвали ответы убедившись тыс.по меньшей мере, 10 сек пройти между стимулами. Используйте метод, показанный на рисунке 1С количественно вызванной реакции. Повторите эту процедуру для 600, 800, 1000, 1200, и 1400 мкА.
  4. Построить ввода / вывода кривую, откладывая среднюю амплитуду вызванной реакции против интенсивности стимула. Из этого графика определения интенсивности стимула, который соответствует 50% от максимальной амплитуды, измеренной. Используйте интенсивность 50% на оставшуюся часть эксперимента.
  5. Затем, используя интенсивность стимула 50%, получить базовые путем записи средняя амплитуда 5 вызвали ответы каждую минуту в течение 15 мин. Снова убедитесь, что по крайней мере 10 сек пройти между стимулами.
  6. Впоследствии доставить тетаническое стимуляции, состоящий из 10 очередей из 10 импульсов, оказываемых на 400 Гц со скоростью серийной съемки 5 Гц до медиальной перфорантного пути. Мониторинг животного тесно признаков захвата, в том числе влажных трясет собак. Если животное имеет захват в ЭксперимЛОР должно быть прекращено и все данные из этого животного должны быть исключены из результатов исследования.
  7. Тогда, продолжать запись средняя амплитуда 5 вызвали ответы каждую минуту в течение 30 мин posttetanization. После этого, сравнить эту амплитуду с базовым амплитуды, полученной на стадии 2.5, вычисляя процентное изменение по сравнению с исходным (рис. 2).
  8. После завершения экспериментов, животное усыпляют с помощью ингаляции изофлурана-метода, который согласуется с Руководящими принципами по эвтаназии Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В таблице 1 приведены координаты для ГД и MPP, используемые в настоящем протоколе рис. 1А показывает маркировку для целевых структур на черепе;.. Также показаны расположение земельных и электродов рис. 1В иллюстрирует представитель вызвала отклик прослеживает как до- и posttetanization в том же животного. Следует отметить, что вызывало ответ posttetanization больше, чем ответ pretetanization что свидетельствует о индукции LTP 2. Рисунок 1C иллюстрирует метод, используемый для количественной оценки амплитуды отклика. Действительно, Рисунок 2 показывает процентное изменение амплитуды отклика за время, конечно, расположенной на обоих периодов предварительного и времени posttetanization. Следует отметить, что пиковые значения LTP превысил 100%. Эти результаты амплитуды усиливается реакция следующей тетанизации показывают, что этот протокол успешной, и поэтому надежны для изучения LTPв свободно ведет себя модели мыши.

Таблица 1
Таблица 1 Координаты. Для целевых структур. Передне-задней (AP) координаты для зубчатой ​​извилине (ГД) и REF даны относительно брегмы а те, для медиальной проводящие пути (MPP) и GND по сравнению с Lambda. Все координаты DV по сравнению с поверхности коры ниже твердой мозговой оболочки.

Фигура
Рисунок 1. Электрод расположение и представительные следы вызванной реакции. A) схематическое изображение взаимного расположения электродов на SKU мышиLL. B) Типичные следы вызванной реакции как до, так и posttetanization. С) алгоритм, используемый для количественного определения амплитуду вызванной реакции.

Рисунок 2
Рисунок 2. LTP в медиальной проводящие пути-зубчатой ​​извилине синапса. Представительство результат LTP индукции в MPP-DG синапса свободно ведет себя мыши. Примечание posttetanic повышение стимуляция вызывала амплитуды отклика индикативного индукции LTP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе, мы продемонстрировали надежный и простой метод для изучения LTP в ГД в свободно ведут себя мышей. Хотя многие исследования LTP в бодрствующих крыс были выполнены 3,4, очень немногие из них были проведены в бодрствующих мышей в первую очередь из-за технической сложности, которую представляет собой ограниченный черепной недвижимости в мышей и вес электродных головкам по отношению к средним весом мыши 5. Несколько исследований, которые продемонстрировали LTP в ГД в свободно себя мышей, используемые либо Microdrive электродные системы или перехода эффект полевой транзистор (JFET) предусилители, интегрированные в headstage который обязательно добавляет к электрод полезной нагрузки бремя для животного 6-10. Значимость настоящего протокола является то, что она представляет собой улучшение по сравнению с существующими методами для индукции LTP в ГД в свободно себя мышей, как это позволяет избежать использования Microdrive электродных систем или headstage JFET По.

Это важTant чтобы выделить критические этапы этого протокола. К ним относятся: 1) крепления головки мыши в стереотаксической рамы таким образом, что это на двусторонней основе жесткой (этот шаг может быть самым трудным, как это требует практики и знакомство с техникой), 2) оптимальное позиционирование электродов, чтобы максимизировать АЧХ можно быть повышена за счет того, что брегма и лямбда находятся в одной плоскости, обычно может быть достигнуто путем регулировки стереотаксической рамы зуба бар такой, что разница в дорсовентральной позиционирования темени и лямбда не больше, чем 0,1 мм, 3) на этапе записи эксперимент, рекомендуется, что животные допускаются время для привыкания к окружающей среде записи, потому что новизна условий съемки может намекать колебания данных вызванной реакции собранных; 4) подходит выбор электродов позволит улучшить качество сигнала и точность: биполярные электроды ( из нержавеющей стали для подкожных трубка с 0,2 мм нержавеющей сталипровод вставка с отрывом кончика 0,5 мм) являются предпочтительными для стимулирования в то время как монополярные электроды (один провод нить вольфрама epoxylite изоляцией) используются для записи в нервной ткани и 5) мыши могут быть под наркозом с помощью внутрибрюшинного введения смеси кетамина (25 мг / мл), ксилазина (2,5 мг / мл) и ацепромазин (0,5 мг / мл). Этот анестетик смесь затем следует вводить в дозировке 1ml/kg который обычно эффективны в течение примерно 20 мин, дополненных 0,2 мл / кг каждые 45 мин для поддержания стабильной глубины анестезии.

Есть несколько ограничений этого протокола, которые несут упоминания. Этот протокол не дает представление о механизмах ионного канала или синтеза белка рецептора, которые могут subserve LTP. Поэтому скудная информация доступна относительно фактической численности нейронов в популяции будет записано. Другим ограничением является то, что, так как вызванные ответы собираются в бодрствующих животных трудно ascertайн и анализировать вне влияние таких факторов, как стресс, обращения, или загрязнения записанного сигнала по ложному сенсомоторной деятельности. Эти ограничения могут быть преодолены путем обеспечения того, вызвали ответы записываются только когда животное, но неактивным оповещения государство, иначе известный как спокойном состоянии бодрствования бдительности.

Тем не менее, способы, описанные в данном протоколе обеспечить наиболее физиологически соответствующую платформу для исследования электрической активности головного мозга основную поведение. После шаги, описанные в данном протоколе, любая структура мозга могут быть направлены с помощью необходимых координат, данное атласа мозга мыши 1. Важно отметить, что взрослой крысы стереотаксической рамы могут быть использованы в мышах при условии, что подходит младенец крыса уха манжеты используются вместо обычных стержней уха. В тумаки уха будет обездвижить голову, не повреждая уши мыши. Наконец, методики, представленные здесь, могут быть readilу переведены на электрофизиологических исследований в трансгенных и моделей нокаутом мыши хозяина неврологических расстройств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы выразить признательность следующим образом: д-р Джозеф Бронзино, доктор Хамис Абу-Hassaballah г-RJ Остин-LaFrance, и г-жа Джессика Koranda.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine (100 mg/ml) Henry Schein 10177
Xylazine (20 mg/ml) Henry Schein 33197
Acepromazine (10 mg/ml) Henry Schein 2177
Dental acrylic powder Lang Dental Manufacturing Co. 1330CLR
Dental acrylic liquid Lang Dental Manufacturing Co. 1306CLR
Tungsten wire (0.127 mm) World Precision Instruments TGW0515
Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) World Precision Instruments 832400
Flunixin (50 mg/ml) Henry Schein 14165
Epoxilyte Superior Essex EP 6001-M
Stainless steel wire insert (0.2 mm) World Precision Instruments 792900
Stereotaxic frame apparatus Kopf Instruments Model 902
Ear cuffs (ear cups) Kopf Instruments Model 921
Electrophysiological stimulator Astro-Med, Inc. S88
Digital oscilloscope B K Precision Corp. 2542
Current isolation unit Astro-Med, Inc. PSIU-6
Differential amplifier World Precision Instruments, Inc. DAM-50
Commutator Plastics One SLC6
Dental drill Stoelting 58650

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
  2. Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
  3. Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
  4. Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
  5. Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
  6. Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
  7. Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
  8. Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
  9. Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
  10. Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics