Haute Résolution Mont entier
1Endocrine Research Laboratory and Department of Medicine, Royal Victoria Hospital, 2McGill University Health Centre Research Institute

Published 10/19/2013
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Biology

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Summary

Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée par

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Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. High Resolution Whole Mount In Situ Hybridization within Zebrafish Embryos to Study Gene Expression and Function. J. Vis. Exp. (80), e50644, doi:10.3791/50644 (2013).

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Abstract

Cet article se concentre sur l'ensemble du montage hybridation in situ (WISH) des embryons de poisson zèbre. La technologie WISH facilite l'évaluation d'expression de gènes à la fois en termes de distribution des tissus et le stade de développement. Les protocoles sont décrits pour l'utilisation des embryons de poisson zèbre WISH de l'aide d'ARN antisens sondes marquées à la digoxigénine. Les sondes sont générés par l'incorporation des nucléotides digoxigénine liés par transcription in vitro des modèles de gènes qui ont été clonés et linéarisé. Les chorions d'embryons récoltés à des stades de développement définis sont retirés avant l'incubation avec des sondes spécifiques. Selon un procédé de lavage pour éliminer la sonde en excès, les embryons sont mis à incuber avec un anticorps anti-digoxigénine conjugué à la phosphatase alcaline. En utilisant un substrat chromogène de la phosphatase alcaline, l'expression du gène spécifique peut être évaluée. En fonction du niveau de l'expression génique de toute la procédure peut être complété dans les 2-3 jours.

Introduction

Le poisson-zèbre (Danio rerio) a émergé comme un modèle animal puissant pour l'étude du développement des vertébrés, la maladie, le comportement et le dépistage dans la drogue 1-3. Embryons de poissons zèbres peuvent être obtenues dans un grand nombre d'un seul passage. Fertilisation et le développement survient ex utero et les embryons optiquement transparents se développent rapidement. Événements critiques du développement se produisent pendant les 48 premières heures après la fécondation (HPF). Cela comprend l'apparition de l'organe ébauches et l'ouverture d'cytodifférenciation. Démontables ou la sur-expression de protéines peuvent être atteints grâce à la micro-injection d'embryons avec antisens morpholino (MO) des oligonucléotides ou d'ARNm respectivement à l'étape une ou deux cellules (0,75 HPF).

Le souhait des embryons de poisson zèbre facilite l'étude de l'expression spatio-temporelle des gènes d'intérêt spécifiques. Application de la technique de micro-injection WISH suite d'embryons avec l'ARNm ou de MO à plus-express ou les niveaux de protéines spécifiques knockdown révèle régulation différentielle d'autres gènes.

Changements dans les modes d'expression des gènes peuvent être corrélées avec des changements phénotypiques et révèlent la fonction des gènes cibles au cours de l'organogenèse tôt. Depuis sondes peuvent être préparés et stockés à l'avance, la technique ISH peut être appliqué à révéler des modèles d'expression génique pendant au moins 20 gènes à la fois en utilisant des plaques de six puits et des paniers sur mesure.

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Protocol

1. Whole-mount hybridation in situ des embryons de poisson zèbre

1.1 Préparation des embryons

  1. Recueillir des embryons à des stades de développement requis. S'il vous plaît voir Kimmel et al. 5 pour la description du stade embryonnaire.
  2. Retirer chorions manuellement à l'aide des pinces (Dumont horlogers pince pas. 5).
  3. Fixer embryons dans une solution à 4% de paraformaldéhyde (PFA) composé dans du PBS (tampon phosphate salin) pendant une nuit à 4 ° C.
  4. Lavez embryons avec PBS au moins 3x pendant 5 minutes chacun à la température ambiante.
  5. Boutique embryons dans 100% de méthanol (MeOH) à -20 ° C jusqu'à leur utilisation pour l'application future de techniques, y compris l'ensemble du montage hybridation in situ.
  6. Gel scène embryons dans l'azote liquide pour l'extraction de l'ARN et conserver à -80 ° C.
  7. Extrait d'ARN à partir d'embryons mis en scène et de synthétiser l'ADNc pour l'amplification PCR et le clonage ultérieur.
  8. 1.2 Synthèse de sondes d'ARN digoxygenine marqués

    1. L'amplification par PCR et clonage du gène de modèle de sonde. Réaction PCR installation avec un volume total de 50 ul, comme indiqué dans le tableau 1. Utilisez plus de l'ADN génomique ou moins ADNc dans la réaction de PCR en tant que modèle. Inclure 10 Temps d'extension min à 72 ° C après le dernier cycle afin de s'assurer que les produits de réaction de PCR sont pleine longueur et 3 'adénylé afin de faciliter le clonage TOPO.
    Réactif Volume
    L'extrait d'ADN 100 ng
    Tampon PCR (10x) 5 pl
    dNTP (10 mM) 2 pl
    Primaires (10 mM) 1 nM chacun
    Ajouter de l'eau pour un volume final de 49,7 pi
    Taq polymérase (5 unités / & #956; l) 0,3 pl
    volume de réaction 50 pl

    Tableau 1. Réactionnel d'amplification par PCR.

    1. Vérifier la taille du produit de PCR en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose. La taille estimée du produit de PCR pour la synthèse de la sonde est proche de 1 ko.
    2. Prendre des précautions particulières pour éviter toute contamination par la nucléase réaliser l'expérience dans des conditions stériles et l'utilisation de l'eau libre de nucléase. Dans le cas où plusieurs produits sont observés, gel purifier le produit de PCR de taille appropriée avant de procéder au clonage en utilisant le kit de clonage TOPO TA. Optimiser la réaction de PCR pour éliminer l'apparition de bavures et de multiples bandes.
    3. Effectuer la réaction de clonage TOPO comme indiqué dans le tableau 2. Combinez TOPO Vector et produit PCR et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    Réactif Les cellules chimiquement compétentes Les cellules compétentes Electro Frais produit de la réaction PCR 1-4 ul 1-4 ul Solution de sel 1 pl Solution de sel diluée 1 pl Eau Jusqu'à volume total de 5 pi Jusqu'à volume total de 5 pi TOPO 1 pl 1 pl Volume final 6 pi 6 pi

    Tableau 2. Réaction de clonage TOPO.

    1. Incorporer / introduire le produit de clonage TOPO dans une des cellules compétentes de tir. Tson processus est appelé transformation.
    2. Incuber les cellules transformées à 37 ° C pendant au moins 1 heure à 260 tours par minute afin d'assurer l'expression des gènes de résistance aux antibiotiques. Plate le mélange de transformation (50-100 ul) sur préchauffé Luria Bertani (LB) des plaques d'agar contenant 50 pg / ml d'ampicilline et X-gal Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
    3. Déterminer la présence de l'insert sur la base apparition de colonies bleues blancs ou de la lumière. Le vecteur TOPO contient le gène lacZ qui code pour β-galactosidase. En présence de X-gal, la production de β-galactosidase forme une couleur bleue. ADN ligaturé dans le plasmide perturbe la formation de colonies de β-galactosidase et blanc fonctionnels sont produits. Les colonies blanches ou des colonies bleu clair confirment la présence de l'insert.
    4. Choisissez les colonies blanches de la plaque de gélose en utilisant des embouts de pipette stériles et les placer dans le tube stérile de 10 ml contenant 4 ml de médias et la culture LB à 37 ° C dans l'incubateur secouantTor nuit à 200 rpm.
    5. Purifier l'ADN plasmidique en utilisant le kit d'ADN plasmidique selon les instructions du fabricant.
    6. Linéariser le plasmide suivant la purification d'ADNc par digestion de 5 ng d'ADNc pour chaque sonde par l'enzyme de restriction appropriée qui possède un site unique situé en 3 '(pour les sondes de détection) ou (5' pour les sondes anti-sens) de l'insert.
    7. Purifier l'ADN linéarisé en utilisant la méthode de l'extraction au phénol / chloroforme. Ajouter un volume égal de rotation phénol / chloroforme, sommet vigoureusement pendant 30 sec, 3 min à 13000 rpm à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube propre et ajouter un volume égal de chloroforme. Spin 3 min à 13000 rpm à 4 ° C. Transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube propre. Ajouter de l'acétate de sodium à 10% (3 M) et le volume 2.5x d'éthanol à 100% pour précipiter l'ADN et conserver à -20 ° C pour la nuit. Faites tourner pendant 15 min à 13000 rpm à 4 ° C. Éliminer l'éthanol et laver le culot avec de l'éthanol à 75%. Le protocole peut être arrêté et l'ADN peut être STORED à -20 ° C et repris le lendemain. Faites tourner pendant 10 min à 10000 rpm à 4 ° C. Retirer le surnageant et sécher soigneusement le culot pendant 2 min à température ambiante. Reprendre le culot dans 10 ul d'eau traitée au DEPC et incuber à 55 ° C pendant 20 min. Quantifier la concentration de l'ADN en utilisant le spectrophotomètre UV.
    8. Évaluer la pureté par électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant 1 pl d'ADN sur gel à 1% d'agarose et de tourner pendant environ 30 min.
    9. Mettre en place réaction de marquage ARN. L'utilisation d'un flacon de réaction sans RNase, ajouter 1-5 pg d'ADN matrice purifiée stérile, RNase, de l'eau distillée traitée au DEPC, double à un volume de 13 ul. Refroidir le flacon de réaction sur glace et ajouter les réactifs suivants (voir tableau 3):
    Réactif Volume
    Mélange étiquetage NTP (10x) 2 pl
    buff de transcriptioner (10x) 2 pl
    Protecteur inhibiteur de RNase 1 pl
    ARN polymérase SP6 ou
    T7 RNA Polymerase 2 pl
    Volume final 20 pl

    Tableau 3. Réaction de marquage d'ARN.

    1. Mélanger le réactif doucement puis recueillir au fond par une brève centrifugation à 2000 rpm pendant 30 secondes à la température ambiante et incuber le mélange réactionnel pendant 2 heures à 37 ° C.
    2. Retirez la matrice d'ADN en ajoutant 2 ul RNase DNase I. incuber pendant 30 min à 37 ° C et arrêter la réaction en ajoutant 2 pl EDTA 0,2 M (pH 8,0).
    3. Précipiter les produits de la réaction en ajoutant 2,5 ul 4 M de LiCl et 75 ul d'éthanol à 100%. Mélangez la solution et conserver à -20 ° C pendant 45 min or stocké à -20 ° C pendant la nuit et le protocole reprend le lendemain.
    4. Centrifuger la suspension pendant 30 min à 13000 rpm à 4 ° C, puis laver le culot avec 500 pi d'éthanol à 70% conservés à -20 ° C, une centrifugeuse pendant encore 10 min et sec pendant 2 min, et remettre en suspension dans 50 pi et incuber à 30 min à 37 ° C.
    5. Vérifier la qualité et l'intégrité sonde en exécutant ml 1-2 sur gel agarose 1% pendant 30 min environ. Ceci est confirmé par la présence d'un produit unique fonctionnant à la taille attendue sur le gel.
    6. Quantifier la concentration de la sonde par mesure de la quantité de l'ARN en utilisant un spectrophotomètre. Le rendement de cette réaction est d'environ 10 ug d'ARN (100-200 ng / ul).

    1.3 Tout-mount hybridation in situ

    1. JOUR 1
      1. Réhydratation
        1. Préparer des paniers à l'aide de filet de nylon (moins de 1 mm taille des pores) et des tubes Eppendorf. Construire les paniers par cutting tubes Eppendorf (1,5 ml) pour enlever les extrémités coniques. Pour identifier les paniers individuels utilisent des tubes colorés et enlever le haut jantes de la moitié d'entre eux.
        2. Coupez de petits morceaux de filet de nylon pour couvrir les extrémités coupées des tubes Eppendorf. Collez les extrémités coupées des tubes pour le filet de nylon en les chauffant sur une plaque chauffante électrique (situé entre moyen et élevé) dans une hotte. Une fois refroidi retirer le filet de nylon excès de paniers et de les stocker dans 100% de méthanol à la température ambiante.
        3. Préparer des dilutions successives de méthanol dans du PBS (75% [v / v [méthanol, 50% [v / v] méthanol et 25% [v / v] méthanol) à l'aide des trois premiers puits des plaques six puits suivis de 100% PBST (solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,1% de Tween-20) dans les trois prochaines puits.
        4. Embryons soumis à in situ la procédure d'hybridation utilisant des paniers sur mesure, comme indiqué dans FIGUREA 1a et b. Utiliser des solutions sans RNase jusqu'à l'hybridationtion étape dans des plaques 6 puits (4 ml / puits). Pour ce faire, placer jusqu'à 6 paniers dans le premier puits. Placer le panier avec jante en premier, suivi par des paniers sans les jantes en différentes couleurs disposées consécutivement. Grâce à cette disposition jusqu'à 6 profils d'expression des gènes peut être déterminée simultanément.
        5. Placez embryons déshydratés du même stade de développement pour le même panier (voir figure 1).
        6. Réhydrater embryons par déplacement des paniers d'un puits dans la plaque de six puits à l'autre (5 min pour chaque étape). Utilisation six puits remplis de tampon approprié. Les embryons sont soumis à chaque dilution une fois. De cette façon, les embryons sont lavés 6x, 5 min / lavage. Réhydratation des embryons déshydratés est obtenue en remplaçant le méthanol avec du PBS, puis par lavage 3x avec 100% PBST.
      2. Perméabilisation Digest embryons réhydratés avec la protéinase K (10 pg / ml) à la température ambiante pour les rendre perméables, comme indiqué dans le tableau 4 Stade embryonnaire (heures après la fécondation) période de digestion (protéinase K) Jusqu'à 6 15 sec 6-12 30 sec 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min

        Tableau 4. La réaction de perméabilisation.

      3. Postfixation et PBST lavages
        1. Fixer embryons par incubation dans du paraformaldéhyde 4% (p / v) dans du PBS 1X pendant 20 min.
        2. Retirer paraformaldéhyde résiduel en lavant embryons 3x, 5 min / lavage, en PBS 1x.
        </ Li>
      4. Acétylation Préparer le mélange d'acétylation (125 triéthanolamine ul et 27 ul d'anhydride acétique dans 10 ml trou DDH 2 O) et d'embryons incuber deux fois chacune pendant 10 minutes. Pour minimiser l'activité de la phosphatase endogène, préparer le mélange d'acétylation frais en cas de besoin. Pour enlever l'excès de réactif, rincer embryons deux fois en PBS (10 min / lavage)
      5. Préhybridation Prehybridize embryons par transfert d'embryons de paniers à 1,5 ml tubes Eppendorf stériles et l'incubation avec 200 ul mélange d'hybridation pour 2-4 heures dans une ° C bain d'eau 70.
      6. Préadsorption des anticorps éliminer environ 50 embryons à partir des paniers et les transférer vers un 1,5 ml tubes Eppendorf stériles. Incuber avec des anticorps anti-DIG-AP (1:500) anticorps en utilisant un tampon de blocage (1x PBST, 2% de sérum de veau [vol / vol], 2 mg / ml sérum-albumine bovine [BSA]) à la température ambiante pendant 2-4 heures, et ensuite le stocker à 4 ° C pendant la nuit. Retirer de l'incubateur dans la matinée uned embryons permettent d'atteindre la température ambiante.
      7. Hybridation Ajouter 100-200 ng de sonde pour les embryons préhybridés et incuber une nuit à 70 ° C au bain-marie.
    2. JOUR 2
      1. SSC (Citrate Saline-sodium) Washes
        1. Placer les tubes de 50 ml du mélange d'hybridation (HM), 2x SSC et 0,2 x SSC dans un bécher avec de l'eau en ° C au bain-marie à 70 et préchauffer pendant au moins 20 min. Retirer le mélange de réaction d'hybridation contenant la sonde, ajouter 1 ml de mélange d'hybridation préchauffé à tubes et incuber pendant 15 min à 70 ° C. Remplissez plaques de six puits avec différentes dilutions d'préchauffé HM en 2x SSC en remplaçant 100% HM à 50% à 25% HM pour éliminer les réactifs en excès.
        2. En attendant, remplissez plaques de six puits avec 2x SSC pour les lavages et les maintenir à 70 ° C.
        3. Après 15 minutes, place les embryons à partir du tube vers les paniers maintenues dans la plaque de puits à six rempli de la dilutions de SM avec 2x SSC et laver les embryons hybrides en déplaçant le panier d'un puits à l'autre (15 min chacun dans une ° C au bain-marie à 70). Lavez embryons 2x, 15 min / lavage, dans 100% 2x SSC à 70 ° C.
        4. Définir un autre bain d'eau à 65 ° C. Remplissez plaques de six puits avec 0,2 x SSC pour une grande rigueur lave-pour éviter l'hybridation non spécifique de transcription avec la sonde.
        5. Après les embryons sont lavés deux fois avec 2x SSC à 70 ° C, suivi de deux autres 30 lavages min en 0,2 x SSC à 65 ° C.
      2. PBST lavages préparer des plaques de six puits avec des dilutions successives de 0,2 x SSC en PBS comme suit: 75% (volume / volume) 0,2 x SSC, 50% (volume / volume) 0,2 x SSC, 25% (volume / volume) 0.2x SSC, et le reste, deux puits avec 100% PBST. Laver les embryons hybrides en déplaçant le panier d'un puits à l'autre (5 min pour chaque étape à la température ambiante à l'aide d'une bascule).
      3. Pré-incubation des embryons de préincuber pendant 3-4 heures à température ambiante dans blocking tampon (1x PBST, 2% de sérum de veau [vol / vol], 2 mg / ml BSA).
      4. Incubation avec anticorps anti-DIG embryons Incuber avec une solution d'anticorps anti-DIG-AP (1:5000) dans un tampon bloquant pendant la nuit à 4 ° C avec agitation douce.
    3. JOUR 3
      1. PBST lavages Préparer les plaques de six puits avec 4 ml / puits PBST. Lavez embryons incubés en déplaçant les paniers dans la plaque de six puits contenant PBST 6x pour des périodes de 15 min. Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C et le protocole ont repris le lendemain.
      2. Prestaining Prestain les embryons par lavage 2x pendant 15 min avec un tampon prestaining à température ambiante avec une agitation douce avant l'incubation en présence de BCIP (phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle) et de NBT (nitrobleu de tétrazolium). BCIP et NBT les substrats utilisés pour la révélation de la couleur de l'activité de la phosphatase alcaline. Depuis sondes sont attachées avec e phosphatases alcalinesle développement de l'e de la couleur pourpre indique l'expression du gène cible. Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C et le protocole ont repris le lendemain.
      3. Coloration
        1. Incuber les embryons à la température ambiante dans l'obscurité avec BCIP et NBT pour 30 min.
        2. Surveillez la coloration toutes les 30 minutes en utilisant un microscope stéréoscopique. Les temps de réaction varient de 15 min-16 h selon le niveau d'expression du gène. Les temps de réaction sont plus courts pour les gènes fortement exprimés et plus de gènes faiblement exprimés. sondes de détection permet de détecter des signaux si le gène d'intérêt exprime antisens complémentaire (AS) des transcriptions.
      4. Arrêtez de réaction après l'intensité de la coloration désirée est atteinte, arrêter la réaction en transférant paniers contenant les embryons de puits contenant la solution d'arrêt (1x PBS, pH 5,5, EDTA 1 mM, 0,1% Tween). Ceci permettra d'éviter la poursuite du développement de la couleur. Rincer embryons pendant 10 min 2x sur une bascule avec douceur agitation à la température ambiante.
      5. Postfixation
        1. Incuber les embryons en paraformaldéhyde 4% (p / v) dans du PBS pendant 20 min.
        2. Laver les embryons (5 min / lavage) trois fois avec PBST afin d'éliminer paraformaldéhyde résiduelle. Stocker les embryons fixés dans une solution d'arrêt dans l'obscurité à 4 ° C.
      6. Montage, d'observation et d'acquisition d'images
        1. Transférer les embryons sur une plaque de six puits contenant 100% de glycérol en utilisant le volume minimum possible de PBS. Placer la plaque de six puits sur une bascule et agiter doucement pendant une nuit à température ambiante dans l'obscurité.
        2. Placez embryons dans 100% de glycérol, puis observer le signal sous une loupe binoculaire.
        3. Acquisition d'images et enregistrer au format de fichier TIFF ou tout autre type qui permet de produire des images de haute qualité grâce à l'utilisation d'un logiciel d'image comme Photoshop (figures 3-6).

    Je n hybridation in situ

    1. Pour atteindre un double étiquetage de la méthode décrite ci-dessus de 1,1 - 1.3.1.7 est utilisé, mais comprend incubation simultanée des deux digoxygenine et sondes marquées fluorescéine lors de l'hybridation.
    2. Suivez la même procédure pour le post hybridation lave savoir SSC et PBST lavages (1.3.2.1 et 1.3.2.2 étapes) et des incubations de blocage (étape 1.3.2.3). Réaliser des réactions d'anticorps et la coloration séquentielle telles que décrites ci-dessous.
    3. Incuber les embryons avec un anticorps couplé à AP-anti-digoxigénine (1:5000) à 4 ° C sous agitation douce.
    4. Lavez et incuber avec BCIP-NBT (étapes 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
    5. Suite à la détection, lavez embryons deux fois avec PBST à la température ambiante pendant 20 min.
    6. Incuber les embryons à 65 ° C en PBS avec 1 mM EDTA pendant 30 min pour inactiver l'anticorps anti-digoxigénine.
    7. Incuber les embryons dans 100% de méthanol, suivie d'une réhydratation dans 75%, 50% et 25% de méthanol esprith PBST et retour à pBST pendant 1 heure.
    8. Incuber les embryons nuit avec AP-coupled fluorescéine (1:2000) dans un tampon de blocage à 4 ° C avec agitation douce.
    9. Lavez embryons avec PBST (étape 1.3.3.1) et d'embryons pré-tache 2 fois pendant 15 min avec un tampon de pré-coloration (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) à température ambiante sous agitation douce avant l'incubation en présence de rouge rapide . Le protocole peut être arrêtée et les embryons peuvent être conservés à 4 ° C avec agitation douce et reprise le lendemain.
    10. Dissoudre un comprimé rouge rapide dans 2 ml de tampon de coloration immédiatement avant utilisation.
    11. Déclencher la réaction de coloration en plaçant embryons dans le tampon de coloration avec le réactif Fast Red.
    12. Arrêter la réaction de coloration quand l'intensité de coloration désirée. Il peut prendre de quelques heures à la température ambiante à un ou deux jours durant la nuit lorsque la coloration à 4 ° C. Arrêter la réaction immédiatement si l'intensité de la coloration ne se développe plus ou commence à montrer non spécifiquement par rapport à la commande de lecture.
    13. Suivez les procédures décrites ci-dessus pour les étapes restantes à savoir la fixation de poste, de montage, d'observation et d'acquisition d'image (steps1.3.3.5 et 1.3.3.6).

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Representative Results

En utilisant le protocole avec 50 embryons par panier (par gène / par condition expérimentale) le profil d'expression de ce gène peut être obtenue dans une expérience. Presque tous les embryons présentent des profils d'expression similaires pour un gène particulier. Des exemples représentatifs de la coloration dans d'hybridation in situ sont présentés aux figures 3-6.

Tant le sens et anti-sens ribosondes ont été synthétisés à partir des ADNc correspondant à PC5.1, PC5.2 6, 7, SCL/TAL-1 gata-1, 8,9 FLK / kdrl 10, chut 11, 12, Dlx2 fkd7 / FOXA1 13, 14,15 insuline, la trypsine et 16 ont été construits par amplification d'un segment de l'ARNm de longueur en utilisant la Taq DNA polymérase, et cloné dans le vecteur pCRII-TOPO (Invitrogen). L'authenticité des amplicons individuels a été confirmé par séquençage. Après vérification de l'orientation de clone, ribosondes antisens correspondants ont été synthétisésen utilisant les protocoles 17, avec modifications 18,19 décrites ici en utilisant soit le SP6 ou T7 RNA polymérase. Étapes à suivre pour l'ensemble du montage hybridation in situ sont illustrés brièvement dans la figure 2. Coloration pourpre observée après hybridation avec ribosonde d'intérêt représente à la fois l'abondance et les sites d'expression de gène particulier. Par exemple PC5.1 montre expression très discret dans la partie antérieure et postérieure de la vésicule otique et ébauche de la ligne latérale à 24hpf et est fortement localisés dans les neuromastes de la ligne latérale antérieure et postérieure de 72 HPF (Figure 3). Par contre PC5.2 spectacles expression ubiquitaire dans le SNC et la régionalisation est distinct dans les somites, vésicule otique et conduit pronephrique et est fortement exprimé dans le foie et l'intestin à 96 HPF (Figure 4). L'absence de l'expression du gène pour l'utilisation de ribosondes de détection respectifs sert de témoin négatif. ( 4b). Les analyses de l'expression de marqueurs sanguins ont présenté une coloration de SCL/TAL-1 dans les cellules crâniens bilatérales et dans la masse cellulaire intermédiaire (ICM). Bien que la coloration pour gata-1 est également observée dans l'ICM le profil d'expression est différent. L'expression de flk / kdrl a été observée dans le cerveau postérieur, les vaisseaux principaux et intersegmentaire et dans l'ICM (Figure 5). L'coloration pour chut a été observée dans la chorde (Figure 5). L'expression de Dlx2 à 34 HPF est localisée dans le télencéphale, diencéphale, l'hypothalamus et arches ectomesenchymal crâniens et l'expression fkd7/foxa1 à 24 HPF est perçue principalement dans la plaque de sol et hypochord. Les profils d'expression des marqueurs pancréatiques ont montré une coloration à l'insuline dans le pancréas endocrine et de la trypsine dans le pancréas exocrine (figure 6). Ces résultats montrent motif d'expression à haute résolution représente le succès du protocole décritpour la détection de l'expression de deux gènes abondantes haute et basse. Pour plus de clarté des images peuvent être prises en utilisant la microscopie confocale après le montage des embryons sur une lame de microscope 20. Certains des exemples de résultats obtenus lors de l'expérience a été réalisée dans des conditions sous-optimales lors de l'optimisation du protocole sont présentés dans la figure 7. Signaux haute de fond avec une mauvaise expression chut a été remarqué dans la perméabilisation inadéquate et l'hybridation entre 55-60 ° C.

Figure 1
Figure 1. Paniers de maille préparation et l'utilisation de Eppendorf-nylon de tenir organisé embryons. On peut ainsi contenir six paniers à mailles Eppendorf-nylon. L'image montre les plaques stériles à 6 puits contenant six paniers à mailles Eppendorf-nylonutilisée pour les dilutions successives de méthanol dans du PBS.

Figure 2
Figure 2. Schéma montrant les étapes impliquées dans l'ensemble de montage de la technique d'hybridation in situ. Après fixation scène embryons peuvent être conservés dans du méthanol à -20 ° C jusqu'à leur utilisation. Les sondes peuvent être synthétisées à l'avance et conservés à -80 ° C. Sondes Mémorisation des petites portions est conseillé si elles sont utilisées sur de longues périodes. En général, l'ensemble du montage dans des expériences d'hybridation in situ peut être complété en 3 ou 4 jours. La réaction de coloration pour les gènes faiblement exprimés prendre jusqu'à 16 heures à la température ambiante ou plus lors de la réaction de coloration est réalisée à 4 ° C Cliquez ici pour agrandir figure.

Figure 3
Figure 3. L'expression de PC5.1 par l'ensemble de montage dans les analyses d'hybridation in situ a été réalisée avec 24 HPF et 72 HPF embryons mis en scène. (A) Vue latérale de 24 HPF embryons présentent une expression très discret de PC5.1 au sein de l'antérieur et partie postérieure de la vésicule otique et ébauche de la ligne latérale à l'aide PC5.1 antisens riboprobe. À 72 coloration spécifique HPF a été observée dans les neuromastes de la ligne latérale antérieure et postérieure. (B) L'absence de l'expression des gènes en utilisant PC5.1 sens riboprobe sert de contrôle négatif. Cliquez ici pour agrandir la figure .

gether.within-page = "always"> Figure 4
Figure 4. A 24 HPF et 96 HPF ensemble de montage dans les analyses d'hybridation in situ de PC5.2 été réalisée en utilisant PC5.2 anti-sens et ribosondes des sens. (A) Vue latérale de 24 HPF embryons présentent une expression ubiquitaire dans le SNC, somites vésicule otique et conduit pronephrique. La coloration spécifique dans le foie et l'intestin est vu à 96 HPF en utilisant PC5.2 antisens riboprobe. (B) L'absence de l'expression des gènes en utilisant PC5.2 sens riboprobe sert de contrôle négatif. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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. Figure 5 Whole-mount dans les analyses d'hybridation in situ à 24 HPF en utilisant SCL/TAL-1 riboprobe ont présenté une coloration dans les cellules crâniens bilatérales et dans la masse cellulaire intermédiaire (ICM); gata-1 riboprobe coloration se voit dans l'ICM, le FLK expression / kdrl dans le cerveau postérieur, le principal et les vaisseaux intersegmentaire et à l'ICM. La coloration pour chut a été observée dans la chorde.

Figure 6
. Figure 6 Whole-mount dans les analyses d'hybridation in situ à 34 HPF en utilisant Dlx2 riboprobe révélé expression de Dlx2 dans le télencéphale, diencéphale, l'hypothalamus et arches ectomesenchymal crâniens; l'expression fkd7/foxa1 à 24 HPF est perçue principalement dans le sol pretard et hypochord; coloration à l'insuline est observée dans le pancréas endocrine et l'expression de la trypsine dans le pancréas exocrine.

Figure 7
Figure 7. Perméabilisation adéquate et la température d'hybridation appropriée sont essentiels pour clairement des signaux d'hybridation in situ. Whole-mount dans les analyses d'hybridation in situ à 24 HPF et 48 HPF en utilisant une ribosonde chut révélé expression au sein de la notochorde et floorplate sans signal de fond lorsque les embryons sont perméabilisées par K digestion par la protéinase pour 12-15 min et hybridées à 70 ° C. Modes d'expression incomplètes et les signaux de fond élevés ont été observés lorsque les embryons ont été soumis à une digestion insuffisante (5 min traitement à la protéinase K) ou hybridé à basse température (60 ° C). Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Discussion

Nous avons mis au point des méthodes améliorées pour visualiser l'ARN avec une haute résolution. Le dans les procédures d'hybridation in situ sont réalisées en utilisant des paniers sur mesure simples à fond poreux (figure 1). Les embryons sont traités à l'aide des solutions sans RNase dans des plaques 6 puits à température ambiante dans des conditions stériles.

De séparer les embryons paniers sont fabriqués à partir de différents tubes Eppendorf colorées. Corbeilles avec ou sans rebord sont utilisés pour faciliter l'orientation et à identifier les embryons dans le panier en tant que correspondant à une sonde particulière.

Préhybridation à 65 ° C et l'hybridation à 70 ° C avec 50% de formamide désionisée a été jugée particulièrement importante pour obtenir des signaux à haute résolution. De plus l'incubation des embryons à deux reprises avec du tampon Tris alcaline pendant 15 min après PBST lave après incubation avec un anticorps anti-DIG et avant l'incubation en présence de BCIP etNBT facilite l'apparition de signaux clairs de haute qualité. Dans nos mains que nous avons connu que la perméabilisation et la fixation des embryons pour le moment optimal et une hybridation à 70 ° C ont été très critiques à obtenir des signaux clairs. Perméabilisation inadéquate produit un bruit de fond élevé. Perméabilisation étendue ou la fixation inadéquate ont entraîné la dégradation des embryons que la fixation prolongée inhibe la détection du signal. L'hybridation entre 55-60 ° C aussi produit un bruit de fond élevé (figure 7).

La sonde de détection permet de détecter un signal pour l'AS transcription si le gène d'intérêt code antisens (AS) transcriptions. Après la réaction de coloration est arrêtée plaçant embryons dans du méthanol pendant 30 min ou plus convertit le signal en une vraie couleur pourpre, et enlève la coloration non spécifique. Embryons fixes peuvent être stockés dans l'obscurité dans une solution d'arrêt à 4 ° C pendant plusieurs mois.

Les avantages et les disadvantages de WISH

WISH est une technique efficace pour caractériser à la fois l'expression temporelle et spatiale des gènes cibles au cours de l'embryogenèse et stades larvaires. Ce protocole permet aussi la visualisation de l'expression d'ARN de deux gènes ou la co-localisation de l'ARN et de l'expression de la protéine dans le même temps à l'aide de modifications appropriées selon les objectifs expérimentaux. Ce protocole haute résolution peut être utilisée pour détecter l'expression d'ARN dans de nombreux tissus et types cellulaires. Il peut être utilisé pour la détection de très faibles espèces d'ARN abondantes avec des signaux de référence minimales. Toutefois, afin de visualiser l'expression précise de gènes au sein des compartiments intérieurs des tissus nécessite l'hybridation in situ en utilisant des coupes de tissus.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymerase Invitrogen 10342053
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO Invitrogen K4650-01
HQ Mini Plasmid Purification Kit Invitrogen K2100-01
Agarose Roche 11 685 660 001
Not1 and HindIII Restriction Enzymes Invitrogen 15441-025, 15207-012
Buffer Saturated Phenol, ultrapure Invitrogen 15513039 Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling.
Chloroform Fisher C607-1 Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood.
RNase-free DNAse I Roche 4716728001 Prepare small aliquots and store at -20°C.
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase Roche 11277073910
RNase Inhibitor Roche 10777-019
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) Fisher 50-751-7355
100% Ethanol Commercial alcohols
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma 40718-25ML DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask.
NaOH Fisher SS255-1
EDTA 0.5 M (pH 8.0) Fisher 50-751-7404
Instant Ocean Salt Aquarium Systems N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher FL-03-0900
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148-1KG Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Phenylthiocarbomide (PTC) Sigma P7629-25G PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask.
Methanol Fisher A947-4
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 Fine Science Tools
Six-well Cell Culture Cluster Sarstedt 83.1839
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes In-house preparation To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used.
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) Sigma P1379-500ML
Proteinase K Fermentas EO0491
Acetic Anhydride Sigma 242845
Triethanolamine Sigma 90279-100ML
Formamide, high purity grade Sigma F9037
AG501-X8 Resin Bio Rad 142-6424
Citric Acid monohydrate Sigma C0706-500G
Heparin Sodium Salt Sigma H3393-25KU
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) Sigma S6639
tRNA from bakers yeast type X Sigma R5636-1ML
NaCl Fisher S640-500
Tris-HCl Fisher BP153-1
MgCl2 Fisher S25403
Levamisole Hydrochloride Sigma 31742
N,N-Dimethylformamide
anhydrous (DMF)
Sigma 227056 Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles.
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Sigma N6639 Protect this solution from light.
Nitroblue tetrazolium (NBT) Sigma 840W Protect this solution from light.
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) Sigma A8806
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments Roche 1093274910
Glycerol Sigma G5516-500ML
96-well cell culture plates Sarstedt 83.1835
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 ZIRC Tg(mnx1:GFP)ml2
Instant Ocean Aquarium Systems N/A

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References

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