높은 해상도 전체 마운트
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

제브라 피쉬, 작은 열대어, 척추 발달과 질병 중 유전자 기능 연구를위한 대중적인 모델이되고있다. 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현에 의해 결정될 수있다

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

이 문서에서는 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화 (소원)의 전체 마운트에 초점을 맞추고 있습니다. 소원 기​​술은 조직의 분포와 발달 단계의 측면 모두에서 유전자 발현의 평가를 용이하게합니다. 프로토콜은 digoxigenin으로 표시 안티센스 RNA 프로브를 사용하여 제브라 피쉬 배아의 소원의 사용을 설명합니다. 프로브는 복제와 선형화 된 유전자 템플릿의 시험 관내 전사의를 통해 digoxigenin 연결된 뉴클레오티드를 통합하여 생성됩니다. 정의 개발 단계에서 수확 배아의 chorions는 특정 프로브를 배양하기 전에 제거됩니다. 여분의 프로브를 제거하는 세척 절차에 따라 배아는 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)와 결합 된 항 digoxigenin 항체 배양한다. 알칼리 포스 파타 아제 (alkaline phosphatase)에 대한 발색 기판을 채용하여, 특정 유전자의 발현을 평가 할 수 있습니다. 유전자 발현의 수준에 따라 전체 절차는 2-3 일 이내에 완료 할 수 있습니다.

Introduction

제브라 피쉬 (Danio rerio)는 척추 동물의 개발, 질병, 행동의 연구를위한 강력한 동물 모델로 등장하고있는 약물 검사 1-3습니다. 제브라 피쉬 배아는 하나의 교차점에서 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. 수정 및 개발 전 자궁 및 광학적으로 명확한 배아 신속하게 개발을 발생합니다. 중요한 발달 이벤트는 처음 48 시간 후 수정 (HPF) 동안 발생합니다. 이 기관 원기의 모양과 세포 분화의 시작을 포함합니다. 단백질의 최저 이상 발현은 안티센스 모르 (MO) 올리고 뉴클레오티드와 배아의 microinjection을 통해 달성하거나 하나 또는 두 개의 세포 단계 (825 HPF)에서 각각 mRNA의 할 수 있습니다.

제브라 피쉬 배아의 소원이 그 특정 유전자의 시공간적 표현의 연구를 용이하게합니다. 소원 기​​술의 응용 프로그램은 오버 EXPR을 발현 또는 MO와 배아의 microinjection에 따라ESS 또는 최저 특정 단백질 수준이 다른 유전자의 차등 규제를 보여준다.

유전자 발현 패턴의 변화는 표현형의 변화와 상관 관계와 초기 형성기 동안 표적 유전자의 기능을 표시 할 수 있습니다. 프로브를 준비하고 사전에 저장 될 수 있기 때문에, ISH 기법은 6 잘 접시와 사용자 정의 만든 바구니를 사용하여 한 번에 적어도 20 유전자의 유전자 발현 패턴을 나타 내기 위해 적용 할 수 있습니다.

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Protocol

1. 제브라 피쉬 배아의 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트

배아의 1.1 준비

  1. 필요한 발달 단계에서 배아를 수집합니다. 배아 단계에 대한 설명은 킴멜 5.를 참조하십시오.
  2. 수동 집게 (뒤몽 시계 제조는 않습니다. 5 포셉 없음)를 사용 chorions를 제거합니다.
  3. PBS에서 만든 파라 포름 알데히드의 4 % 용액 (PFA)에서 배아를 고정 4 ℃에서 하룻밤 (인산염 완충 식염수)
  4. 3 배 이상 실온에서 5 분 각각 PBS와 배아를 씻으십시오.
  5. 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트를 포함하여 기술의 미래 응용 프로그램에 사용되는 때까지 -20 ° C에서 100 % 메탄올 (메탄올)에 보관 배아.
  6. 동결 -80 ° C.에서 RNA 추출 및 저장을위한 액체 질소에 배아를 개최
  7. 무대 배아에서 RNA를 추출하여 PCR 증폭 이후의 복제에 대한 cDNA를 합성.
  8. Digoxygenin - 표시 RNA 프로브 1.2 합성

    1. 프로브 템플릿에 대한 PCR 증폭 및 유전자 클로닝. 표 1과 같이 50 μl의 총 볼륨 설정 PCR 반응. 더 많은 DNA 게놈 또는 템플릿으로 PCR 반응에서 적은 cDNA를 사용합니다. 72시 10 분 연장 시간을 포함 ° C PCR 반응 제품은 TOPO 복제를 용이하게하기 위해 adenylated 전체 길이 3 '있는지 확인하기 위해 마지막주기에 따라.
    시약 음량
    템플릿 DNA 100 NG
    PCR 버퍼 (10X) 5 μL
    dNTPs (10 MM) 2 μL
    프라이머 (10 MM) 1 μM 각
    의 최종 볼륨에 물을 추가 49.7 μL
    DNA 형성 촉매 중합 효소 (5 개 / & #956, L) 0.3 μL
    반응 볼륨 50 μL

    표 1. PCR 증폭 반응.

    1. 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 PCR 제품의 크기를 확인합니다. 프로브 합성을위한 PCR 제품의 예상 크기는 1킬로바이트 부근에 자리 잡고 있습니다.
    2. 무균 조건 하에서 실험을 수행하고 핵산없는 물을 사용하여 핵산 오염을 피하기 위해 특별한주의를 기울입니다. 여러 제품이 관찰되는 경우, TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 복제를 진행하기 전에 적절한 크기의 PCR 제품을 젤 정화. 번짐 및 다중 대역의 모양을 제거하는 PCR 반응을 최적화 할 수 있습니다.
    3. 표 2에 표시된대로 TOPO 클로닝 반응을 수행 할 수 있습니다. TOPO 벡터와 PCR 제품을 결합하고 5 분 실온에서 알을 품다.
    시약 화학적 관할 세포 전기 관할 세포 신선한 PCR 반응 생성물 1-4 μL 1-4 μL 소금 솔루션 1 μL 희석 소금 솔루션 1 μL 물 5 μL의 볼륨을 최대 총 5 μL의 볼륨을 최대 총 TOPO 벡터 1 μL 1 μL 최종 권 6 μL 6 μL

    표 2. TOPO 클로닝 반응.

    1. 한방 유능한 세포에 TOPO 클로닝 제품을 소개 / 통합합니다. 티자신의 프로세스를 변환이라고합니다.
    2. 항생제 내성 유전자의 발현을 보장하기 위해 260 rpm에서 최소 1 시간 동안 37 ° C에서 변형 된 세포를 품어. 판 prewarmed 루리아 베르 타니 (LB) 50 ㎍ / ㎖ 암피실린 및 X-GAL을 포함하는 한천 플레이트에 변형 혼합 (50 ~ 100 μL). 37 ° C에서 밤새 품어.
    3. 흰색 또는 밝은 파란색 콜로니의 모양에 따라 삽입의 존재를 확인합니다. TOPO 벡터는 β-갈 락토시다 아제를 암호화 lacz 유전자를 포함하고 있습니다. X-GAL의 면전에서, β-갈 락토시다 제의 생산은 파란색을 형성한다. 기능 β-갈 락토시다 아제와 화이트 식민지의 형성을 방해하는 플라스미드에 결찰 DNA가 생성됩니다. 흰색 식민지 또는 라이트 블루 식민지 삽입의 존재를 확인합니다.
    4. 멸균 피펫 팁을 사용하여 한천 배지에서 흰색 식민지를 선택하고 흔들림 incuba에서 37 LB 미디어와 문화의 4 ML을 포함하는 멸균 10 ML 튜브 ° C에 배치200 rpm에서의 하룻밤 토르.
    5. 제조 업체의 지시에 따라 플라스미드 DNA 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정화.
    6. 인서트 3 '(감지 프로브의 경우) 또는 5'(안티센스 프로브)에 위치한 유일한 사이트가 적절한 제한 효소로 각 프로브에 대한 cDNA를 5 μg을 소화하여 cDNA를 다음과 플라스미드 정제를 선형화.
    7. 클로로포름 / 페놀 추출 방법을 사용하여 선형 DNA를 정화. 4 13,000 rpm에서 3 분 ° C.에 대해 30 초 동안 적극적으로 정점, 클로로 페놀 / 스핀의 동일한 볼륨을 추가 깨끗한 튜브로 위 수성 단계를 전송하고 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가합니다. 4 ℃에서 13,000 rpm에서 3 분간 회전 깨끗한 튜브로 위 수성 단계를 전송합니다. 하룻밤 -20 ° C에서 침전 DNA 및 저장에 10 % 초산 나트륨 (3 M) 및 100 % 에탄올 2.5 배 볼륨을 추가합니다. 4 ℃에서 13,000 rpm에서 15 분간 회전 에탄올을 제거하고 75 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. 프로토콜이 중지 될 수 있으며, DNA는 ST 될 수 있습니다-20 ° C에서 OR 연산하고 다음날 다시. 4 ℃에서 10,000 rpm에서 10 분간 회전 조심스럽게 뜨는을 제거하고 상온에서 2 분 동안 펠렛을 건조. 20 분 동안 55 ° C에서 DEPC 처리 된 물과 부화 10 μL에 펠렛을 resuspend을. UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도를 정량화.
    8. 1 % 아가 로스 젤에서 DNA 1 μL를 사용하여 약 30 분 동안 실행 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 순도를 평가합니다.
    9. RNA 라벨 반응을 설정합니다. RNase가 무료로 반응 유리 병 사용, 13 μL의 볼륨 DEPC 처리 된 증류수 멸균, RNase가 무료로 템플릿 DNA를 정제 1-5 μg을 추가합니다. 얼음에 반응 병을 진정하고 (표 3 참조) 다음과 같은 시약을 추가합니다 :
    시약 음량
    NTP 라벨 혼합 (배) 2 μL
    전사 광어 (배) 2 μL
    보호자 RNA 분해 효소 억제제 1 μL
    RNA 중합 효소 SP6 또는
    RNA 중합 효소 T7 2 μL
    최종 권 20 μL

    표 3. RNA 라벨 반응.

    1. 실온에서 30 초 동안 2,000 rpm에서 간단한 원심 분리하여 바닥에 수집 37 2 시간 동안 반응 혼합물을 품어 부드럽게 한 후 시약을 혼합 ° C.
    2. 37 ° C에서 30 분 동안 2 μL RNase가없는 DNase의 I. 품어을 추가하여 템플릿 DNA를 제거하고 2 μL 0.2 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)을 추가하여 반응을 중지합니다.
    3. 2.5 ㎕의 4 M LiCl을 75 μL 100 % 에탄올을 첨가하여 반응 생성물을 침전. 솔루션을 혼합하고 45 분 O가 -20 ° C에서 보관R -20에 저장 ° C 이상 - 박 프로토콜은 다음 날 다시.
    4. 2 분 동안 건조 추가 10 분, -20 ° C, 원심 분리기에 저장된 500 ㎕의 70 % 에탄올로 펠렛을 세척 한 후 4 ° C에서 13,000 rpm에서 30 분 동안 현탁액을 원심 분리기 50 μL와 부화에 resuspend을 37 ℃에서 30 분에서
    5. 약 30 분 동안 1 % 아가 로스 젤에 1-2 mL를 실행하여 프로브의 품질과 무결성을 확인합니다. 이 젤의 예상 크기에서 실행되는 단일 제품의 존재에 의해 확인됩니다.
    6. 분광 광도계를 사용하여 RNA의 양을 측정하여 프로브의 농도를 정량화. 이 반응의 수율은 RNA의 10 μg (μL / 100-200 NG)에 관한 것입니다.

    원위치 하이브리드 화 1.3 전체 마운트

    1. DAY 1
      1. 재수
        1. 나일론 메쉬 (1mm 이하의 기공 크기)와 에펜 도르프 튜브를 사용하여 바구니를 준비합니다. 을 해부하여 바구니를 구축G 에펜 도르프 튜브 (1.5 ML)는 원뿔 끝을 제거합니다. 각각의 바구니가 서로 다른 색깔의 튜브를 사용하여 확인하고 정상을 제거하려면 그들 중 절반에서 발단.
        2. 에펜 도르프 튜브의 절단 끝을 충당하기 위해 나일론 메쉬의 작은 조각을 잘라. 흄 후드에서 전기 핫 플레이트 (높은 중간 사이에서 설정)에 그들을 가열하여 나일론 메쉬 튜브의 절단 끝을 붙입니다. 일단 냉각하면 바구니에서 초과 나일론 메쉬를 제거하고 실온에서 100 % 메탄올을 저장합니다.
        3. 100 % 다음의 6 잘 접시의 처음 세 개의 우물을 사용하여 PBS에서 메탄올의 연속 희석 (75 % [권 / 권 【메탄올 50 % [VOL / VOL] 메탄올과 25 % [VOL / VOL] 메탄올)를 준비 PBST (인산염은 0.1 % 트윈 - 20을 포함하는 완충 식염수) 다음 세 우물합니다.
        4. 현장 Figurea 1A와 B에서와 같이 사용자 정의 만든 바구니를 사용하는 하이브리드 절차에 제목 배아. hybridiza로 RNase가없는 솔루션을 사용6 - 잘 접시에 TION 단계 (4 ML / 잘).이를 달성하려면, 물론 먼저 6 바구니까지 배치합니다. 테두리와 장소 바구니는 먼저 연속적으로 배열 된 서로 다른 색으로 테두리가없는 바구니에 따랐다. 최대 6 유전자 발현 패턴이 배열을 사용하면 동시에 확인할 수 있습니다.
        5. 같은 바구니 (그림 1 참조)에 동일한 발달 단계의 탈수 배아를 놓습니다.
        6. 6 - 잘 플레이트 잘 하나에서 다음 (각 단계에 대한 5 분)에 바구니를 이동하여 배아를 수화. 적절한 버퍼로 가득 여섯 우물을 사용합니다. 배아는 한 번 각 희석을 실시한다. 이 방법으로 배아는 배, 5 분 / 세척을 세척한다. 탈수 배아의 재수를하고 100 % PBST로 3 배 세척하여 PBS로 메탄올을 대체하여 얻을 수 있습니다.
      2. 표 4에서와 같이 Permeabilization 다이제스트는 상온에서 단백질 분해 효소 K (10 ㎍ / ㎖)와 재수 배아 투과성을 렌더링 할 배아 단계 (시간 게시물 수정) 소화 기간 (단백질 분해 효소 K) 최대 6 개 15 초 6-12 30 초 12-18 3 분 24 12-15 분 48 25 ~ 30 분 72 40 분 96-120 50 분

        표 4. Permeabilization 반응.

      3. Postfixation 및 PBST 워시
        1. 20 분 1X PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (중량 / 부피)에 배양하여 배아를 수정합니다.
        2. 배아 배 세척하여 잔류 파라 포름 알데히드를 제거, 5 1X PBST에있는 분 / 세척.
        </ 리>
      4. 아세틸 화는 10 분 각각 두 번 아세틸 혼합물 (10 ㎖ DDH 2 O의 125 μL 트리에탄올 아민, 27 μL 무수 초산)과 부화 배아를 준비합니다. 필요한 경우 내인성 인산 가수 분해 효소 활동을 최소화하기 위해 신선한 아세틸 혼합물을 준비합니다. 과잉 시약을 제거하려면 (10 분 / 워시) PBST에 두 번 배아를 씻어
      5. Prehybridization 1.5 ML 멸균 에펜 도르프 튜브에 바구니에서 배아를 전송 및 70 ° C의 물을 욕조에 2-4 시간 동안 200 ㎕의 하이브리드 혼합물로 배양하여 배아를 Prehybridize.
      6. 항체의 Preadsorption는 바구니에서 약 50 배아를 제거하고 1.5 ML 멸균 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. 차단 버퍼를 사용하는 반 DIG-AP (1:500) 항체 (1X PBST 2 % 송아지 혈청 [VOL / VOL], 2 MG / ML 혈청 알부민 [BSA]) 2-4 시간 동안 실내 온도와 배양 다음 4 ° C 하룻밤에 저장합니다. 아침에 인큐베이터에서 제거D 배아 실내 온도에 도달 할 수 있습니다.
      7. 하이브리드는 prehybridized 배아에 프로브 100-200 NG를 추가하고 70 밤새 품어 ° C를 물에 목욕한다.
    2. DAY 2
      1. SSC (식염수 나트륨 구연산염)는 씻는다
        1. 하이브리드 혼합물의 장소 50 ML 튜브 (HM), 70 ° C의 물을 욕조에 물을 최소한 20 분을 prewarm와 비이커 2X SSC와 0.2 배 SSC. 프로브를 포함하는 하이브리드 반응 혼합물을 분리 튜브에 prewarmed 하이브리드 혼합물의 1 ML을 추가하고 70 15 분 동안 품어 ° C.를 과잉 시약을 제거하기 위해 25 % HM에 75 %를 100 % HM 대체하여 2X SSC에 prewarmed HM의 다양한 희석와 여섯 잘 접시를 채우십시오.
        2. 기다리는 동안 세척을 위해 2X SSC와 여섯 잘 접시를 작성하고 70 그들을 유지 ° C.
        3. 15 분 놓은 후 바구니에 튜브에서 배아 희석 가득 여섯 잘 플레이트에 보관2X SSC와 HM s의 다음 (70 ° C의 물을 욕조에 15 분마다)에 잘 하나에서 바구니를 이동하여 교배 배아를 씻으십시오. 70 100 % 2X SSC의 배아 배, 15 분 / 세척을 씻어 ° C.
        4. 65 다른 물 목욕 ° C.를 설정 높은 엄중를위한 0.2X SSC와 여섯 잘 접시를 채우기 프로브 증명서의 비특이적 교잡을 피하기 위해 세척.
        5. 배아가 70 배 SSC로 두 번 세척 한 후 ° C, 65 0.2X SSC에서 더 두 30 분 세척을 수행 ° C.
      2. PBST 워시는 다음과 같이 PBST의 0.2 배 SSC의 연속 희석와 여섯 잘 접시를 준비 : 75 % (권 / 권) 0.2 배 SSC, 75 % (부피 / 부피) 0.2 배 SSC, 25 % (부피 / 부피) 0.2 배 SSC, 나머지 두 개의 우물 100 % PBST로. (로커를 사용하여 실온에서 각 단계별로 5 분)도 하나에서 다음에 바구니를 이동하여 교배 배아를 씻으십시오.
      3. BLO의 실온에서 3-4 시간 동안 배양 전 Preincubate 배아요리하는 버퍼 (1X PBST 2 % 송아지 혈청 [VOL / VOL], 2 MG / ML BSA).
      4. ° C 교반 4에서 하룻밤 버퍼를 차단하는 안티-DIG-AP 항체 (1:5,000)의 솔루션을 방지 DIG 항체 품어 배아와 외피.
    3. 3 일
      1. PBST 워시 잘 4 ML / PBST로 6 - 잘 접시를 준비합니다. 15 분 동안 배 PBST를 포함 6 - 웰 플레이트에 바구니를 이동하여 배양 된 배아를 씻으십시오. 배아는 4 ° C에 저장 프로토콜은 다음 날 다시 시작할 수 있습니다.
      2. BCIP의 존재 (5 - 브로 모 -4 - 클로로 -3 - 인돌 릴 인산염) 및 NBT (nitroblue tetrazolium)에서 부화하기 전에 교반과 함께 실온에서 버퍼를 prestaining로 15 분 동안 배를 세척하여 배아를 Prestain Prestaining. BCIP 및 NBT는 알칼리성 인산 가수 분해 효소 활동의 발색에 사용되는 기판입니다. 프로브는 알칼리성 포스 파타 아제 번째가 부착되어 있기 때문에보라색 ​​컬러 전자 개발 표적 유전자의 발현을 나타냅니다. 배아는 4 ° C에 저장 프로토콜은 다음 날 다시 시작할 수 있습니다.
      3. 더럽히는 것
        1. 30 분 BCIP 및 NBT와 함께 어둠 속에서 실온에서 배아를 품어.
        2. 염색 반응에게 입체 현미경을 사용하여 30 분마다 모니터합니다. 반응 시간은 유전자 발현의 수준에 따라 15 분 - 16 시간마다 다릅니다. 반응 시간은 약하게 발현 유전자 고 발현 유전자에 대한 짧고 긴합니다. 관심의 유전자가 상호 보완적인 안티센스 (AS) 성적표를 표현하는 경우 감지 프로브는 신호를 감지합니다.
      4. 원하는 염색 강도 정지반응에 도달하면 정지 솔루션 (1X PBS, pH를 5.5, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 십대 초반)를 포함하는 우물에 배아가 들어있는 바구니를 전송하여 반응을 중지합니다. 이 색깔의 발전을 방지합니다. 부드러운 AG 로커에 10 분 배를위한 배아를 씻어상온에서 itation.
      5. Postfixation
        1. 20 분 동안 PBS에서 파라 포름 알데히드 4 % (중량 / 부피)의 배아를 품어.
        2. 잔류 파라 포름 알데히드를 제거하기 위해 PBST로 배아 (5 분 / 세척) 세 번 씻으십시오. 4 ° C.에 어둠 속에서 스톱 솔루션으로 고정 된 배아를 저장
      6. , 장착 관측 및 이미지 수집
        1. PBS의 가능한 최소 볼륨을 사용하여 100 % 글리세롤을 포함하는 여섯 잘 플레이트에 배아를 전송합니다. 로커에서 6 - 웰 플레이트를 배치하고 부드럽게 어둠 속에서 실온에서 밤새 교반.
        2. 100 % 글리세롤에 배아를 놓고 입체 현미경 하에서 신호를 관찰한다.
        3. 이미지 획득 및 TIFF 파일 형식 또는 포토샵 (그림 3-6)와 같은 이미지 소프트웨어의 사용을 통해 높은 품질의 이미지를 생산을 허용하는 다른 형식으로 저장합니다.

    I N 원위치 하이브리드 화

    1. 더블 달성하기 위해 1.1에서 위에서 설명한 방법 라벨 - 1.3.1.7가 사용되지만 하이브리드 동안 digoxygenin과 형광 표지 프로브를 모두 동시에 배양이 포함되어 있습니다.
    2. 게시물 하이브리드 즉 SSC와 PBST 세척 (단 1.3.2.1 및 1.3.2.2)과 블로킹에서 incubate 단계 (1.3.2.3)를 세척에 대해 동일한 절차를 따르십시오. 순차적으로 아래에 설명 된 항체 염색 반응을 수행 할 수 있습니다.
    3. 4에서 AP-결합 안티 - digoxigenin 항체 (1:5,000) ° 부드러운 교반 C와 배아를 품어.
    4. 세척 및 BCIP-NBT (단 1.3.3.1 - 1.3.3.6)에 품어.
    5. 감지 후, 20 분 동안 상온에서 PBST로 두 번 배아를 씻으십시오.
    6. 안티 digoxigenin 항체를 비활성화하는 30 분 동안 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 65 ° PBST에서 C에서 배아를 품어.
    7. 75 %, 50 %, 25 % 메탄올 위트 재수 뒤에 100 % 메탄올 배아를 배양1 시간 PBST을 맞댄 시간 PBST합니다.
    8. 4 ° C에서 교반과 버퍼를 차단하는 AP 결합 형광 (1:2,000)와 하룻밤 배아를 품어.
    9. PBST (단계 1.3.3.1)과 2 시간 전 염색법 버퍼 15 분 전 얼룩 배아와 배아를 씻어 빠른 빨간색의 존재 이전의 배양에 교반과 함께 실온 (0.1 M 트리스 - 염산, 산도 8.2) . 프로토콜을 중지 할 수 있으며, 배아는 저장 될 수있는 4 ℃에서 교반과 그 다음날 다시.
    10. 바로 사용하기 전에 버퍼를 얼룩의 2 ㎖ 한 빠른 레드 타블렛을 녹입니다.
    11. 빠른 빨간 시약 얼룩 버퍼에 배아를 배치하여 염색 반응을 시작합니다.
    12. 원하는 염색 강도에 도달 염색 반응을 중지합니다. 4에서 염색 할 때 밤새 하나 또는 두 개의 일 상온에서 몇 시간에서 걸릴 수 있습니다 ° C. 염색 강도를 더 개발하거나 비 특정 표시하기 시작하지 않는 경우 즉시 반응을 정지감지 제어에 비해 ITY.
    13. 즉 나머지 단계 후 고정을 위해 위에서 설명한 절차, 설치, 관찰 및 이미지 수집을 (steps1.3.3.5 및 1.3.3.6)에 따라.

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Representative Results

바구니 당 50 배아 (유전자 당 / 실험 조건 당)이 유전자의 발현 패턴이 하나의 실험에서 얻을 수와 프로토콜을 사용하여. 거의 모든 배아는 특정 유전자와 유사한 발현 패턴을 보여줍니다. 원위치 하이브리드 염색의 대표적인 예는 그림 3-6에 표시됩니다.

감각과 안티 센스 모두 riboprobes은 PC5.1에 해당하는 cDNA를, PC5.2 6 SCL/tal-1 7, GATA-1 8,9, FLK / kdrl 10,11 dlx2 12 fkd7에서 합성 하였다 / foxa1 13, 인슐린 14,15, 트립신 16 DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소를 사용하여 전체 길이의 mRNA의 세그먼트를 증폭하여 구성하고, pCRII-TOPO (Invitrogen 사)로 복제되었다. 각각의 증폭 산물의 진위는 시퀀싱에 의해 확인되었다. 복제 방향을 검증 한 후, 해당 안티센스 riboprobes을 합성 하였다하나 SP6 또는 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 여기에 설명 된대로 수정 18,19와 프로토콜 17을 사용. 현장 하이브리드 화에서 전체 마운트에 관련된 단계는 그림 2에 간략하게 설명되어 있습니다. 관심 리보 프로브와 교잡 한 후 관찰 보라색 염색 풍부하고 특정 유전자의 발현 사이트를 모두 나타냅니다. 예를 PC5.1 들어 24hpf에 귀의 소포 및 측면 라인 primordium의 앞쪽과 뒤쪽 부분에서 매우 이산 식을 보여줍니다 강하게 72 HPF (그림 3)에 의해 전방 및 후방 옆 선 neuromasts에서 현지화되어 있습니다. 반면 PC5.2 쇼 somites, 귀의 소포 및 pronephric 덕트 내부와 별개의 지역화와 CNS 내의 유비쿼터스 발현이 높은 96 HPF (그림 4)에서 간 및 소장 내에서 표현된다. 각각의 감각 riboprobes를 사용하여 유전자 발현의 부재는 부정적인 제어 역할을합니다. ( 4B). 혈액 마커의 발현 분석은 양측 두개골 세포 내에서 중간 세포 질량 (ICM)의 SCL/tal-1의 염색을 보였다. GATA-1 염색도 ICM에서 볼 수 있지만 표현식 패턴은 다릅니다. FLK / kdrl의 표현은 후뇌, 메인 마디 사이 혈관 내에서 ICM (그림 5)에서 관찰되었다. 쉬에 대한 염색은 (그림 5) 척색에서 관찰되었다. 34 HPF에서 dlx2의 발현에 지역화 telencephalon, 간뇌, 시상 하부 및 두개 ectomesenchymal 아치와 24 HPF에서 fkd7/foxa1 표현은 주로 바닥 판과 hypochord에서 볼 수 있습니다. 췌장 마커의 발현 패턴은 외분비 췌장 (그림 6)에서 내분비 췌장 트립신 인슐린 염색을 보였다. 높은 해상도 발현 패턴을 보여주는 이러한 결과는 설명 프로토콜의 성공을 나타냅니다높고 낮은 풍부한 유전자 모두 발현을 검출합니다. 더 선명도 이미지의 현미경 슬라이드 20 배아를 설치 한 후 공 촛점 현미경을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 실험 프로토콜을 최적화하는 동안 하위 최적의 조건에서 수행했을 때 얻은 결과의 예제 중 일부는 그림 7에 나와 있습니다.별로 표정으로 높은 배경 신호가 55 ~ 60 ° C. 사이의 불충분 한 permeabilization과 교잡에서 발견 된

그림 1
그림 1. 개최 준비와 에펜 도르프 - 나일론을 사용 메쉬 바구니 배아를 개최. 하나는 잘 여섯 에펜 도르프 - 나일론 메쉬 바구니를 보유 할 수 있습니다. 이미지가 여섯 에펜 도르프 - 나일론 메쉬 바구니를 포함하는 6 자 멸균 접시를 보여줍니다PBS에서 메탄올의 연속 희석에 사용됩니다.

그림 2
그림 2. 원위치 하이브리드 기술에서 전체 마운트하는 단계를 보여주는 다이어그램. 담합 개최 후 사용할 때까지 배아는 -20 ° C에서 메탄올에 저장할 수 있습니다. 프로브는 사전에 합성 -80에서 보관 할 수 있습니다 ° C. 그들은 오랜 기간 동안 사용하는 경우 작은 분주에 저장 프로브는 것이 좋습니다. 원위치 하이브리드 실험에서 일반적으로 전체 마운트는 3 ~ 4 일 이내에 완료 할 수 있습니다. 약하게 발현 유전자에 대한 염색 반응은 염색 반응은 4시에 수행 할 때 더 이상 상온에서 16 시간까지 걸릴 또는 않습니다 ° C 보다 큰 F를 보려면 여기를 클릭하십시오igure.

그림 3
그림 3. 현장 하이브리드 화 분석에서 전체 마운트로 PC5.1의 발현은 24 HPF, 72 HPF 무대 배아를 사용하여 수행 하였다. 24 HPF의 배아 (A) 측면 뷰는 전방에서 PC5.1 매우 이산 표정을 보여 PC5.1 안티센스 리보 프로브를 사용하여 귀의 소포 및 측면 라인 primordium의 후방 부분입니다. 72에서 HPF 특정 염색 전방과 후방 측면 라인 neuromasts에서 관찰되었다. (B) PC5.1 감지 리보 프로브를 사용하여 유전자 발현의 부재는 음성 대조군으로 사용됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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그림 4. PC5.2의 현장 하이브리드 화 분석 24 HPF 96 HPF 전체 마운트시는 PC5.2 안티 센스와 감각 riboprobes를 사용하여 수행 하였다. () 24 HPF의 배아의 측면보기 CNS 내에서 유비쿼터스 표정을 보여 귀의 소포 및 pronephric 덕트 somites. 간, 창자의 특정 염색 PC5.2 안티센스 리보 프로브를 사용하여 96 HPF에서 볼 수있다. (B) PC5.2 감지 리보 프로브를 사용하여 유전자 발현의 부재가 부정적인 제어 역할은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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. 그림 5는 SCL/tal-1 리보 프로브를 사용하여 24 HPF에서 현장 하이브리드 화 분석의 전체 마운트는 양측 두개골 세포 내에서 중간 세포 질량 (ICM)의 염색했다; GATA-1 리보 프로브 염색은 ICM에서 볼 수 있습니다; FLK 후뇌, 주,와 마디 사이 혈관 내부와 ICM의 / kdrl 식입니다. 쉬에 대한 염색은 척색에서 관찰되었다.

그림 6
. 그림 6은 dlx2 리보 프로브를 사용하여 34 HPF에서 현장 하이브리드 화 분석의 전체 - 마운트 telencephalon, 간뇌, 시상 하부 및 두개 ectomesenchymal 아치에 dlx2의 발현을 발표, 24 HPF에서 fkd7/foxa1 식 바닥 P에서 주로 볼 수있다늦은 hypochord, 인슐린 염색은 외분비 췌장 내분비 췌장 트립신 식에 관찰된다.

그림 7
그림 7. 적절한 permeabilization 적절한 하이브리드 온도는 현장 하이브리드 화 신호에 분명 매우 중요합니다. 배아에 의해 투과 할 때 쉿 리보 프로브를 사용하여 24 HPF 48 HPF에서 현장 하이브리드 화 분석의 전체 마운트가 배경 신호없이 척색과 floorplate 내 표현을 밝혀 12 ~ 15 분, 70 하이브리드 ° C.에 대한 단백 분해 효소 K 소화 배아 함 소화 (5 분 단백 분해 효소 K 처리) 또는 낮은 온도에서 하이브리드에 노출되었을 때 불완전한 발현 패턴과 높은 배경 신호가 관찰되었다 (60 ° C). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

우리는 높은 해상도로 RNA를 시각화하는 개선 된 방법을 개발했습니다. 현장 하이브리드 절차는 다공성 바닥 (그림 1) 간단한 사용자 정의 - 만든 바구니를 사용하여 수행됩니다. 배아는 무균 조건 하에서 상온에서 6 - 웰 플레이트에서 RNase가없는 솔루션을 사용하여 처리됩니다.

분리 할 배아 바구니는 다른 색깔 에펜 도르프 튜브에서 만들어집니다. 또는 테두리없이 바구니는 쉬운 방향으로 사용되며 특정 프로브에 해당하는 등 바구니에서 배아를 식별 할 수 있습니다.

65 Prehybridization 70 ° C 및 하이브리드 ° 50 %의 탈 아미드와 C는 고해상도 신호를 얻기 위해 특히 중요한 것으로 밝혀졌다. 또한 15 분 포스트 PBST에 대한 알칼리 트리스 버퍼를 두 번 배아를 배양하는 안티 - DIG 항체와 BCIP의 면전에서 배양 이전에 배양 한 후 세척 및NBT는 고품질의 명확한 신호의 모양을 용이하게합니다. 우리의 손에 우리는 70 최적의 시간과 하이브리드에 대한 배아의 permeabilization과 담합 ° C 분명히 신호를 얻기에 매우 중요 이었다는 것을 경험했다. 불충분 한 permeabilization 높은 배경 신호를 생산. 장시간 고정 신호 검출을 억제하는 반면 확장 permeabilization하거나 불충분 한 고정 배아의 분해 결과. 55-60 사이의 교잡 ° C도 높은 배경 신호 (그림 7)를 생산했다.

관심의 유전자가 안티센스 (AS) 성적 증명서를 인코딩하는 경우 감지 프로브는 성적 증명서 AS에 대한 신호를 감지합니다. 염색 반응은 30 분 동안 메탄올 배아를 배치 중지하거나 더 이상 진정한 보라색 컬러로 신호를 변환하고 비특이적 염색을 제거 한 후. 수정 배아는 몇 달 동안 4 ° C에서 스톱 솔루션의 어둠에 저장할 수 있습니다.

장점과 disadvantag소원 에스

소원 배아 동안 표적 유전자의 시간적, 공간적 표현과 애벌레 두 단계의 특성을 효율적으로 기술입니다. 이 프로토콜은 실험 목적에 따라 적절하게 수정을 사용하여 두 유전자 또는 동시에 RNA 및 단백질 발현의 공동 지방화의 RNA 발현의 시각화를 허용합니다. 이러한 높은 해상도 프로토콜은 여러 조직과 세포 유형의 RNA 발현을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 최소한의 배경 신호와 매우 낮은 풍부한 RNA 종의 검출에 사용하실 수 있습니다. 그러나 조직의 내부 구획 내에서 유전자의 정확한 표현을 시각화하는 것은 조직 섹션을 사용하여 현장 하이브리드 화에 필요합니다.

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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