Высокое разрешение Всего горе
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Данио, маленькую тропическую рыбу, стала популярной моделью для изучения функции генов во время развития позвоночных и болезней. Временной и пространственной экспрессии генов-мишеней может быть определена путем

Cite this Article

Copy Citation

Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Эта статья посвящена целом монтажа в гибридизация (желание) эмбрионов рыбок данио. Желание технологии облегчает оценку экспрессии генов как с точки зрения распределения ткани и стадии развития. Протоколы описаны для использования WISH из эмбрионов данио рерио с использованием антисмысловых РНК зондов, меченных дигоксигенином. Зонды генерируются путем включения дигоксигенином связанных нуклеотидов через в пробирке транскрипции гена шаблонов, которые были клонированы и линеаризованный. Хорионов эмбрионов собраны в определенные стадии развития удаляются перед инкубации с зондами. После процедуры промывки, чтобы удалить избыток пробы, эмбрионы инкубировали с анти-дигоксигенин антитела, конъюгированного со щелочной фосфатазой. При использовании хромогенного субстрата щелочной фосфатазы, специфической экспрессии гена может быть оценена. В зависимости от уровня экспрессии гена вся процедура может быть завершена в течение 2-3 дней.

Introduction

Данио (Danio рерио) стал мощным животной модели для изучения развития позвоночных, болезни, поведение и в-скрининга лекарственных 1-3. Эмбрионов данио рерио могут быть получены в больших количествах из одного перехода. Оплодотворения и развитие происходит внутриутробно и бывший оптически прозрачные эмбрионы быстро развиваться. Критические развития событий в течение первых 48 ч после оплодотворения (ФВЧ). Это включает в себя появление зачатков органа и начало дифференцировки клеток. Нокдаун или чрезмерной экспрессии белков может быть достигнуто путем микроинъекции эмбрионы с антисмысловых морфолино (MO) олигонуклеотиды или мРНК, соответственно, на один или два клеточной стадии (0,75 ФВЧ).

Желание эмбрионов рыбок данио облегчает изучение пространственно-временной экспрессии специфических генов, представляющих интерес. Применение желание технику после микроинъекции эмбрионы с мРНК или МО до более-выражениеESS или нокдаун конкретные уровни белка показывает дифференцированного регулирования других генов.

Изменения в характере экспрессии генов можно соотнести с фенотипические изменения и выявить функции генов-мишеней во время раннего органогенеза. Поскольку зонды могут быть получены и сохранены заранее, ISH метод может быть применен, чтобы показать моделей экспрессии генов по крайней мере 20 генов одновременно с использованием шести-луночных планшетах и ​​на заказ корзины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Целом монтажа в гибридизация эмбрионов рыбок данио

1.1 Подготовка эмбрионов

  1. Сбор эмбрионов на необходимые стадии развития. См. Киммел и др.. 5 для эмбрионального описания сцены.
  2. Удалить хорионов вручную с помощью пинцета (Дюмон часовых не Щипцы нет. 5).
  3. Исправить эмбрионов в 4%-ного раствора параформальдегида (PFA) состоит в PBS (фосфатно-солевой буфер) в течение ночи при 4 ° С.
  4. Вымойте эмбрионов с PBS по крайней мере 3 раза по 5 мин при комнатной температуре.
  5. Магазин эмбрионов в 100% метаноле (MeOH) при -20 ° С до использования для будущего применения методов, включая целом монтажа на месте гибридизации.
  6. Замораживание поставил эмбрионов в жидком азоте для экстракции РНК и хранить при температуре -80 ° С.
  7. Извлечение РНК из эмбрионов и поставил синтеза кДНК для ПЦР-амплификации и последующего клонирования.
  8. 1.2 Синтез дигоксигенином-меченых зондов РНК

    1. ПЦР-амплификации и клонирования генов для зонда шаблона. Установка реакции ПЦР с общим объемом 50 мкл, как показано в таблице 1. Использование более геномной ДНК, кДНК или менее в реакции ПЦР в качестве матрицы. Включите 10 мин расширение времени при 72 ° С после последнего цикла, чтобы убедиться, что продукты реакции ПЦР полной длины и 3 'adenylated для облегчения клонирования TOPO.
    Реагент Объем
    ДНК-матрицы 100 нг
    ПЦР-буфера (10x) 5 мкл
    дНТФ (10 мМ) 2 мкл
    Праймеры (10 мМ) 1 мкМ каждого
    Добавьте воду до конечного объема 49,7 мкл
    Taq полимеразы (5 ед / & #956, L) 0,3 мкл
    Реакционного объема 50 мкл

    Таблица 1. PCR реакции амплификации.

    1. Убедитесь, что размер продукта ПЦР с использованием электрофореза в агарозном геле. Предполагаемый размер ПЦР-продукта для синтеза зондов близка к 1 КБ.
    2. Соблюдайте особую осторожность, чтобы избежать загрязнения нуклеазу проведения эксперимента в стерильных условиях и использованием нуклеазы свободной воды. В случае, если несколько продуктов наблюдаются, гель-очистке соответствующего размера ПЦР-продукта, прежде чем приступить клонирование использованием TOPO TA Cloning Kit. Оптимизация ПЦР устранить появление размытия и несколько полос.
    3. Выполнение реакции TOPO клонирование, как указано в таблице 2. Объединение TOPO векторные и ПЦР-продукта и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
    Реагент Химически компетентные клетки Электро компетентных клеток Свежий продукт ПЦР 1-4 мкл 1-4 мкл Солевой раствор 1 мкл Разбавленный раствор соли 1 мкл Воды До общим объемом 5 мкл До общим объемом 5 мкл TOPO вектор 1 мкл 1 мкл Конечный объем 6 мкл 6 мкл

    Таблица 2. TOPO клонирование реакции.

    1. Включение / представить продукт TOPO клонирования в один выстрел компетентных клеток. Tего процесс называется преобразованием.
    2. Инкубируйте трансформированных клеток при 37 ° С в течение не менее 1 часа при 260 оборотах в минуту для обеспечения экспрессии генов устойчивости к антибиотикам. Пластина преобразования смеси (50-100 мкл) на предварительно нагретой Лурия-Бертани (LB) агаром, содержащим 50 мкг / мл ампициллина, и X-гал. Инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
    3. Определить присутствие вставки на основе появление белой или голубой колоний. Вектор TOPO содержит LacZ гена, который кодирует β-галактозидазы. В присутствии X-гал, производство β-галактозидазы, формирует синий цвет. ДНК лигировали в плазмиду нарушает образование функциональных β-галактозидазы и белые колонии производятся. Белые колонии или светло-голубые колонии подтвердить наличие вставки.
    4. Возьмите белый колоний от агара с использованием стерильных наконечников и поместить их в стерильные 10 мл пробирку, содержащую 4 мл LB средств массовой информации и культуры при 37 ° C в инкубаторе встряхиваниемTor в течение ночи при 200 оборотах в минуту.
    5. Очищают плазмиду ДНК с использованием ДНК плазмиды комплект в соответствии с инструкциями производителей.
    6. Линеаризовать кДНК следующих очистки плазмидной расщеплением 5 мкг кДНК для каждого зонда с соответствующим ферментом рестрикции, который имеет уникальный сайт, расположенный 3 '(в смысле зонды), или 5' (для антисмыслового зонда) к вставке.
    7. Очищают линеаризованной ДНК с использованием экстракции фенолом / хлороформом методом. Добавить равным объемом смеси фенол / хлороформ, вершина энергично в течение 30 сек, спин течение 3 мин при 13000 оборотов в минуту при 4 ° С. Передача верхнюю водную фазу в чистую пробирку и добавляют равный объем хлороформа. Вращаться в течение 3 мин при 13 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C. Передача верхнюю водную фазу в чистую пробирку. Добавить 10% ацетата натрия (3 м) и в 2,5 раза объема 100% этанола, осадок ДНК и хранить при температуре -20 ° C в течение ночи. Вращаться в течение 15 мин при 13 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C. Удаления этанола и мыть гранул с 75% этанола. Протокол может быть остановлен, и ДНК может быть STORed при -20 ° С и возобновились на следующий день. Вращаться в течение 10 мин при 10 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C. Удалить супернатант осторожно и сушить гранулы в течение 2 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранул в 10 мкл DEPC-обработанной воды и инкубируют при 55 ° С в течение 20 мин. Количественно концентрация ДНК использованием УФ-спектрометра.
    8. Оценка чистоты путем электрофореза в агарозном геле с использованием 1 мкл ДНК на 1% агарозном геле и работает в течение примерно 30 мин.
    9. Настройка реакции мечения РНК. С помощью РНКазы реакционной ампуле, добавляют 1-5 мкг очищенной ДНК-матрицы в стерильной, свободной от РНКазы, DEPC-обработанной дважды дистиллированной водой до объема 13 мкл. Охлаждают реакционную пробирку на льду и добавляют следующие реагенты (см. таблицу 3):
    Реагент Объем
    NTP маркировки смеси (10x) 2 мкл
    Транскрипция любителяER (10x) 2 мкл
    Protector ингибитора РНКазы 1 мкл
    РНК-полимеразы SP6 или
    РНК-полимеразы Т7 2 мкл
    Конечный объем 20 мкл

    Таблица 3. РНК маркировки реакции.

    1. Смешать реагент осторожно затем собирают в нижней краткие центрифугированием при 2000 оборотах в минуту в течение 30 секунд при комнатной температуре и инкубировали в реакционную смесь в течение 2 ч при 37 ° С.
    2. Удалить матричной ДНК добавлением 2 мкл РНКазы ДНКазы I. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С и останавливают реакцию добавлением 2 мкл 0,2 М ЭДТА (рН 8,0).
    3. Осадок продуктов реакции добавлением 2,5 мкл 4 М LiCl и 100 мкл 75% этанола. Перемешать раствор и держать при температуре -20 ° С в течение 45 мин OR хранят при температуре -20 ° C в течение ночи и протокол возобновились на следующий день.
    4. Центрифуга суспензию в течение 30 мин при 13000 оборотов в минуту при 4 ° С, затем промыть осадок 500 мкл 70% этанола хранили при -20 ° С, центрифуге в течение еще 10 мин, сухой в течение 2 мин и ресуспендируют в 50 мкл и инкубировать на 30 мин при 37 ° С.
    5. Проверьте качество зонда и целостность при помощи 1-2 мл на 1% агарозном геле в течение примерно 30 мин. Это подтверждает наличие одного продукта работает на ожидаемый размер на геле.
    6. Количественно концентрации зонда путем измерения количества РНК с использованием спектрофотометра. Выход из этой реакции составляет около 10 мкг РНК (100-200 нг / мкл).

    1.3 целом монтажа в гибридизация

    1. ДЕНЬ 1
      1. Регидратации
        1. Подготовка корзин использованием нейлоновой сеткой (менее 1 мм, размер пор) и пробирки Эппендорфа. Построить корзины по разрезалг Эппендорфа (1,5 мл), чтобы удалить конических концов. Для идентификации отдельных корзин использовать разноцветные трубы и снимите верхнюю диски от половины из них.
        2. Вырезать небольшие кусочки нейлоновой сеткой, чтобы покрыть разреза концы трубок Эппендорфа. Придерживайтесь разреза концы трубок с нейлоновой сеткой, нагревая их на электрической плитой (устанавливается между средней и высокой) в вытяжной шкаф. После остывания удалить избыток нейлоновая сетка из корзины и хранить их в 100% метаноле при комнатной температуре.
        3. Подготовка последовательных разведений метанола в PBS (75% [объем / объем [метанола, 50% [объем / объем] метанола и 25% [объем / объем] метанол) с помощью первых трех лунках шесть-луночных планшетах с последующим добавлением 100% PBST (фосфатным буферным раствором, содержащим 0,1% Твин-20) в течение ближайших трех скважин.
        4. Тема эмбрионов на месте гибридизации процедуры с помощью корзины на заказ, как показано на Figurea 1а и б. Используйте РНКазы решений вплоть до гибридизацииния шагом в 6-луночные планшеты (4 мл / лунку). Чтобы добиться этого, разместить до 6 корзин в первой скважине. Место обод корзины с первым следующим корзины без дисков в разные цвета расположены последовательно. При использовании такой конструкции до 6 моделей экспрессии генов могут быть определены одновременно.
        5. Наведите обезвоженной эмбрионы того же стадии развития в той же корзины (см. Рисунок 1).
        6. Увлажняет эмбрионов путем перемещения корзины из одной скважины в шесть-луночный планшет к следующему (5 мин для каждого шага). Используйте шесть скважин, заполненных промывочной соответствующий буфер. Эмбрионы подвергают каждое разведение один раз. Таким образом эмбрионы промывали 6х, 5 мин / стирки. Регидратации дегидратированного зародышей достигнуто путем замены метанола с PBS и затем промыванием 3 раза по 100% PBST.
      2. Пермеабилизации Digest регидратации эмбрионов протеиназой К (10 мкг / мл) при комнатной температуре, чтобы сделать их проницаемыми как показано в Таблице 4 Эмбриональной стадии (часы после оплодотворения) Пищеварение периода (протеиназы К) До 6 15 сек 6-12 30 сек 12-18 3 мин 24 12-15 мин 48 25-30 мин 72 40 мин 96-120 50 мин

        Таблица 4. Пермеабилизации реакции.

      3. Вторичная фиксация и PBST Моет
        1. Исправить эмбрионов путем инкубации в 4% параформальдегид (вес / объем) в 1 × PBS в течение 20 мин.
        2. Удалите остатки параформальдегиде путем промывки эмбрионов 3x, 5 мин / стирка, 1x в PBST.
        </ Li>
      4. Ацетилирование Подготовьте ацетилирования смеси (125 мкл триэтаноламина и 27 мкл уксусного ангидрида в 10 мл DDH 2 O) и инкубировать эмбрионов два раза по 10 минут каждый. Чтобы свести к минимуму эндогенной активности фосфатазы, готовить свежую смесь ацетилирования при необходимости. Для удаления избытка реагента, мыть эмбрионов два раза в PBST (10 мин / стирка)
      5. Предгибридизацию Prehybridize эмбрионов путем переноса эмбрионов из корзин до 1,5 мл стерильной Эппендорф труб и инкубирования 200 мкл смеси гибридизации в течение 2-4 ч в 70 ° С водяной бане.
      6. Предадсорбционного из антител Удалите около 50 эмбрионов из корзины и передавать их в 1,5 мл стерильной Эппендорф труб. Инкубируют с анти-DIG-AP (1:500) антител с использованием блокирующего буфера (1x PBST, 2% сыворотки теленка [объем / объем], 2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина [БСА]) при комнатной температуре в течение 2-4 ч, , а затем хранят при температуре 4 ° С в течение ночи. Удалить из инкубатора утромD позволяют эмбрионов до комнатной температуры.
      7. Гибридизация добавить 100-200 нг зонда к предварительно гибридизировали эмбрионов и инкубируют в течение ночи при 70 ° С на водяной бане.
    2. ДЕНЬ 2
      1. SSC (физиологическим раствором цитрата натрия) Моет
        1. Место 50 мл пробирки гибридизации смеси (ТМ), 2х SSC и 0,2 × SSC в химический стакан с водой при 70 ° C водяной бане и prewarm них, по крайней мере, 20 мин. Удаляют смесь реакции гибридизации, содержащий зонд, добавляют 1 мл предварительно нагретого смесь гибридизации в пробирки и инкубируют в течение 15 мин при 70 ° С. Заполните шесть-луночных планшетах с различными разведениями нагретого ТМ в 2х SSC заменой 100% П через 50% до 25% П, чтобы удалить избыток реагентов.
        2. Ожидая, заполнить шесть-луночных планшетах с 2х SSC для мытья и держать их при температуре 70 ° C.
        3. Через 15 минут место эмбрионов из трубки корзины хранится в шесть-луночный планшет наполнен разбавлениес ТМ с 2х SSC и мыть гибридизированной эмбрионов путем перемещения корзины из одной ямы в следующем (15 минут в каждом из 70 ° С водяной бане). Мытье эмбрионов 2x, 15 мин / стирки, в 100% 2х SSC при 70 ° С.
        4. Установите другую водяной бане при температуре 65 ° С. Заполните шесть-луночных планшетов с 0,2 x SSC высокой жесткости моет, чтобы избежать неспецифического гибридизации транскриптов с зондом.
        5. После эмбрионы дважды промывали 2х SSC при 70 ° С, далее следуют два 30 мин промывками в 0,2 × SSC при 65 ° С.
      2. PBST Смывки Подготовьте шесть-луночных планшетах при последовательном разведении 0,2 x SSC в PBST следующим образом: 75% (об / об) 0,2 x SSC, 50% (об / об) 0,2 x SSC, 25% (об / об) 0.2x SSC, а остальные две скважины со 100% PBST. Промыть гибридизированных эмбрионов путем перемещения корзины с одной скважины к следующему (5 мин на каждом этапе при комнатной температуре с использованием коромысло).
      3. Преинкубация Preincubate эмбрионов в течение 3-4 часов при комнатной температуре в БлоCking буфера (1x PBST, 2% сыворотки теленка [объем / объем], 2 мг / мл BSA).
      4. Инкубация с анти-DIG антител Инкубировать эмбрионов с раствором анти-DIG-AP антитела (1:5000) в блокирующем буфере в течение ночи при 4 ° С при осторожном перемешивании.
    3. ДЕНЬ 3
      1. PBST Смывки Подготовьте шесть-луночных планшетах с 4 мл / лунку PBST. Вымойте Инкубированную эмбрионов путем перемещения корзины на шесть-луночный планшет, содержащий PBST 6x для периодов по 15 мин. Эмбрионы могут храниться при 4 ° С и протокол возобновил на следующий день.
      2. Prestaining Prestain эмбрионов путем промывки 2x в течение 15 мин с prestaining буфере при комнатной температуре при осторожном перемешивании до инкубации в присутствии BCIP (5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат) и NBT (нитросиний тетразолий). BCIP и NBT являются субстраты, используемые для развития окраски активности щелочной фосфатазы. С зонды крепятся й Щелочная фосфатазаэлектронной развитию фиолетовый цвет указывает на экспрессию гена-мишени. Эмбрионы могут храниться при 4 ° С и протокол возобновил на следующий день.
      3. Окрашивание
        1. Инкубируйте эмбрионов при комнатной температуре в темноте с BCIP и NBT течение 30 мин.
        2. Мониторинг реакции окрашивания каждые 30 мин с использованием стереомикроскопа. Время реакции варьировать от 15 минут до 16 часов в зависимости от уровня экспрессии генов. Время реакции короче для высокий уровень экспрессии генов и больше времени для слабо выраженных генов. Смысл датчиков обнаруживает сигналы, если интересующий ген экспрессирует дополнительный антисмысловой (AS) транскриптов.
      4. Остановка реакции После достижения желаемой интенсивности окрашивания достигается остановить реакцию, путем передачи корзины содержащие эмбрионов в лунки, содержащие стоп-раствора (1 × PBS, рН 5,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Твин). Это позволит избежать дальнейшего развития окраски. Промойте эмбрионы в течение 10 мин 2x на качалке с нежным AGтации при комнатной температуре.
      5. Вторичная фиксация
        1. Инкубируйте эмбрионов в параформальдегид 4% (вес / объем) в PBS в течение 20 мин.
        2. Промыть эмбрионы (5 мин / стирка) три раза PBST для удаления остаточного формальдегида. Храните фиксированных эмбрионов в универсальное решение в темноте при 4 ° С.
      6. Монтаж, наблюдение и Image Acquisition
        1. Перенос эмбрионов в шесть-луночный планшет, содержащий 100% глицерина с использованием минимально возможного объема PBS. Поместите шесть-луночного планшета на качалку и осторожно перемешивать в течение ночи при комнатной температуре в темноте.
        2. Наведите эмбрионов в 100% глицерина, а потом наблюдать сигнал под стереомикроскопом.
        3. Получить изображения, сохранить как файл формата Tiff или любого другого типа, которая позволяет получать изображения высокого качества за счет использования образа программного обеспечения, таких как Photoshop (рис. 3-6).

    я N гибридизация

    1. Для достижения двойного мечения описанным выше способом с 1,1 - 1.3.1.7 используется, но включает одновременной инкубацией как дигоксигенином и флуоресцеина меченых зондов при гибридизации.
    2. Выполните ту же процедуру для последующей гибридизации моет именно SSC и PBST автомойки (шаги 1.3.2.1 и 1.3.2.2) и блокирование инкубации (стадия 1.3.2.3). Выполнение антител и окрашивания реакции последовательно, как описано ниже.
    3. Выдержите эмбрионов с AP-связанной-анти-дигоксигенина антитела (1:5000) при 4 ° С при легком помешивании.
    4. Вымойте и инкубировать с BCIP-NBT (шаги 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
    5. После обнаружения, мыть эмбрионов дважды ЗФРТ при комнатной температуре в течение 20 мин.
    6. Инкубируйте эмбрионов при 65 ° С в PBST с 1 мМ ЭДТА в течение 30 минут для инактивации анти-дигоксигенин антителом.
    7. Инкубируйте эмбрионов в 100% метанолом, а затем регидратации в 75%, 50% и 25% метанола умч PBST и обратно в PBST в течение 1 часа.
    8. Выдержите в течение ночи эмбрионов AP связью флуоресцеина (1:2000) в блокирующем буфере при 4 ° С при легком помешивании.
    9. Мытье эмбрионов с PBST (шаг 1.3.3.1) и предварительно пятна эмбрионов 2 раза в течение 15 мин с предварительно окрашивания буфера (0,1 М трис-HCl, рН 8,2) при комнатной температуре при осторожном перемешивании до инкубации в присутствии быстро красный . Протокол может быть остановлена ​​и эмбрионы могут храниться при температуре 4 ° C при осторожном перемешивании и возобновились на следующий день.
    10. Растворите один Fast Red таблетка в 2 мл буфера окрашивания непосредственно перед использованием.
    11. Начало реакции окрашивания путем размещения эмбрионов в окрашивании буфера с Fast Red реагента.
    12. Стоп окрашивание реакции, когда желаемая интенсивность окрашивания будет достигнута. Это может занять от нескольких часов при комнатной температуре, чтобы один или два дня в одночасье, когда окрашивание при 4 ° C. Остановить реакцию немедленно, если интенсивность окрашивания не развивается дальше или начинает показывать неспецифическихность по сравнению с чувством управления.
    13. Выполните действия, описанные выше, для остальных шагов именно сообщение фиксации, монтаж, наблюдения и получения изображений (steps1.3.3.5 и 1.3.3.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Использование протокола с 50 эмбрионов в корзину (на ген / в экспериментальных условиях) паттерн экспрессии этого гена может быть достигнуто в одном эксперименте. Почти все эмбрионы обнаруживают аналогичные модели выражение для конкретного гена. Характерные примеры на месте окрашивания гибридизации показаны на рисунках 3-6.

Оба смысла и антисмысловых рибозонды были синтезированы из кДНК, соответствующие PC5.1, PC5.2 6, 7 SCL/tal-1, GATA-1 8,9, FLK / kdrl 10, тсс 11, Dlx2 12, fkd7 / FOXA1 13, инсулин 14,15, трипсин и 16 были сконструированы путем амплификации сегмента во всю длину мРНК с использованием Taq ДНК-полимеразы и клонировали в PCRII-TOPO (Invitrogen). Подлинность отдельных ампликонов была подтверждена секвенированием. После проверки клон ориентации, соответствующей антисмысловые рибозонды были синтезированыс использованием протоколов 17 с изменениями, 18,19, как описано здесь с использованием либо Sp6 или Т7 РНК-полимеразы. Этапы целом монтажа в гибридизация кратко проиллюстрированы на рисунке 2. Фиолетовый окрашивание наблюдалось после гибридизации с рибозонд интерес представляет и обилие и сайты экспрессии конкретного гена. Например PC5.1 показывает очень дискретных выражение в передней и задней части слухового пузырька и бокового зачатка линии 24hpf и сильно локализована в передней и задней боковой линии невромастами на 72 HPF (рис. 3). В отличие PC5.2 шоу повсеместной экспрессии в ЦНС с различными регионализации в сомитах слуховым пузырьком и пронефрических проток и экспрессируется на высоком уровне в печени и кишечнике на 96 HPF (рис. 4). Отсутствие экспрессии генов при использовании соответствующих рибозонды смысле служит в качестве отрицательного контроля. ( 4б). Выражение анализы крови маркеров показало окрашивание SCL/tal-1 рамках двустороннего черепных клетках и в промежуточной клеточной массы (ICM). Хотя окрашивание на гата-1 также рассматривать в ICM выражении картина иная. Выражение FLK / kdrl наблюдался в заднем мозге, основной и между сегментами сосудов и в ICM (рис. 5). Окрашивания тсс наблюдался в хорде (рис. 5). Выражение Dlx2 на 34 HPF локализуется в конечного мозга, промежуточного мозга, гипоталамус и черепно эктомезенхимы арки и fkd7/foxa1 выражением на 24 HPF видно в основном в пол и пластины hypochord. Выражение модели поджелудочной маркеров показал, инсулина окрашивание в поджелудочной железе эндокринной и трипсина в экзокринной поджелудочной железы (фиг. 6). Эти результаты, показывающие, паттерн экспрессии с высоким разрешением представляет успех намеченных протоколадля выявления экспрессии высокого и низкого обильные генов. Для получения дополнительной ясности изображения могут быть приняты с помощью конфокальной микроскопии после монтажа эмбрионов на микроскопическом слайде 20. Некоторые из примеров результаты, полученные при эксперименте была предпринята под суб-оптимальных условий при оптимизации протокола показаны на рисунке 7. Сигнала высокого фона с плохим тсс выражении был замечен в неадекватных пермеабилизации и гибридизации между 55-60 ° C.

Рисунок 1
Рисунок 1. Подготовка и использование Эппендорф-нейлоновая сетка корзины провести поставил эмбрионов. Один хорошо может содержать шесть-Эппендорф нейлона корзины сетки. На рисунке показан 6-и стерильные чашки, содержащие шесть-Эппендорф нейлоновые сетки корзиныиспользоваться для последовательных разведений метанола в PBS.

Рисунок 2
Рисунок 2. Схема этапов целом монтажа на месте технику гибридизации. После фиксации постановке эмбрионы могут быть сохранены в метаноле при температуре от -20 ° C до использования. Зонды могут быть синтезированы заранее и хранили при -80 ° С. Хранение зонды малыми порциями рекомендуется, если они хотят использовать в течение длительного периода. В общем целом монтажа экспериментов на месте гибридизация может быть завершена в 3 или 4 дня. Окрашивание реакции слабо выражены генов может занять до 16 часов при комнатной температуре или дольше, если реакции окрашивания осуществляется при 4 ° С Нажмите здесь, чтобы увеличить Figure.

Рисунок 3
Рисунок 3. Выражение PC5.1 по целом монтажа на месте анализ гибридизации проводили с использованием 24 часов после оплодотворения и 72 часов после оплодотворения поставил эмбрионов. (А) Вид сбоку 24 часов после оплодотворения эмбрионы показывают очень дискретное выражение PC5.1 в передней и задняя часть слухового пузырька и бокового зачатка линии с использованием PC5.1 антисмысловым рибозонд. Через 72 часов после оплодотворения специфического окрашивания наблюдался в передних и задних боковых невромастами линии. (Б) отсутствие экспрессии генов использованием PC5.1 смысле рибозонд служит в качестве отрицательного контроля. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

gether.within-страница = "всегда"> Рисунок 4
Рисунок 4. Через 24 часов после оплодотворения и 96 часов после оплодотворения целом монтажа на месте анализ гибридизации PC5.2 проводили с использованием PC5.2 антисмысловые и смысловые рибонуклеотидные зонды. (А) Боковой вид 24 эмбрионов HPF показать повсеместной экспрессии в ЦНС, сомитами слуховым пузырьком и пронефрических канала. Специфическое окрашивание в печени и кишечнике наблюдается при использовании ФВЧ 96 PC5.2 антисмысловым рибозонд. (Б) отсутствие экспрессии генов использованием PC5.2 смысле рибозонд служит в качестве отрицательного контроля. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

oad/50644/50644fig5.jpg "ширина =" 500px "/>
. Рисунок 5 целом монтажа на месте анализы гибридизации при использовании ФВЧ 24 SCL/tal-1 рибозонд показали окрашивания в рамках двустороннего черепных клетках и в промежуточной клеточной массы (ICM); гата-1 рибозонд окрашивание наблюдается в ICM; FLK / kdrl выражение в заднем мозге, основной и между сегментами сосудов и в ICM. Окрашивание на тсс наблюдался в хорде.

Рисунок 6
. Рисунок 6 целом монтажа на месте анализы гибридизации при использовании ФВЧ 34 Dlx2 рибозонд показал выражение Dlx2 в конечный мозг, промежуточный мозг, гипоталамус, и черепно эктомезенхимы арками; fkd7/foxa1 выражении на 24 HPF видно в основном в пол Pпоздно и hypochord; инсулина окрашивание наблюдается в поджелудочной железе эндокринной и трипсина выражение в экзокринной части поджелудочной железы.

Рисунок 7
Рисунок 7. Адекватные пермеабилизации и соответствующей температуры гибридизации важны четкие сигналы на месте гибридизации. Целом монтажа на месте анализы гибридизации при 24 и 48 часов после оплодотворения HPF использованием тсс рибозонд показал выражение в хорды и донной без фонового сигнала, когда эмбрионы от проницаемыми протеиназы К пищеварения в течение 12-15 мин и гибридизовали при 70 ° С. Неполное паттерном экспрессии и высокой фоновые сигналы наблюдались при эмбрионы были подвергнуты недостаточное переваривание (5 мин протеиназой К) и гибридизовали при низкой температуре (60 ° C). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы разработали более совершенные методы визуализации РНК с высоким разрешением. На месте процедуры гибридизации осуществляется с помощью простых заказ корзин с пористыми днищ (рис. 1). Эмбрионы обрабатываются с использованием РНКазы решений в 6-луночных планшетах при комнатной температуре в стерильных условиях.

Для разделения эмбрионов корзины изготавливаются из различных цветных труб Эппендорф. Корзины с или без оправы используются для облегчения ориентации и для идентификации эмбрионов в корзине, как соответствующие конкретному зонда.

Предварительную гибридизацию при 65 ° С и гибридизации при 70 ° С с 50% деионизированной формамид было обнаружено, что особенно важно для получения сигналов высокого разрешение. Кроме того инкубации эмбрионов дважды щелочного буфера Трис PBST в течение 15 мин после моет после инкубации с анти-DIG антител и перед инкубацией в присутствии и BCIPNBT способствует возникновению ясности высокого качества сигналов. В наших руках мы испытали, что проницаемости и фиксации эмбрионов для оптимального времени и гибридизации при 70 ° С были очень критичны в получении четких сигналов. Недостаточное пермеабилизации производятся сигналы высокой фоне. Расширенные проницаемости или недостаточной фиксации приводит к деградации эмбрионов в то время как расширенное фиксации ингибирует сигнал обнаружения. Гибридизация между 55-60 ° C также производятся сигналы высокого фона (рис. 7).

Смысле зонд будет обнаруживать сигнал для AS транскрипт, если интересующий ген кодирует антисмысловую (AS) транскриптов. После окрашивания реакцию останавливают размещения эмбрионов в метаноле в течение 30 мин или дольше преобразует сигнал к истинному фиолетовый цвет, и удаляет неспецифическое окрашивание. Фиксированный эмбрионы могут храниться в темноте в стоп-раствора при 4 ° С в течение нескольких месяцев.

Преимущества и disadvantagЭС WISH

WISH является эффективным методом для характеристики как временную и пространственную экспрессию генов-мишеней во время эмбриогенеза и личиночной стадии. Этот протокол также обеспечивает визуализацию РНК экспрессии двух генов или совместной локализации РНК и экспрессии белка в то же время с использованием соответствующих модификаций в зависимости от экспериментальных целей. Этот протокол высокого разрешения может быть использован для обнаружения экспрессии РНК во многих тканях и типах клеток. Он может быть использован для обнаружения очень низких массовых видов РНК с минимальным сигналы фоне. Однако, чтобы визуализировать точную экспрессии генов в пределах внутренних отделений тканей требует на месте гибридизации с использованием срезов ткани.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
  3. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
  4. Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
  5. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  6. Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
  7. Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
  8. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
  9. Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
  10. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124-381 (1997).
  11. Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
  12. Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
  13. Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
  14. Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
  15. Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
  16. Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
  17. Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
  18. Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
  19. Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
  20. Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats