उच्च संकल्प पूरा पर्वत
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

zebrafish, एक छोटे से उष्णकटिबंधीय मछली, हड्डीवाला विकास और बीमारी के दौरान जीन समारोह के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल बन गया है. लक्ष्य जीन के अस्थायी और स्थानिक अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित किया जा सकता है

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

यह लेख zebrafish भ्रूण की स्वस्थानी संकरण (इच्छा) में पूरे माउंट पर केंद्रित है. इच्छा प्रौद्योगिकी ऊतक वितरण और विकास मंच के मामले में दोनों जीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन की सुविधा. प्रोटोकॉल digoxigenin के साथ लेबल antisense शाही सेना जांच का उपयोग zebrafish भ्रूण की इच्छा के उपयोग के लिए वर्णित हैं. जांच क्लोन और linearized गया है कि जीन टेम्पलेट्स के इन विट्रो प्रतिलेखन में के माध्यम से digoxigenin से जुड़े न्यूक्लियोटाइड शामिल द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. परिभाषित विकास के चरणों में काटा भ्रूण की chorions विशिष्ट जांच के साथ ऊष्मायन से पहले हटा रहे हैं. अतिरिक्त जांच को दूर करने के लिए एक कपड़े धोने की प्रक्रिया के बाद भ्रूण alkaline फॉस्फेट के साथ संयुग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी के साथ incubated हैं. Alkaline फॉस्फेट के लिए एक वर्णजनक सब्सट्रेट काम करके, विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति का आकलन किया जा सकता है. जीन अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है कि इस पूरी प्रक्रिया में 2-3 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है.

Introduction

zebrafish (Danio rerio) हड्डीवाला विकास, रोग, व्यवहार के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल के रूप में उभरा है, और में दवा स्क्रीनिंग 1-3 की है. Zebrafish भ्रूण एक भी पार से बड़ी संख्या में प्राप्त किया जा सकता है. निषेचन और विकास पूर्व utero और ऑप्टिकली स्पष्ट भ्रूण तेजी से विकसित होता है. गंभीर विकासात्मक घटनाओं के पहले 48 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के दौरान होते हैं. इस अंग primordia की उपस्थिति और cytodifferentiation की दीक्षा भी शामिल है. प्रोटीन की पछाड़ना या अधिक अभिव्यक्ति antisense morpholino (एमओ) oligonucleotides के साथ भ्रूण के microinjection के माध्यम से हासिल की या एक या दो सेल मंच (0.75 HPF) में क्रमशः mRNA किया जा सकता है.

Zebrafish भ्रूण की इच्छा हित के विशिष्ट जीन की spatio-अस्थायी अभिव्यक्ति के अध्ययन की सुविधा. इच्छा तकनीक के अनुप्रयोग पर-expr को mRNA या एमओ के साथ भ्रूण के microinjection का पालनईएसएस या पछाड़ना विशिष्ट प्रोटीन का स्तर अन्य जीनों के अंतर विनियमन का पता चलता है.

जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में परिवर्तन प्ररूपी परिवर्तन के साथ सहसंबद्ध और जल्दी जीवोत्पत्ति के दौरान लक्ष्य जीन के समारोह को प्रकट किया जा सकता है. जांच के लिए तैयार है और अग्रिम में संग्रहित किया जा सकता है, ISH तकनीक छह अच्छी तरह प्लेटें और कस्टम बनाया टोकरी का उपयोग कर एक बार में कम से कम 20 जीन के लिए जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रकट करने के लिए लागू किया जा सकता है.

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Protocol

1. Zebrafish भ्रूण की स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट

भ्रूण के 1.1 तैयारी

  1. अपेक्षित विकास के चरणों में भ्रूण लीजिए. भ्रूण चरण के विवरण के लिए किमेल एट अल. 5 देखें.
  2. मैन्युअल संदंश (ड्यूमॉन्ट Watchmakers नहीं. 5 संदंश) का उपयोग chorions निकालें.
  3. पीबीएस में बना हुआ paraformaldehyde के एक 4% समाधान (पीएफए) में भ्रूण फिक्स 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात (फास्फेट खारा buffered)
  4. 3x कम से कम कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए पीबीएस के साथ भ्रूण धो लें.
  5. स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट सहित तकनीकों के भविष्य के आवेदन के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर 100% मेथनॉल (MeOH) में स्टोर भ्रूण.
  6. रुक -80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना निकासी और दुकान के लिए तरल नाइट्रोजन में भ्रूण का मंचन
  7. मंचन भ्रूण से शाही सेना निकालें और पीसीआर प्रवर्धन और बाद क्लोनिंग के लिए सीडीएनए synthesize.
  8. Digoxygenin लेबल शाही सेना जांच के 1.2 संश्लेषण

    1. जांच टेम्पलेट के लिए पीसीआर प्रवर्धन और जीन क्लोनिंग. तालिका 1 में दिखाया के रूप में 50 μl की कुल मात्रा के साथ सेटअप पीसीआर प्रतिक्रिया. अधिक डीएनए जीनोमिक या टेम्पलेट के रूप में पीसीआर प्रतिक्रिया में कम सीडीएनए का प्रयोग करें. 72 पर 10 मिनट के विस्तार का समय शामिल डिग्री सेल्सियस पीसीआर प्रतिक्रिया उत्पादों TOPO क्लोनिंग की सुविधा के क्रम में adenylated पूरी लंबाई और 3 'कर रहे हैं कि सुनिश्चित करने के लिए अंतिम चक्र के बाद.
    अभिकर्मक खंड
    टेम्पलेट डीएनए 100 एनजी
    पीसीआर बफर (10x) 5 μl
    dNTPs (10 मिमी) 2 μl
    प्राइमर (10 मिमी) 1 माइक्रोन प्रत्येक
    के अंतिम मात्रा करने के लिए पानी जोड़ें 49.7 μl
    Taq पोलीमरेज़ (5 इकाई / & #956, एल) 0.3 μl
    रिएक्शन वॉल्यूम 50 μl

    तालिका 1. पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया.

    1. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करते हुए पीसीआर उत्पाद के आकार की जाँच करें. जांच के संश्लेषण के लिए पीसीआर उत्पाद की अनुमानित आकार 1 केबी के करीब है.
    2. बाँझ शर्तों के तहत प्रयोग के बाहर ले जाने और nuclease मुफ्त पानी का उपयोग करके nuclease संक्रमण से बचने के लिए विशेष ध्यान रखना. कई उत्पादों को मनाया जाता है कि घटना में, TOPO टीए क्लोनिंग किट का उपयोग क्लोनिंग के साथ आगे बढ़ने से पहले उचित आकार पीसीआर उत्पाद जेल शुद्ध. Smearing के और कई बैंड की उपस्थिति को खत्म करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया का अनुकूलन.
    3. तालिका 2 में संकेत के रूप में TOPO क्लोनिंग प्रतिक्रिया प्रदर्शन. TOPO वेक्टर और पीसीआर उत्पाद मिश्रण है और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    अभिकर्मक रासायनिक सक्षम कोशिकाओं इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं ताजा पीसीआर प्रतिक्रिया उत्पाद 1-4 μl 1-4 μl नमक समाधान 1 μl पतला नमक समाधान 1 μl पानी 5 μl की मात्रा कुल करने के लिए ऊपर 5 μl की मात्रा कुल करने के लिए ऊपर TOPO वेक्टर 1 μl 1 μl अंतिम वॉल्यूम 6 μl 6 μl

    तालिका 2. TOPO क्लोनिंग प्रतिक्रिया.

    1. एक शॉट सक्षम कोशिकाओं में TOPO क्लोनिंग उत्पाद परिचय / शामिल. टीउसकी प्रक्रिया परिवर्तन कहा जाता है.
    2. एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों की अभिव्यक्ति को सुनिश्चित करने के लिए 260 rpm पर कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बदल कोशिकाओं सेते हैं. प्लेट prewarmed Luria Bertani (पौंड) 50 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन और एक्स लड़की युक्त अगर प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण (50-100 μl). 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
    3. सफेद या हल्के नीले रंग की कालोनियों की उपस्थिति के आधार पर डालने की उपस्थिति का निर्धारण करते हैं. TOPO वेक्टर β-galactosidase encodes जो lacZ जीन होते हैं. एक्स लड़की की उपस्थिति में, β-galactosidase का उत्पादन नीले रंग रूपों. कार्यात्मक β-galactosidase और सफेद कालोनियों के गठन को बाधित प्लाज्मिड में ligated डीएनए उत्पादित कर रहे हैं. व्हाइट कालोनियों या हल्के नीले रंग की कालोनियों डालने की उपस्थिति की पुष्टि.
    4. बाँझ विंदुक युक्तियाँ का उपयोग अगर थाली से सफेद कालोनियों उठाओ और मिलाते incuba में 37 पर लेग मीडिया और संस्कृति के 4 मिलीलीटर युक्त बाँझ 10 मिलीलीटर ट्यूब डिग्री सेल्सियस में उन्हें जगह200 rpm पर रातोंरात टो.
    5. निर्माताओं अनुदेश के अनुसार प्लास्मिड डीएनए किट का उपयोग प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध.
    6. डालने के लिए 3 '(भावना जांच के लिए) या 5' (antisense जांच के लिए) स्थित एक अद्वितीय साइट है कि उचित प्रतिबंध एंजाइम के साथ हर जांच के लिए सीडीएनए के 5 ग्राम पचा द्वारा सीडीएनए निम्नलिखित प्लाज्मिड शोधन Linearize.
    7. क्लोरोफॉर्म / फिनोल निष्कर्षण विधि का उपयोग linearized डीएनए शुद्ध. 4 पर 13,000 rpm पर 3 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए, 30 सेकंड के लिए सख्ती शिखर, क्लोरोफॉर्म / फिनोल स्पिन के बराबर मात्रा में जोड़ें साफ ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण और क्लोरोफॉर्म के बराबर मात्रा में जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 rpm पर 3 मिनट के लिए स्पिन साफ ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण स्थानांतरण. रात भर के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर वेग डीएनए और दुकान से 10% सोडियम एसीटेट (एम 3) और 100% इथेनॉल के 2.5x मात्रा में जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 rpm पर 15 मिनट के लिए स्पिन इथेनॉल निकालें और 75% इथेनॉल के साथ गोली धोने. प्रोटोकॉल रोका जा सकता है और डीएनए सेंट किया जा सकता है-20 डिग्री सेल्सियस पर ored और अगले दिन फिर से शुरू किया. 4 डिग्री सेल्सियस से कम 10,000 rpm पर 10 मिनट के लिए स्पिन ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए गोली सूखी. 20 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर DEPC इलाज पानी और सेते के 10 μl में गोली Resuspend. यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए एकाग्रता यों.
    8. 1% agarose जेल पर डीएनए की 1 μl का उपयोग करते हुए और लगभग 30 मिनट के लिए चल agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पवित्रता का आकलन करें.
    9. शाही सेना लेबलिंग प्रतिक्रिया सेट करें. एक RNase मुक्त प्रतिक्रिया शीशी का उपयोग करना, 13 μl की एक मात्रा को DEPC इलाज, दोहरा आसुत जल बाँझ, RNase मुक्त करने के लिए टेम्पलेट डीएनए शुद्ध 1-5 ग्राम जोड़ें. बर्फ पर प्रतिक्रिया शीशी शांत रहो और (3 टेबल देखें) निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़ें:
    अभिकर्मक खंड
    एनटीपी लेबलिंग मिश्रण (10x) 2 μl
    ट्रांसक्रिप्शन शौकीनएर (10x) 2 μl
    रक्षा RNase अवरोध 1 μl
    शाही सेना पोलीमरेज़ SP6 या
    शाही सेना पोलीमरेज़ T7 2 μl
    अंतिम वॉल्यूम 20 μl

    तालिका 3. शाही सेना लेबलिंग प्रतिक्रिया.

    1. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2000 rpm पर संक्षिप्त centrifugation द्वारा तल पर जमा है और 37 पर 2 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेते धीरे फिर अभिकर्मक मिश्रण डिग्री सेल्सियस
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 2 μl RNase मुक्त DNase मैं सेते जोड़कर टेम्पलेट डीएनए निकालें और 2 μl 0.2 एम EDTA (8.0 पीएच) जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो.
    3. 2.5 μl 4 एम LiCl और 75 μl 100% इथेनॉल जोड़कर प्रतिक्रिया उत्पादों वेग. समाधान मिश्रण और 45 मिनट ओ के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखनाआर -20 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस से अधिक रात और प्रोटोकॉल अगले दिन फिर से शुरू किया.
    4. 2 मिनट के लिए सूखी एक और 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस, अपकेंद्रित्र में संग्रहीत 500 μl 70% इथेनॉल के साथ गोली धोने, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 rpm पर 30 मिनट के लिए निलंबन अपकेंद्रित्र, और 50 μl और सेते में resuspend 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट पर
    5. लगभग 30 मिनट के लिए 1% agarose जेल पर 1-2 मिलीलीटर चलाकर जांच की गुणवत्ता और अखंडता को सत्यापित करें. इस जेल पर उम्मीद आकार में चल रहे एकल उत्पाद की उपस्थिति की पुष्टि की है.
    6. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग शाही सेना की मात्रा को मापने के द्वारा जांच की एकाग्रता यों. इस प्रतिक्रिया से उपज शाही सेना की 10 ग्राम (μl / 100-200 एनजी) के बारे में है.

    स्वस्थानी संकरण में 1.3 साबुत माउंट

    1. दिन 1
      1. पुनर्जलीकरण
        1. नायलॉन जाल (कम से कम 1 मिमी ताकना आकार) और Eppendorf ट्यूबों का उपयोग कर बास्केट तैयार करें. Cuttin द्वारा टोकरी निर्माणजी Eppendorf ट्यूबों (1.5 मिलीलीटर) शंक्वाकार सिरों को दूर करने के लिए. व्यक्तिगत बास्केट अलग रंग ट्यूब का उपयोग पहचान और शीर्ष निकालने के लिए उनमें से आधे से रिम्स.
        2. Eppendorf ट्यूबों की कटौती समाप्त होता है को कवर करने के लिए नायलॉन जाल के छोटे टुकड़े काटें. एक धूआं हुड में एक बिजली के गर्म प्लेट (उच्च करने के लिए माध्यम के बीच सेट) पर उन्हें हीटिंग द्वारा नायलॉन जाल के लिए ट्यूब की कटौती समाप्त होता है रहो. एक बार ठंडा टोकरी से अतिरिक्त नायलॉन जाल को हटाने और कमरे के तापमान पर 100% मेथनॉल में स्टोर.
        3. 100% द्वारा पीछा छह अच्छी तरह से प्लेटों के पहले तीन कुओं का उपयोग कर पीबीएस में मेथनॉल की लगातार dilutions के (75% [/ खंड खंड [मेथनॉल, 50% [/ खंड खंड] मेथनॉल और 25% [/ खंड खंड] मेथनॉल) तैयार करें PBST (फॉस्फेट 0.1% बीच 20 युक्त नमक बफर) अगले तीन कुओं में.
        4. सीटू Figurea 1 क और के रूप में दिखाया कस्टम मेड बास्केट प्रयोग संकरण प्रक्रिया में के अधीन रहते हुए भ्रूण. Hybridiza को RNase मुक्त समाधान का प्रयोग करें6 अच्छी तरह प्लेटें में मोर्चे कदम (4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से). इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, अच्छी तरह से पहले के 6 बास्केट अप करने के लिए जगह है. रिम के साथ जगह टोकरी पहले लगातार की व्यवस्था अलग अलग रंग में रिम्स के बिना टोकरी द्वारा पीछा किया. ऊपर 6 जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के लिए इस व्यवस्था का उपयोग करते हुए एक साथ निर्धारित किया जा सकता है.
        5. एक ही टोकरी (चित्रा 1 देखें) के लिए एक ही विकास मंच के निर्जलित भ्रूण रखें.
        6. छह अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से एक से दूसरे (प्रत्येक चरण के लिए 5 मिनट) को टोकरी ले जाकर भ्रूण rehydrate. उचित बफर से भरा छह कुओं का प्रयोग करें. भ्रूण एक बार प्रत्येक कमजोर पड़ने के अधीन हैं. इस तरह भ्रूण 6x, 5 मिनट / धो धो रहे हैं. निर्जलित भ्रूण की पुनर्जलीकरण और फिर 100% PBST के साथ 3x धोने से पीबीएस के साथ मेथनॉल जगह से हासिल की है.
      2. तालिका 4 में दिखाया गया है permeabilization डाइजेस्ट कमरे के तापमान पर proteinase कश्मीर (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ rehydrated भ्रूण पारगम्य उन्हें प्रस्तुत करने के लिए भ्रूण स्टेज (घंटे के बाद निषेचन) पाचन अवधि (proteinase कश्मीर) ऊपर 6 से 15 सेकंड 6-12 30 सेकंड 12-18 3 मिनट 24 12-15 मिनट 48 25-30 मिनट 72 40 मिनट 96-120 50 मिनट

        तालिका 4. Permeabilization प्रतिक्रिया.

      3. Postfixation और PBST Washes
        1. 20 मिनट के लिए 1x पीबीएस में 4% paraformaldehyde (भार / खंड) में incubating द्वारा भ्रूण को ठीक करें.
        2. भ्रूण 3x धोने से अवशिष्ट paraformaldehyde निकालें, 5 1x PBST में न्यूनतम / धोने,.
        </ ली>
      4. एसिटिलीकरण 10 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार एसिटिलीकरण मिश्रण (10 एमएल DDH 2 हे में 125 μl triethanolamine और 27 μl एसिटिक एनहाइड्राइड) और सेते भ्रूण तैयार करते हैं. जरूरत पड़ने पर अंतर्जात फॉस्फेट गतिविधि को कम करने के लिए, ताजा एसिटिलीकरण मिश्रण तैयार करते हैं. अतिरिक्त अभिकर्मक निकालने के लिए, (10 मिनट / धोने) PBST में दो बार भ्रूण धोने
      5. Prehybridization 1.5 मिलीलीटर बाँझ Eppendorf ट्यूबों को टोकरियों से भ्रूण के हस्तांतरण और एक 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 2-4 घंटे के लिए 200 μl संकरण मिश्रण के साथ incubating द्वारा भ्रूण Prehybridize.
      6. एंटीबॉडी के Preadsorption टोकरी से लगभग 50 भ्रूण निकालें और एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ Eppendorf ट्यूबों को हस्तांतरण. अवरुद्ध बफर का उपयोग कर विरोधी डीआईजी एपी (1:500) प्रतिरक्षी (1x PBST, 2% बछड़ा सीरम [/ खंड खंड], 2 मिलीग्राम / एमएल गोजातीय सीरम albumin [बीएसए]) 2-4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर, साथ सेते और फिर 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर दुकान. एक सुबह में इनक्यूबेटर से निकालेंघ भ्रूण कमरे के तापमान तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं.
      7. संकरण prehybridized भ्रूण को जांच के 100-200 एनजी जोड़ें और 70 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में.
    2. 2 दिन
      1. एसएससी (खारा सोडियम साइट्रेट) Washes
        1. संकरण मिश्रण की जगह 50 मिलीलीटर ट्यूब (एचएम), एक 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पानी और कम से कम 20 मिनट के लिए उन्हें prewarm साथ एक बीकर में 2x एसएससी और 0.2x एसएससी. जांच युक्त संकरण प्रतिक्रिया मिश्रण निकालें, ट्यूब के लिए prewarmed संकरण मिश्रण का 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए और 70 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस अतिरिक्त अभिकर्मकों दूर करने के लिए 25% एचएम को 50% से 100% एचएम जगह से 2x एसएससी में prewarmed एचएम के विभिन्न dilutions के साथ छह अच्छी तरह प्लेटें भरें.
        2. इंतजार करते हुए, washes के लिए 2x एसएससी के साथ छह अच्छी तरह से प्लेटों को भरने और 70 में उन्हें रखने डिग्री सेल्सियस
        3. 15 मिनट जगह बाद टोकरी के लिए ट्यूब से भ्रूण कमजोर पड़ने से भरा छह अच्छी तरह से थाली में रखा2x एसएससी साथ एचएम की है और अगले (एक 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिनट प्रत्येक) के लिए अच्छी तरह से एक से टोकरी ले जाकर संकरित भ्रूण धो लो. 70 पर 100% 2x एसएससी में भ्रूण 2x, 15 मिनट / धो, धो डिग्री सेल्सियस
        4. 65 में एक और पानी के स्नान डिग्री सेल्सियस सेट उच्च तंगी के लिए 0.2x एसएससी के साथ छह अच्छी तरह प्लेटें भरें जांच के साथ प्रतिलेख के अविशिष्ट संकरण से बचने के लिए washes.
        5. भ्रूण 70 में 2x एसएससी के साथ दो बार धोया जाता है के बाद डिग्री सेल्सियस, 65 में 0.2x एसएससी में एक और दो 30 मिनट washes के पालन डिग्री सेल्सियस
      2. PBST Washes निम्नानुसार PBST में 0.2x एसएससी की लगातार dilutions के साथ छह अच्छी तरह प्लेटें तैयार: 75% (/ खंड खंड) 0.2x एसएससी, 50% (/ खंड खंड) 0.2x एसएससी, 25% (/ खंड खंड) 0.2x एसएससी, और शेष दो कुओं 100% PBST के साथ. (एक घुमाव का उपयोग कर कमरे के तापमान पर प्रत्येक चरण के लिए 5 मिनट) अच्छी तरह से एक से दूसरे को टोकरी ले जाकर संकरित भ्रूण धो लें.
      3. Blo में कमरे के तापमान पर 3-4 घंटे के लिए Preincubation Preincubate भ्रूणcking बफर (1x PBST, 2% बछड़ा सीरम [/ खंड खंड], 2 मिलीग्राम / एमएल बीएसए).
      4. ° सी कोमल आंदोलन के साथ 4 में रात अवरुद्ध बफर में विरोधी डीआईजी एपी एंटीबॉडी (1:5,000) के एक समाधान के साथ विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी सेते भ्रूण के साथ ऊष्मायन.
    3. दिन 3
      1. PBST Washes अच्छी तरह से 4 मिलीग्राम / PBST के साथ छह अच्छी तरह प्लेटें तैयार. 15 मिनट की अवधि के लिए 6x PBST युक्त छह अच्छी तरह से थाली में टोकरी ले जाकर incubated भ्रूण धो लें. भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रोटोकॉल अगले दिन फिर से शुरू किया जा सकता है.
      2. BCIP की उपस्थिति (5 ब्रोमो-4-क्लोरो 3 indolyl फॉस्फेट) और एनबीटी (nitroblue tetrazolium) में ऊष्मायन से पहले कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर बफर prestaining के साथ 15 मिनट के लिए 2x धोने से भ्रूण Prestain Prestaining. BCIP और एनबीटी alkaline फॉस्फेट गतिविधि का रंग विकास के लिए इस्तेमाल किया substrates हैं. जांच क्षारीय फॉस्फेट वें के साथ जुड़े होते हैं के बाद सेबैंगनी रंग की ई विकास लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति को इंगित करता है. भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और प्रोटोकॉल अगले दिन फिर से शुरू किया जा सकता है.
      3. धुंधला हो जाना
        1. 30 मिनट के लिए BCIP और एनबीटी के साथ अंधेरे में कमरे के तापमान पर भ्रूण सेते हैं.
        2. धुंधला प्रतिक्रिया एक stereomicroscope का उपयोग हर 30 मिनट पर निगरानी रखें. रिएक्शन बार जीन अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर 15 मिनट, 16 घंटा से बदलती हैं. रिएक्शन बार कमजोर व्यक्त जीनों के लिए अत्यधिक व्यक्त जीनों के लिए कम और लंबे समय तक रहे हैं. ब्याज की जीन पूरक antisense (एएस) टेप व्यक्त अगर नब्ज जांच संकेतों का पता लगाने जाएगा.
      4. वांछित धुंधला तीव्रता के बाद बंद रिएक्शन तक पहुँच जाता है, स्थान पर समाधान (1x पीबीएस, पीएच 5.5, 1 मिमी EDTA, 0.1% के बीच) युक्त कुओं को भ्रूण युक्त टोकरी स्थानांतरित द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो. इस रंग के आगे विकास से बचना होगा. कोमल एजी के साथ एक घुमाव पर 10 मिनट 2x के लिए भ्रूण कुल्लाकमरे के तापमान पर itation.
      5. Postfixation
        1. 20 मिनट के लिए पीबीएस में paraformaldehyde के 4% (भार / खंड) में भ्रूण सेते हैं.
        2. अवशिष्ट paraformaldehyde के हटाने के लिए PBST के साथ भ्रूण (5 मिनट / धोने) तीन बार धोएं. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में बंद समाधान में तय भ्रूण स्टोर
      6. , बढ़ते अवलोकन, और छवि अधिग्रहण
        1. पीबीएस के न्यूनतम संभव मात्रा का उपयोग कर 100% ग्लिसरॉल युक्त एक छह अच्छी तरह से थाली करने के लिए भ्रूण स्थानांतरण. एक घुमाव पर छह अच्छी तरह से थाली प्लेस और धीरे अंधेरे में कमरे के तापमान पर रातोंरात आंदोलन.
        2. 100% ग्लिसरॉल में भ्रूण रखें और फिर एक stereomicroscope के तहत संकेत निरीक्षण करते हैं.
        3. छवियाँ मोल और झगड़ा फ़ाइल स्वरूप या ऐसे फ़ोटोशॉप (आंकड़े 3-6) के रूप में छवि सॉफ्टवेयर के उपयोग के माध्यम से उच्च गुणवत्ता छवियों का उत्पादन परमिट है जो किसी भी अन्य प्रकार के रूप में बचाने के लिए.

    मैं n स्वस्थानी संकरण

    1. डबल हासिल करने के लिए 1.1 से ऊपर वर्णित विधि लेबलिंग - 1.3.1.7 इस्तेमाल किया लेकिन संकरण दौरान digoxygenin और fluorescein लेबल जांच दोनों के एक साथ ऊष्मायन भी शामिल है.
    2. पोस्ट संकरण अर्थात् एसएससी और PBST धोने (कदम 1.3.2.1 और 1.3.2.2) और अवरुद्ध incubations (कदम 1.3.2.3) washes के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें. क्रमिक रूप से नीचे के रूप में वर्णित एंटीबॉडी और धुंधला प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन करना.
    3. 4 में एपी युग्मित विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी (1:5,000) ° कोमल आंदोलन के साथ सी के साथ भ्रूण सेते हैं.
    4. धो और BCIP-एनबीटी (कदम 1.3.3.1 - 1.3.3.6) के साथ सेते हैं.
    5. पता लगाने के बाद 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर PBST के साथ दो बार भ्रूण धो लो.
    6. विरोधी digoxigenin एंटीबॉडी निष्क्रिय करने के लिए 30 मिनट के लिए 1 मिमी EDTA के साथ 65 ° PBST में सी में भ्रूण सेते हैं.
    7. 75%, 50%, और 25% मेथनॉल बुद्धि में पुनर्जलीकरण द्वारा पीछा 100% मेथनॉल में भ्रूण सेते1 घंटे के लिए PBST को वापस ज PBST और.
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ अवरुद्ध बफर में एपी युग्मित fluorescein (1:2,000) के साथ रातोंरात भ्रूण सेते हैं.
    9. PBST (कदम 1.3.3.1) और 2 बार पूर्व धुंधला बफर के साथ 15 मिनट के लिए पूर्व दाग भ्रूण के साथ भ्रूण धो तेज लाल की उपस्थिति में पूर्व ऊष्मायन के लिए कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर (0.1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 8.2) . प्रोटोकॉल रोका जा सकता है और भ्रूण को संग्रहित किया जा सकता 4 डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ हैं और अगले दिन फिर से शुरू किया.
    10. तुरंत उपयोग करने से पहले धुंधला बफर के 2 मिलीलीटर में एक फास्ट लाल गोली भंग.
    11. फास्ट लाल अभिकर्मक के साथ धुंधला बफर में भ्रूण रखकर धुंधला रिएक्शन शुरू.
    12. वांछित धुंधला तीव्रता तक पहुँच जाता है जब धुंधला प्रतिक्रिया बंद करो. 4 में धुंधला जब यह रात में एक या दो दिन के लिए कमरे के तापमान पर कुछ घंटे लग सकते हैं डिग्री सेल्सियस धुंधला तीव्रता को और विकसित करने या गैर विशिष्ट दिखाने के लिए शुरू नहीं करता है तो तुरंत प्रतिक्रिया बंद करोभावना नियंत्रण की तुलना में जब अल्पसंख्यक.
    13. अर्थात् बचे हुए चरणों पद के निर्धारण के लिए ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाओं, बढ़ते, निरीक्षण और छवि अधिग्रहण (steps1.3.3.5 और 1.3.3.6) का पालन करें.

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Representative Results

टोकरी प्रति 50 भ्रूण (जीन / प्रति प्रयोगात्मक हालत प्रति) है कि जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न एक प्रयोग में हासिल किया जा सकता है के साथ प्रोटोकॉल का उपयोग करना. लगभग सभी भ्रूण एक विशेष जीन के लिए इसी तरह की अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा. सीटू संकरण धुंधला में के प्रतिनिधि उदाहरण आंकड़े 3-6 में दिखाया जाता है.

भावना और विरोधी भावना दोनों riboprobes PC5.1 को इसी cDNAs, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, FLK / kdrl 10,11, dlx2 12, fkd7 से संश्लेषित किया गया / foxa1 13, इंसुलिन 14,15, और trypsin 16 Taq डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग कर पूर्ण लंबाई mRNA की एक खंड amplifying द्वारा निर्माण, और pCRII-TOPO (Invitrogen) में क्लोन किया गया है. व्यक्तिगत amplicons की प्रामाणिकता अनुक्रमण द्वारा पुष्टि की गई. क्लोन उन्मुखीकरण के सत्यापन के बाद, इसी antisense riboprobes संश्लेषित थेया तो SP6 या T7 शाही सेना पीसीआर का उपयोग कर यहाँ वर्णित के रूप में संशोधनों 18,19 साथ प्रोटोकॉल 17 का उपयोग कर. स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट में शामिल चरण चित्रा 2 में संक्षेप में सचित्र हैं. ब्याज की riboprobe के साथ संकरण के बाद मनाया बैंगनी धुंधला बहुतायत और विशेष जीन की अभिव्यक्ति के दोनों साइटों का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण PC5.1 लिए 24hpf पर कान पुटिका और पार्श्व रेखा उत्स के पूर्वकाल और पीछे भाग के भीतर बहुत असतत अभिव्यक्ति से पता चलता है और दृढ़ता से 72 HPF (चित्रा 3) द्वारा पूर्वकाल और कूल्हों पार्श्व रेखा neuromasts भीतर ही सीमित नहीं है. इसके विपरीत PC5.2 शो somites, कान पुटिका और pronephric वाहिनी के भीतर और अलग regionalization साथ सीएनएस के भीतर सर्वव्यापी अभिव्यक्ति अत्यधिक 96 HPF (चित्रा 4) में जिगर और आंत के भीतर व्यक्त किया है. संबंधित भावना riboprobes का उपयोग करते समय जीन अभिव्यक्ति के अभाव में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. ( 4b). रक्त मार्करों की अभिव्यक्ति का विश्लेषण द्विपक्षीय कपाल कोशिकाओं के भीतर और मध्यवर्ती कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) में SCL/tal-1 का धुंधला दिखाया. Gata-1 के लिए धुंधला हो जाना भी आईसीएम के भीतर देखा जाता है अभिव्यक्ति पैटर्न अलग है. FLK / kdrl की अभिव्यक्ति hindbrain, मुख्य और intersegmental वाहिकाओं के भीतर और आईसीएम (चित्रा 5) में मनाया गया. श के लिए धुंधला (चित्रा 5) पृष्ठदंड में मनाया गया. 34 HPF पर dlx2 की अभिव्यक्ति में स्थानीय है telencephalon, diencephalon, हाइपोथैलेमस और कपाल ectomesenchymal मेहराब और 24 HPF पर fkd7/foxa1 अभिव्यक्ति मुख्य रूप से मंजिल की थाली और hypochord में देखा जाता है. अग्नाशय मार्करों की अभिव्यक्ति पैटर्न बहि अग्न्याशय (चित्रा 6) में अंत: स्रावी अग्न्याशय और trypsin में इंसुलिन धुंधला दिखाया. उच्च संकल्प के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा ये परिणाम उल्लिखित प्रोटोकॉल की सफलता का प्रतिनिधित्व करता हैउच्च और निम्न प्रचुर जीन दोनों की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए. आगे स्पष्टता छवियों के लिए एक सूक्ष्म स्लाइड 20 पर भ्रूण बढ़ते के बाद confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग लिया जा सकता है. प्रयोग प्रोटोकॉल का अनुकूलन के दौरान उप इष्टतम शर्तों के तहत किया गया था जब प्राप्त परिणामों के कुछ उदाहरण 7 चित्र में दिखाया गया. गरीब अभिव्यक्ति के साथ उच्च पृष्ठभूमि संकेत 55-60 डिग्री सेल्सियस के बीच अपर्याप्त permeabilization और संकरण के नीचे देखा गया था

चित्रा 1
चित्रा 1. पकड़ करने के लिए तैयार करना और Eppendorf-नायलॉन का उपयोग जाल टोकरियाँ भ्रूण का मंचन किया. एक अच्छी तरह से छह Eppendorf-नायलॉन जाल टोकरी पकड़ कर सकते हैं. छवि छह Eppendorf-नायलॉन जाल टोकरियाँ युक्त 6 अच्छी तरह से बाँझ प्लेटों से पता चलता हैपीबीएस में मेथनॉल की लगातार dilutions के लिए इस्तेमाल किया.

चित्रा 2
चित्रा 2. सीटू संकरण तकनीक में पूरे माउंट में शामिल कदम दिखा आरेख. फिक्सिंग के मंचन के बाद इस्तेमाल किया जब तक भ्रूण -20 डिग्री सेल्सियस पर मेथनॉल में संग्रहित किया जा सकता है. जांच अग्रिम में संश्लेषित और -80 पर रखा जा सकता डिग्री सेल्सियस वे लंबे समय से अधिक इस्तेमाल कर रहे हैं तो छोटे aliquots में संग्रहीत की जांच की सलाह दी जाती है. सीटू संकरण प्रयोगों में सामान्य तौर पर पूरे माउंट 3 या 4 दिनों में पूरा किया जा सकता है. कमजोर व्यक्त जीनों के लिए धुंधला प्रतिक्रिया धुंधला प्रतिक्रिया 4 बजे किया जाता है जब लंबे समय तक कमरे के तापमान पर 16 घंटे तक का समय लग जाएगा या डिग्री सेल्सियस बड़ा च देखने के लिए यहां क्लिक करेंigure.

चित्रा 3
चित्रा 3. स्वस्थानी संकरण विश्लेषण में पूरे माउंट द्वारा PC5.1 की अभिव्यक्ति 24 HPF और 72 HPF मंचन भ्रूण का उपयोग किया गया. 24 HPF भ्रूण की (एक) पार्श्व दृश्य पूर्वकाल भीतर PC5.1 की बहुत असतत अभिव्यक्ति दिखाने के और PC5.1 antisense riboprobe उपयोग कर कान पुटिका और पार्श्व रेखा उत्स के पीछे भाग. 72 पर HPF विशिष्ट धुंधला पूर्वकाल और कूल्हों पार्श्व रेखा neuromasts भीतर मनाया गया. (ख) PC5.1 भावना riboprobe उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

gether.within पृष्ठ = "हमेशा"> चित्रा 4
चित्रा 4. PC5.2 की स्वस्थानी संकरण विश्लेषण में 24 HPF और 96 HPF पूरे माउंट में PC5.2 विरोधी भावना और भावना riboprobes का उपयोग किया गया था. (एक) 24 HPF भ्रूण के पार्श्व दृश्य सीएनएस के भीतर सर्वव्यापी अभिव्यक्ति दिखा, कान पुटिका और pronephric वाहिनी somites. जिगर और पेट में विशिष्ट धुंधला PC5.2 antisense riboprobe का उपयोग कर 96 HPF पर देखा जाता है. (ख) PC5.2 भावना riboprobe उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति की अनुपस्थिति एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

"oad/50644/50644fig5.jpg" चौड़ाई = "500px />
. चित्रा 5 SCL/tal-1 riboprobe का उपयोग कर 24 HPF में सीटू संकरण विश्लेषण में साबुत माउंट द्विपक्षीय कपाल कोशिकाओं के भीतर और मध्यवर्ती कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) में धुंधला दिखाया, gata-1 riboprobe धुंधला आईसीएम में देखा जाता है, FLK पश्चमस्तिष्क, मुख्य, और intersegmental वाहिकाओं के भीतर और आईसीएम में / kdrl अभिव्यक्ति. श के लिए धुंधला पृष्ठदंड में मनाया गया.

चित्रा 6
. चित्रा 6 dlx2 riboprobe का उपयोग कर 34 HPF में सीटू संकरण विश्लेषण में साबुत माउंट telencephalon, diencephalon, हाइपोथैलेमस, और कपाल ectomesenchymal मेहराब में dlx2 की अभिव्यक्ति का पता चला, 24 HPF पर fkd7/foxa1 अभिव्यक्ति मंजिल पी में मुख्य रूप से देखा जाता हैदेर और hypochord, इंसुलिन धुंधला बहि अग्न्याशय में अंत: स्रावी अग्न्याशय और trypsin अभिव्यक्ति में मनाया जाता है.

7 चित्रा
चित्रा 7. पर्याप्त permeabilization और उचित संकरण तापमान सीटू संकरण संकेतों में स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. भ्रूण से permeabilized कर रहे हैं जब एक श riboprobe का उपयोग कर 24 HPF और 48 HPF में सीटू संकरण विश्लेषण में साबुत माउंट पृष्ठभूमि संकेत बिना पृष्ठरज्जु और floorplate भीतर अभिव्यक्ति का पता चला 12-15 मिनट और 70 पर संकरित डिग्री सेल्सियस के लिए proteinase कश्मीर पाचन भ्रूण अपर्याप्त पाचन (5 मिनट proteinase कश्मीर उपचार) या कम तापमान पर संकरित के अधीन थे जब अधूरा अभिव्यक्ति पैटर्न और उच्च पृष्ठभूमि संकेतों मनाया गया (60 डिग्री सेल्सियस). बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

हम उच्च संकल्प के साथ शाही सेना कल्पना करने के लिए उन्नत विधियों को विकसित किया है. सीटू संकरण प्रक्रियाओं में झरझरा पैंदा (चित्रा 1) के साथ सरल कस्टम निर्मित बास्केट प्रयोग किया जाता है. भ्रूण बाँझ परिस्थितियों में कमरे के तापमान पर 6 अच्छी तरह प्लेटें में RNase मुक्त समाधान का उपयोग कर कार्रवाई की जाती है.

अलग करने के लिए भ्रूण बास्केट अलग रंग Eppendorf ट्यूब से बना रहे हैं. साथ या एक रिम बिना टोकरी आसान उन्मुखीकरण के लिए उपयोग किया जाता है और एक विशेष जांच करने के लिए इसी तरह की टोकरी के भीतर भ्रूण की पहचान करने के लिए.

65 में Prehybridization 70 डिग्री सेल्सियस और संकरण ° 50% विआयनीकृत formamide साथ सी उच्च संकल्प संकेतों को प्राप्त करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हो पाया था. इसके अलावा 15 मिनट पोस्ट PBST के लिए क्षारीय Tris बफर के साथ दो बार भ्रूण incubating विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी और BCIP की उपस्थिति में ऊष्मायन से पहले साथ ऊष्मायन के बाद washes औरएनबीटी उच्च गुणवत्ता स्पष्ट संकेत की उपस्थिति की सुविधा. हमारे हाथ में हम 70 में इष्टतम समय और संकरण के लिए भ्रूण की permeabilization और फिक्सिंग डिग्री सेल्सियस स्पष्ट संकेतों को प्राप्त करने में बहुत महत्वपूर्ण थे कि अनुभव किया. अपर्याप्त permeabilization के उच्च पृष्ठभूमि संकेतों का उत्पादन. विस्तारित फिक्सिंग संकेत का पता लगाने हिचकते जबकि विस्तारित permeabilization या अपर्याप्त फिक्सिंग भ्रूण की गिरावट में हुई. 55-60 के बीच संकरण डिग्री सेल्सियस भी उच्च पृष्ठभूमि संकेतों (चित्रा 7) का उत्पादन किया.

ब्याज की जीन antisense (एएस) टेप encodes अगर भावना जांच प्रतिलिपि के रूप में के लिए एक संकेत का पता लगाने जाएगा. धुंधला प्रतिक्रिया 30 मिनट के लिए मेथनॉल में भ्रूण रखकर बंद कर दिया है या उससे अधिक समय के लिए एक सच्चे बैंगनी रंग के संकेत धर्मान्तरित, और गैर विशिष्ट धुंधला को हटा रहा है के बाद. फिक्स्ड भ्रूण कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बंद समाधान में अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है.

फायदे और disadvantagइच्छा की तों

इच्छा embryogenesis दौरान लक्ष्य जीन के अस्थायी और स्थानिक अभिव्यक्ति और लार्वा चरणों दोनों को चिह्नित करने के लिए एक कुशल तकनीक है. इस प्रोटोकॉल भी प्रायोगिक उद्देश्यों के आधार पर उचित संशोधनों का उपयोग कर दो जीन या एक ही समय में आरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति की सह स्थानीयकरण की शाही सेना अभिव्यक्ति के दृश्य की अनुमति देता है. इस उच्च संकल्प प्रोटोकॉल कई ऊतकों और सेल प्रकार में शाही सेना अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कम से कम पृष्ठभूमि संकेतों के साथ बहुत कम प्रचुर मात्रा में शाही सेना प्रजातियों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, ऊतकों की आंतरिक डिब्बों के भीतर जीनों की सटीक अभिव्यक्ति कल्पना करने के लिए ऊतक वर्गों का उपयोग कर स्वस्थानी संकरण में की आवश्यकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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