高解像度全マウント
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

この記事では、ゼブラフィッシュ胚のin situハイブリダイゼーション(WISH) 全体のマウントに焦点を当てています。 WISH技術は、組織分布及び発達段階の両面での遺伝子発現の評価を容易にする。プロトコルはジゴキシゲニンで標識されたアンチセンスRNAプローブを用いてゼブラフィッシュ胚のWISHの使用について記載されている。プローブは、クローン化し、線形化された遺伝子テンプレートのインビトロ転写を介してジゴキシゲニン-結合ヌクレオチドを組み込むことによって生成される。定義された発達段階で収穫された胚のchorionsは、特異的なプローブとのインキュベーションの前に削除されます。過剰のプローブを除去するための洗浄工程の後、胚は、アルカリホスファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体と共にインキュベートする。アルカリホスファターゼのための発色基質を用いることにより、特異的な遺伝子発現を評価することができる。遺伝子発現のレベルに応じて、全体の手順は、2〜3日以内に完了することができる。

Introduction

ゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ脊椎動物の発生、病気、行動、そして1-3の薬物スクリーニングの研究のための強力な動物モデルとして登場しました。ゼブラフィッシュ胚を単交雑から大量に得ることができる。受精と開発は元子宮を発生し、光学的に透明な胚は急速に発展。重要な発達のイベントは最初の48時間後に受精(HPF)中に発生する。これは、臓器原基の外観と細胞分化の開始が含まれています。ノックダウンまたはタンパク質の過剰発現は、アンチセンスモルホリノ(MO)オリゴヌクレオチドを​​用いた胚のマイクロインジェクションによって達成又は1つ又は2つのセルステージ(113 HPF)でそれぞれmRNAをすることができる。

ゼブラフィッシュ胚のWISHは、関心のある特定の遺伝子の時空間表現の研究を促進する。オーバーexprとmRNAまたはMOと胚のマイクロインジェクション後にWISH技術の応用ESSまたはノックダウン特定のタンパク質レベルは、他の遺伝子の差動規制を明らかにする。

遺伝子発現パターンの変化は、表現型の変化と相関し、早期器官中に標的遺伝子の機能を明らかにすることができる。プローブを調製し、予め記憶することができるので、ISH技術は、6ウェルプレートとカスタムメイドのバスケットを使用して、一度に少なくとも20の遺伝子の遺伝子発現パターンを明らかにするために適用することができる。

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Protocol

1。ゼブラフィッシュ胚のin situハイブリダイゼーションホールマウント

胚の1.1準備

  1. 必要な発達段階で胚を収集します。胚の段階については、キンメル 5を参照してください。
  2. 鉗子(デュモン時計屋がない。5鉗子ません)を使用して手動でchorionsを削除します。
  3. PBSに成っホルムアルデヒドの4%溶液(PFA)に胚を固定し、4℃で一晩(リン酸緩衝生理食塩水)
  4. 3倍、少なくとも室温で5分間ずつPBSで胚を洗浄します。
  5. in situハイブリダイゼーションホールマウントを含む技術の将来のアプリケーションに使用するまで-20℃で、100%メタノール(メタノール)で保管の胚。
  6. フリーズは、-80℃でRNA抽出や店舗用の液体窒素中に胚を上演
  7. 上演胚からRNAを抽出し、PCR増幅およびその後のクローニングのためのcDNAを合成。
  8. ジゴキシゲニン標識RNAプローブの合成1.2

    1. プローブテンプレートのPCR増幅および遺伝子クローニング。 表1に示すように全量50μlでセットアップPCR反応。テンプレートとしてPCR反応でよりゲノムDNAまたは以下のcDNAを使用してください。 72時10分延長時間を含め°CのPCR反応生成物はTOPOクローニングを容易にするために、アデニル全長および3 'であることを確認する最後のサイクルが続く。
    試薬 ボリューム
    テンプレートDNA 100ngの
    PCR緩衝液(10倍) 5μlの
    のdNTP(10mM)を 2μlの
    プライマー(10ミリモル) 1μMの各
    最終容量に水を加える 49.7μlの
    Taqポリメラーゼ (5単位/&#956、L) 0.3μL
    反応容積 50μlの

    表1。PCR増幅反応。

    1. アガロースゲル電気泳動を用いたPCR産物のサイズを確認する。プローブ合成のためのPCR産物の推定サイズは1キロバイトに近接しています。
    2. 無菌条件下で実験を実施し、ヌクレアーゼフリーの水を使用することによりヌクレアーゼの混入を避けるために特別な注意を払ってください。複数の製品が観察された場合には、TOPO TAクローニングキットを用いてクローニングを進める前に、適切なサイズのPCR産物をゲル精製する。スミアと複数のバンドの出現を排除するためのPCR反応を最適化します。
    3. 表2に示すように、TOPOクローニング反応を行う。 TOPOベクターとPCR製品を結合し、5分間室温でインキュベートする。
    試薬 化学的にコンピテントセル エレクトロコンピテントセル 新鮮なPCR反応生成物 1-4μlの 1-4μlの塩溶液 1μlの希釈塩溶液 1μlの水 5μLの容積を合計で最大 5μLの容積を合計で最大 TOPOベクター 1μlの 1μlの 最終巻 6μL 6μL

    表2。TOPOクローニング反応。

    1. ワンショットコンピテント細胞にTOPOクローニング製品を紹介/組み込む。 T彼のプロセスは、変換と呼ばれています。
    2. 抗生物質耐性遺伝子の発現を確保するために260 rpmで少なくとも1時間37℃で形質転換された細胞をインキュベートする。 50μgの/ mlのアンピシリンとX-galを含む温めルリアベルターニ(LB)寒天プレート上にプレート変換ミックス(50〜100μl)を。 37℃で一晩インキュベートする。
    3. 白や水色コロニーの外観に基づいて、インサートの有無を決定します。 TOPOベクターは、β-ガラクトシダーゼをコードしているlacZ遺伝子が含まれています。 X-galの存在下で、β-ガラクトシダーゼの生産は青色を形成する。機能的なβ-ガラクトシダーゼ、白色コロニーの形成を破壊プラスミドにライゲーションDNAが生成される。白色コロニーまたは水色コロニーがインサートの存在を確認。
    4. 滅菌したピペットチップを使用した寒天プレートから白色コロニーを選択し、振とうインキュベーションで37℃でLBメディアと文化の4ミリリットルを含む滅菌を10mlのチューブ°Cの中に置いてください200 rpmで一晩器。
    5. 製造者の指示に従ってプラスミドDNAキットを用いてプラスミドDNAを精製する。
    6. インサート3 '(センスプローブの場合)または5'(アンチセンスプローブ)に位置するユニークな部位を有する適当な制限酵素で各プローブcDNAの5μgを消化することによりcDNAを以下のプラスミド精製を線形化する。
    7. フェノール/クロロホルム抽出法を用いて線状化DNAを精製する。秒、4℃で13,000 rpmで3分間℃でスピンが30のために精力的に、フェノール/クロロホルム頂点等量を追加きれいなチューブに上層水相を移し、等量のクロロホルムを加える。 4℃で13,000 rpmで3分間スピンきれいなチューブに上層水相を転送します。一夜-20℃で沈殿させDNAとストアに10%の酢酸ナトリウム(3 M)、100%エタノール2.5倍容積を加える。 4℃で13,000 rpmで15分間スピンエタノールを除去し、75%エタノールでペレットを洗浄。プロトコルを停止することができ、DNAは、STができる-20℃で論理和、翌日再開した。 4℃で10,000 rpmで10分間スピン慎重に上清を除去し、室温で2分間、ペレットを乾燥させます。 20分間55℃でDEPC処理水とインキュベート10μlにペレットを再懸濁します。 UV分光光度計を用いてDNA濃度を定量化する。
    8. アガロースゲル電気泳動による純度1%アガロースゲルでDNA1μlのを使用し、約30分間のランニングを評価する。
    9. RNAラベリング反応を設定します。 RNaseを含まない反応バイアルを使用し、13μLの容積に無菌、RNaseフリー、DEPC処理、再蒸留水にテンプレートDNAの精製1-5μgのを追加します。氷上で反応バイアルを冷却した( 表3を 参照 )以下の試薬 ​​を追加します。
    試薬 ボリューム
    NTPラベル混合物(10倍) 2μlの
    転写バフER(10倍) 2μlの
    プロテクターのRNase阻害剤 1μlの
    RNAポリメラーゼSP6 または
    RNAポリメラーゼT7 2μlの
    最終巻 20μlの

    表3のRNAラベリング反応。

    1. 試薬を混在させることが穏やかに室温で30秒間2,000 rpmで短時間の遠心分離により収集し、底に37℃で2時間反応混合物をインキュベート℃で
    2. 37℃で30分間2μlのRNaseフリーのDNase I.インキュベートを追加することで、鋳型DNAを取り出し、2μlの0.2 M EDTA(pH 8.0)を加えて反応を停止させる。
    3. 2.5μlの4 M LiClを、75μlの100%エタノールを添加して反応生成物を沈殿させた。ソリューションを混ぜ、45分Oのために-20℃で保つrは-20℃で保存し、オーバーナイトとプロトコルが次の日再開した。
    4. 4℃13,000 rpmで30分間、℃、用サスペンションを遠心分離後、-20℃で保存500μlの70%エタノールでペレットを洗浄℃で2分間乾燥したC、さらに10分間遠心分離をし、50μlの再懸濁とインキュベート37℃で30分で
    5. 約30分間、1%アガロースゲルで1〜2ミリリットルを実行することにより、プローブの品質と整合性を確認します。これは、ゲル上で予想されたサイズで動作する単一の製品の存在によって確認された。
    6. 分光光度計を用いてRNAの量を測定することにより、プローブの濃度を定量化する。この反応からの収率は、RNAの約10μg(μL/ 100-200 NG)です。

    in situハイブリダイゼーション 1.3ホールマウント

    1. DAY 1
      1. 水分補給
        1. ナイロンメッシュ(1mm未満の細孔径)とエッペンドルフチュー​​ブを使ってバスケットを準備します。のcuttinでバスケットを構築円錐形の両端を削除するgのエッペンドルフチュー​​ブ(1.5ミリリットル)。個々のバスケットは異なる色のチューブを使用し識別し、上部を削除するには、そのうちの半分からリム。
        2. エッペンドルフチュー​​ブの切断端をカバーするためにナイロンメッシュの小片をカット。ドラフトの電気ホットプレート(高媒体との間に設定)にそれらを加熱することによりナイロンメッシュにチューブの切断端を貼り付けます。一旦冷却すると、バスケットから余分なナイロンメッシュを削除して、室温で100%のメタノールに保管してください。
        3. 100%に続いて6ウェルプレートの最初の三つの井戸を使用してPBS中のメタノールの連続希釈液(75%[容量/容量[メタノール、50%[容量/容量]メタノールと25%[容量/容量]メタノール)を準備次の3つのウェルでPBST(リン酸0.1%のTween-20を含有する緩衝化生理食塩水)。
        4. Figurea 1aおよび(b)で示すようにカスタムメイドのバスケットを使用してin situハイブリダイゼーション法の対象となる胚。ハイブリダイゼーションにRNaseフリーのソリューションを使用してください6ウェルプレートでるステップ(4ミリリットル/ウェル)。これを達成するには、よく最初の6バスケットまで置く。縁のある場所のバスケットは、最初の連続して配置の異なる色で縁なしのバスケットが続く。最大6遺伝子発現パターンにこの構成を使用して同時に決定することができる。
        5. 同じバスケット( 図1を 参照 )と同じ発達段階の脱水胚を置きます。
        6. 6ウェルプレートの1ウェルから次(各ステップの5分)にバスケットを移動することによって胚を再水和。適切な緩衝液で満たされた6の井戸を使用してください。胚は一度各希釈に供される。このようにして胚を6倍、5分/洗濯洗浄する。脱水胚の再水和を、次いで、100%PBSTで3回洗浄して、PBSでメタノールに置き換えることによって達成される。
      2. 表4に示すように、 透過ダイジェストは、室温でプロテイナーゼK(10μgの/ ml)を有する再水和胚は透それらをレンダリングする 胚のステージ(時間後に受精) 消化期間(プロテイナーゼK) 最大6 15秒 6-12 30秒 12-18 3分 24 12-15分 48 25〜30分 72 40分 96から120 50分

        表4。透過化反応。

      3. かん流後とPBSTウォッシュ
        1. 20分間1×PBS中4%パラホルムアルデヒド(重量/容量)でインキュベートすることにより、胚を固定します。
        2. 、3倍の胚を洗浄することにより、1×PBSTで5分/洗浄、残留ホルムアルデヒドを削除します。
        </李>
      4. アセチル化は 10分ごとに倍アセチル化混合物(10ミリリットルのddH 2 Oで125μlのエタノールと27μlの無水酢酸)とインキュベート胚を準備します。必要なときに内因性ホスファターゼ活性を最小限に抑えるために、アセチル化混合物は、新鮮な準備。過剰の試薬を除去するために、(10分/洗浄)PBSTで二回胚を洗う
      5. プレハイブリダイゼーションは、バスケットから2.4 mlの滅菌エッペンドルフチューブに移し、胚を70℃の水浴中で2-4時間、200μlのハイブリダイゼーション混合物でインキュベートすることにより胚をプレハイブリダイゼーション。
      6. 抗体の予備吸着は、バスケットから約50胚を取り出し、1.5 mlの滅菌エッペンドルフチューブに移す。ブロッキングバッファーを用いた抗DIG-AP(1:500)抗体(1×PBST、2%ウシ血清[容量/容量]、2 mg / mlのウシ血清アルブミン[BSA])2-4時間、室温で、とインキュベートその後、4℃で一晩保存してください。午前中にインキュベーターから削除dは胚が室温に到達させる。
      7. ハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイズ胚へのプローブの100-200 ngのを追加し、70℃で一晩インキュベート°の水浴中でC。
    2. DAY 2
      1. SSC(生理食塩水、クエン酸ナトリウム)洗う
        1. ハイブリダイゼーション混合物の場所を50mlチューブ(HM)、70℃の水浴中で水と少なくとも20分のためにそれらをprewarmとビーカーで2倍SSCおよび0.2×SSC。プローブを含むハイブリダイゼーション反応混合物を取り外し、チューブに予め温めハイブリダイゼーション混合液1mlを加え、70℃で15分間インキュベート℃に過剰の試薬を除去するために、50%〜25%のHMを通じて100%のHMを置き換えることにより、2×SSC中で温めHMの様々な希釈で6ウェルプレートを埋める。
        2. 待っている間、洗浄のために2×SSCで6ウェルプレートを記入し、70でそれらを保つ℃に
        3. 15分の場所後バスケットにチューブから胚は希釈でいっぱい6ウェルプレートに保持2×SSCでHMのSとは、次の(70℃の水浴中で15分間ずつ)に1つのウェルからバスケットを移動することによってハイブリダイズ胚を洗う。胚の2倍、70で100%の2×SSCで15分/洗濯、℃で洗う
        4. 65で別の水浴℃に設定しますプローブと転写産物の非特異的ハイブリダイゼーションを避けるために、洗浄、高ストリン用0.2×SSCで6ウェルプレートを埋める。
        5. 胚は℃、65℃0.2×SSC中でさらに2 30分の洗浄に従う70℃2×SSCで二回洗浄した後
      2. PBST洗浄は次のよう PBSTで0.2×SSCの連続希釈液6ウェルプレートを準備します:75%(体積/体積)0.2×SSC、50%(体積/体積)0.2×SSC、25%(体積/体積)0.2× SSC、残りの2つのウェル100%PBSTである。 (ロッカーを使用して室温でステップごとに5分)1つのウェルから次のかごを移動することによってハイブリダイズ胚を洗う。
      3. BLO室温で3-4時間、 プレインキュベーション Preincubate胚ckingのバッファ(1×PBST、2%ウシ血清[容量/容量]、2 mg / mlのBSA)。
      4. °C穏やかに攪拌しながら4℃で一晩ブロッキングバッファー中の抗DIG-AP抗体(1:5,000)の溶液と抗DIG抗体のインキュベートの胚とのインキュベーション
    3. DAY 3
      1. PBST洗浄がうまく4ミリリットル/ PBSTで6ウェルプレートを準備します。 15分の期間に6倍PBSTを含む6ウェルプレートにバスケットを移動することによって培養胚を洗う。胚は4℃で保存し、プロトコルが翌日再開することができる。
      2. Prestainingは BCIP(5 -ブロモ-4 -クロロ-3 -インドリルホスフェート)とNBT(ニトロブルーテトラゾリウム)の存在下でインキュベーション前に穏やかに攪拌しながら室温でバッファをprestainingで15分間、2倍洗浄することにより胚をPrestain。 BCIPとNBTは、アルカリホスファターゼ活性の発色に用いられる基板である。プローブは、アルカリホスファターゼ番目が取り付けられているので紫色の電子開発は、標的遺伝子の発現を示す。胚は4℃で保存し、プロトコルが翌日再開することができる。
      3. 染色
        1. 30分間BCIPとNBTと暗闇の中で室温で胚を培養する。
        2. 染色反応を実体顕微鏡を使って30分ごとに監視します。反応時間は、遺伝子発現のレベルに応じて、15分間、16時間ごとに異なる​​。反応時間は弱く発現遺伝子を高度に発現される遺伝子のために短く、長い。目的の遺伝子が相補的なアンチセンス(AS)の転写産物を表現する場合、センスプローブは、信号を検出します。
      4. 所望の染色強度に達した後、反応を停止し 、停止溶液(1×PBS、pH5.5で、1mMのEDTA、0.1%トゥイーン)を含有するウェルに胚を含むバスケットを転送することによって反応を停止。これは色のさらなる発展を避けることができます。穏やかAGとロッカーで10分2倍のために胚をすすぎ室温でitation。
      5. Postfixation
        1. 20分間PBS中4%パラホルムアルデヒド(重量/体積)で胚を培養する。
        2. 残留パラホルムアルデヒドを除去するために、PBSTで胚(5分/洗浄)三回洗浄する。 4℃で暗所でワンストップソリューションで、固定胚を保存する
      6. 取付、観察、および画像取得
        1. PBSの最小限の量を使用して、100%のグリセロールを含む6ウェルプレートに胚を移す。ロッカーに6ウェルプレートを置き、静かに、暗闇の中で室温で一晩攪拌する。
        2. 100%グリセロールで胚を配置し、実体顕微鏡下で信号を観察します。
        3. 画像を取得し、TIFFファイル形式又はPhotoshopなど( 図3-6)等の画像ソフトを使用することによって、高品質の画像の生成を可能にする任意の他のタイプとして保存する。

    I nはin situハイブリダイゼーション

    1. ダブル達成するために1.1から上記の方法ラベリング - 1.3.1.7が使用されますが、ハイブリダイゼーション時のジゴキシゲニンおよびフルオレセイン標識プローブの両方の同時インキュベーションを含んでいる。
    2. ポストハイブリダイゼーション、すなわちSSCおよびPBST洗浄(ステップ1.3.2.1と1.3.2.2)とブロッキングインキュベーション(ステップ1.3.2.3)を洗うために同じ手順に従ってください。順次、以下に説明するように抗体染色反応を行う。
    3. 4でAP-結合抗ジゴキシゲニン抗体(1:5,000)で胚をインキュベート穏やかに攪拌しながらC。
    4. 洗うとBCIP-NBT(ステップ1.3.3.1 - 1.3.3.6)でインキュベートする。
    5. 検出後、20分間室温でPBSTで二回胚を洗浄する。
    6. 抗ジゴキシゲニン抗体を不活性化するために30分間、1 mMのEDTAで65°PBST中℃で胚を培養する。
    7. 75%、50%、25%メタノールで再水和ウィット、続いて、100%メタノールで胚をインキュベート1時間PBST hをPBSTとバック。
    8. 4℃で穏やかに攪拌しながらブロッキング緩衝液でAP-結合フルオレセイン(1:2,000)で一晩胚を培養する。
    9. PBST(ステップ1.3.3.1)と2回プレ染色バッファーで15分間プレ染色胚と胚を洗う速い赤の存在下でインキュベーション前に穏やかに攪拌しながら室温で(0.1Mトリス-HCl、pHは8.2) 。プロトコルを停止することができ、胚を保存することができる4℃で穏やかに攪拌しながら、翌日再開した。
    10. 使用直前にバッファを染色2ml中1高速赤の錠剤を溶かす。
    11. 高速Red試薬で染色バッファーに胚を配置することによって染色反応を開始する。
    12. 希望の染色強度に達した染色反応を停止します。 4で染色とき、それは一晩中、1つまたは2つの日に、室温で数時間からかかることがあります℃の染色強度は、さらに、開発または非特異表示するために開始されていない場合は直ちに、反応を停止させるセンスコントロールと比較性。
    13. つまり残りのステップポスト固​​定、取り付け、観察や画像取得(steps1.3.3.5と1.3.3.6)に対して上記概説された手順に従ってください。

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Representative Results

バスケット50胚(遺伝子当たり/実験条件ごとに)その遺伝子の発現パターンは一つの実験で達成することができると共にプロトコルを使用する。ほとんどすべての胚は、特定の遺伝子のための同様の発現パターンを示す。 in situハイブリダイゼーション染色の代表例を図3-6に示されている。

センスおよびアンチセンスリボプローブPC5.1に対応するcDNAから合成された、PC5.2 6、SCL/tal-1 7、GATA-1 8,9、FLK / kdrl 10、SHH 11、dlx2 12、fkd7両方/ FOXA1 13、インスリン14,15、および16は、トリプシンのTaq DNAポリメラーゼを使用して、mRNAの完全長のセグメントを増幅することにより構成され、たpCRII-TOPO(Invitrogen)にクローニングされている。個々のアンプリコンの真偽を配列決定により確認した。クローンの向きの確認後、対応するアンチセンスリボプローブを合成したSp6のまたはT7 RNAポリメラーゼのいずれかを使用して、ここで説明されているように修正18,19とプロトコル17を使用。 in situハイブリダイゼーションホールマウントに含まれるステップは、 図2に簡潔に示されている。興味のリボプローブとのハイブリダイゼーション後に観察パープル染色は豊かさと特定の遺伝子の発現のサイトの両方を表しています。インスタンスPC5.1ため24hpfで耳胞と側線原基の前部と後部の中に非常に個別の表情を示しており、強く72 HPF(図3)により前部と後部側線neuromasts内にローカライズされていますコントラストPC5.2ショー体節内の異なる地域化、耳胞と前腎管とCNS内ユビキタス表現、高度96 HPF( 図4)で、肝臓と腸内で発現されています。それぞれのセンスリボプローブを用いた遺伝子発現の不在は、陰性対照としての役割を果たす。 ( 図4b)。血液マーカーの発現解析は両側頭蓋セル内には、中間細胞塊(ICM)でSCL/tal-1の染色を示した。 GATA-1のための染色もICM内で見られているが、発現パターンが異なっている。 FLK / kdrlの発現は、後脳、主及び血管内およびセグメント間ICM(図5)で観察されたしゃべるための染色(図5)脊索で観察された。34 HPFにおけるdlx2の発現に局在している終脳、間脳、視床下部および頭蓋外胚葉性間葉アーチと24 HPFにおけるfkd7/foxa1式は主に床板とhypochordで見られます。膵臓マーカーの発現パターンは、外分泌膵臓(図6)における膵臓トリプシンにおけるインスリン染色を示した。高解像度の発現パターンを示すこれらの結果は、概説プロトコルの成功を表すハイとローの両方の豊富な遺伝子の発現を検出するため。さらに明快画像では顕微鏡スライド20に胚をマウントした後、共焦点顕微鏡を用いて撮影することができます。実験プロトコルの最適化中に準最適な条件下で行われたときに得られる結果の一例の一部を図7に示す乏しいしゃべる式を用いた高バックグラウンド信号が55-60℃の間の不十分な透過およびハイブリダイゼーションで注目された

図1
図1。保持するために、エッペンドルフ·ナイロンメッシュバスケットの調製および使用は胚を上演した 。一つはよく6エッペンドルフナイロンメッシュバスケットを保持することができます。画像は6エッペンドルフナイロンメッシュのバスケットを含む6ウェル滅菌プレートを示していますPBS中のメタノールの連続希釈液に使用されます。

図2
図2。 in situハイブリダイゼーション技術全体のマウントに必要な手順を示した図 。固定した後使用するまで胚を-20​​℃でメタノールに格納することができ上演した。プローブは、予め合成し、-80℃に保つことができる彼らは長期間にわたって使用する場合は小アリコートでプローブを格納することをお勧めします。 in situハイブリダイゼーション実験におけるホールマウント一般的には3〜4日以内に完了することができる。弱く発現している遺伝子のための染色反応が染色反応を4で行われたときより長い、室温で16時間程度かかるかでしょう°C より大きいFを表示するにはここをクリックigure。

図3
24 HPF胚の図3 in situハイブリダイゼーション解析ホールマウントによってPC5.1の発現は24 HPFを使用して行われ、72 HPFが胚を上演しました。()側面図は、前内PC5.1の非常に離散的発現を示すとPC5.1アンチセンスリボプローブを用いた耳胞と側線原基の後方部分。 72でHPF特異的染色は、前部と後部の側線neuromasts内で観察された(b)の PC5.1センスリボプローブを用いた遺伝子発現の不在は、ネガティブコントロールとして機能します。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

gether.withinページ= "常に"> 図4
図4 PC5.2のin situハイブリダイゼーション分析において 24 HPF 96とHPFホールマウントではPC5.2アンチセンスおよびセンスリボプローブを用いて行った。 (a)は 24 HPF胚の側面図がCNS内ユビキタス表情を見せ、耳胞と前腎管が体節。肝臓と腸内の特定の染色はPC5.2アンチセンスリボプローブを使用して96 HPFで見られる。(b)の PC5.2センスリボプローブを用いた遺伝子発現の不在は、ネガティブコントロールとして機能します。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

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図5ホールマウントin situハイブリダイゼーション解析 24 HPFでSCL/tal-1リボプローブを使用して、二国間の脳神経細胞内および中間細胞塊(ICM)で染色を示した ; GATA-1リボプローブ染色はICMに見られる; FLK後脳、メイン、およびセグメント間血管内およびICMで/ kdrl式。しゃべるための染色は脊索で観察された。

図6
図6ホールマウントin situハイブリダイゼーション解析 34 HPFでdlx2リボプローブを使用しては終脳、間脳、視床下部、および頭蓋外胚葉性間葉アーチでdlx2の発現を明らかにし 、24 HPFにおけるfkd7/foxa1式は床面pに主に見られる後半とhypochord、インスリン染色は外分泌膵臓の内分泌膵臓およびトリプシン発現が観察される。

図7
胚によって透過処理されたとき、図7。十分透過して、適切なハイブリダイゼーション温度をin situハイブリダイゼーションシグナル明らかに重要である。ホールマウントin situハイブリダイゼーション解析において 24 HPFと48 HPFでしゃべるリボプローブを使用して、バックグラウンド信号なし脊索とfloorplate内表現を明らかにした12-15分、70でハイブリ℃でプロテイナーゼK消化胚が不十分な消化に供し(5分間プロテイナーゼK処理)または低温でハイブリダイズしたときに不完全な発現パターンと高いバックグラウンドシグナルが観察された(60°C)。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

我々は、高分解能でRNAを可視化する改良された方法を開発しました。 in situハイブリダイゼーション手順における多孔底部(図1)単純なカスタムメイドのバスケットを用いて行われる。胚を無菌条件下で、室温で6ウェルプレート中のRNaseフリー溶液を用いて処理される。

分離する胚のバスケットは異なる色のエッペンドルフチュー​​ブから作られています。リムの有無にかかわらずバスケットは簡単に向きに使用され、特定のプローブに対応するものとしてバスケット内に胚を識別する。

65プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション°C 70℃、50%脱イオン化ホルムアミドとCは、高解像度の信号を得ることが特に重要であることがわかった。さらに15分後のPBST用アルカリトリス緩衝液で2回胚をインキュベートする抗DIG抗体 BCIPの存在下でのインキュベーションの前とのインキュベーション後に洗うとNBTは、高品質のクリア信号の外観を容易にします。私たちの手では、70時、最適な時間とハイブリダイゼーションのための胚の透過性及び定着℃をクリア信号を得ることが非常に重要であることを経験した。不十分な透過性は、高いバックグラウンドシグナルを生成した。拡張された定着は、信号検出を阻害し、一方、拡張透過性又は不十分な定着胚の劣化をもたらした。 55-60°Cにも生成される高バックグラウンド信号(図7)との間のハイブリダイゼーション

目的の遺伝子がアンチセンス(AS)の転写産物をコードしている場合、センス·プローブは、トランスクリプトASのための信号を検出します。染色反応を30分間メタノールで胚を確定停止または長い真紫色に信号を変換して、非特異的染色を除去された後。固定された胚は4でストップ溶液中で暗所に保存することができます℃で数ヶ月の​​ためのC。

利点とdisadvantagWISHのES

WISHは、胚発生や幼虫の段階で、標的遺伝子の時間的·空間的な表現の両方を特徴づけるための効率的な手法である。このプロトコルは、実験目的に応じて適切な変更を使用して二つの遺伝子又は同時にRNAおよびタンパク質発現の共局在のRNA発現の可視化を可能にする。この高解像度のプロトコルは、多くの組織および細胞型においてRNAの発現を検出するために使用することができる。それは、最小限のバックグラウンド信号と非常に低い豊富なRNA種の検出に用いることができる。しかし、組織の内部区画内の遺伝子の正確な発現を可視化するためには、組織切片を用いたin situハイブリダイゼーション必要とする。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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