زراعة خلايا الإنسان الظهارية الأنف في واجهة الهواء السائل

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الخلايا الظهارية الأنفية، تم الحصول عليها من خلال كشط سطحية خزعة من متطوعين من البشر، يتم توسيع ونقل على إدراج زراعة الأنسجة. عند بلوغ confluency، وتزرع الخلايا في واجهة السائل الهواء، مما أسفر عن ثقافات خلايا مهدبة وغير مهدبة. متباينة الثقافات الخلايا الظهارية الأنف تقديم نماذج تجريبية قابلة للحياة لدراسة الغشاء المخاطي في الجهاز التنفسي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نماذج في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الابتدائي الإنسان ضرورية في فهم المهام الرئيسية للظهارة التنفسية في سياق الالتهابات الميكروبية أو وكلاء استنشاقه. مقارنات مباشرة من الخلايا التي تم الحصول عليها من السكان المريضة تسمح لنا لتوصيف الظواهر المختلفة وتشريح الآليات الكامنة وراء التوسط تغييرات في وظيفة الخلايا الظهارية. زراعة الخلايا الظهارية من المنطقة رغامي قصبي الإنسان قد تم توثيقه جيدا، ولكن محدودة بسبب توافر أنسجة الرئة الإنسان أو الغازية المرتبطة الحصول على فرش الخزعات الشعب الهوائية. ويتم الحصول على الخلايا الظهارية من خلال الأنف أقل بكثير الغازية سطحية الخزعات كشط الأنف والموضوعات يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، والأنف هو نقطة الدخول إلى الجهاز التنفسي، وبالتالي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا، مثل العوامل الميكروبية، والملوثات، أو المواد المسببة للحساسية.

لفترة وجيزة، يتم توسيع الخلايا الظهارية الأنف تم الحصول عليها من متطوعين من البشر على المغلفة لوحات زراعة الأنسجة، ثم نقل على إدراج ثقافة الخلية. عند بلوغ confluency، تستمر الخلايا المراد تربيتها في واجهة الهواء السائل (علي)، لعدة أسابيع، مما يخلق أكثر من الناحية الفسيولوجية الظروف ذات الصلة. يستخدم حالة الثقافة ALI سائل الإعلام المعرفة مما يؤدي إلى ظهارة متباينة التي يسلك الخصائص المورفولوجية والوظيفية مشابهة لظهارة الأنف البشري، مع كل من خلايا مهدبة والمخاط المنتجة. إدراج زراعة الأنسجة مع الخلايا الظهارية الأنف متباينة يمكن التلاعب بها في مجموعة متنوعة من الطرق اعتمادا على أسئلة البحث (العلاج مع وكلاء الدوائية، تنبيغ مع ناقلات lentiviral، والتعرض للغازات، أو العدوى الميكروبية مع وكلاء) وتحليل للعديد من نقاط النهاية مختلفة تتراوح بين مسارات الخلوية والجزيئية، الفصل الوظيفيفي نفس الفئة، مورفولوجيا، الخ

نماذج في المختبر من خلايا الظهارية البشرية المتباينة الأنف ستمكن المحققين لمعالجة الرواية وأسئلة بحثية هامة باستخدام نماذج تجريبية عضوي النمط التي تحاكي إلى حد كبير الظهارة الأنفية في الجسم الحي.

Introduction

الهدف من هذه التقنية

الخلايا الظهارية (ECS) في الشعب الهوائية هي من بين المواقع الأولى أن تتعرض مباشرة إلى الضغوطات البيئية المستنشقة، مثل مسببات الأمراض، والمواد المسببة للحساسية أو ملوثات الهواء. ECS أكثر من حاجز الهيكلية: وهي بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابة المناعية في الجهاز التنفسي 1-3 عن طريق الافراج عن وسطاء للذوبان 4-6 والتعبير عن بروابط / المستقبلات على السطحية بهم 7-9. بينما خطوط الخلايا مخلد يمكن استخدامها كنماذج لدراسة الجهاز التنفسي ECS في المختبر، فإنها تفشل على التمايز إلى السكان الخلية غير متجانسة تتكون من خلايا مهدبة الاستقطاب والمخاط المنتجة، على غرار ما لوحظ في الجسم الحي. لألخص الخصائص المهمة للظهارة التنفسية لوحظت في الجسم الحي، ويمكن استخدام ECS الهوائية الأولية. وبالتالي، كان هدفنا لتحسين أسلوبنا استخدام الأنف ECS (NECS) تم الحصول عليها من متطوعين من البشر. يتم توسيع NECS وتربيتها في المختبر، مما أسفر عن ثقافة نموذج الخلية من NECS متباينة الذي يحاكي العديد من الميزات من الظهارة الأنفية ينظر في الجسم الحي.

الأساس المنطقي

استخدام نماذج في المختبر مع ECS الابتدائي الإنسان في محاكاة الوضع الجسم الحي - كما هو موضح في هذه الدراسة - يعطي إمكانيات فريدة لدراسة الاختلافات مرض معين من ECS، المعلمات الفسيولوجية المرتبطة ظهارة الهوائية، أو التفاعلات بين ECS وأنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الجذعية 10، والخلايا القاتلة الطبيعية 11 أو الضامة. العديد من الأساليب القائمة الاستفادة ECS الشعب الهوائية، والتي يمكن الحصول عليها عبر خزعات جراحية فرشاة خلال bronchoscopies، أو خلاف ذلك من التخلص منها أنسجة الرئة 12-17. بالإضافة إلى ذلك، للحصول على مصادر تجارية متباينة تماما الهوائية الإنسان الثقافات الخلايا الظهارية وجود (نموذج EpiAirway من ماتيك، آشلاند، MA، Cloneticsمن ونزا، بازل، سويسرا، MucilAir من Epithelix سارس، جنيف سويسرا)، حيث يمكن للمحققين اختيار من مختلف الجهات المانحة. ومع ذلك، نظرا لمجموعة محدودة من الخلايا الظهارية المتاحة تجاريا، أو مجموعة محدودة من المعلمات المقررة، فإن التكلفة المرتبطة الحصول على تجاريا الهوائية الإنسان الأساسية ECS، ومحدودية فرص الحصول على التخلص من أنسجة الرئة أو التي تم الحصول عليها حديثا الأنسجة الخزعة القصبي الإنسان، وتحظر العديد من المحققين من إجراء دراسات في مجرى الهواء ECS الإنسان متباينة تماما. لذلك، شرعنا في تطوير تقنية من شأنها أن 1) الاستفادة NECS الإنسان الحصول عليها غير جراحية، 2) توفير بروتوكول الغلة ثقافات متباينة ظهارة الهوائية الإنسان، و 3) أن تكون قابلة للتكرار في معظم الإعدادات المختبر مع البنية التحتية القائمة زراعة الأنسجة.

المزايا على تقنيات موجودة / نماذج

الحصول على NECS جديدة، بالمقارنة مع الشعب الهوائية أو الشعب الهوائية الصغيرة ECS، هو أقل بكثير الغازية، الفرديةو يمكن تحتاج فحص عدة مرات مع عدم وجود آثار جانبية كبيرة، ويمكن أن تجرى سطحية الخزعات كشط الأنف في السكان المريضة التي لولاها لم يكن مؤهلا للحصول bronchoscopies البحوث ذات الصلة. موسع الخزعات كشط سطحي للحصول على NECS تسمح المحقق لوضع مواصفات المانحة بداهة، بما في ذلك السن والجنس والحالة المرضية، الخ وفقا لهدف البحث إلى أن يتحقق. وبالتالي، عند تصميم الدراسات البحثية المحققين لا تقتصر من قبل الأنسجة المتوفرة سريريا / عينة الظهارية، وشراء مكلفة متباينة نماذج ثقافة الخلية من الباعة التجارية، أو تصميم الدراسات القصبات الغازية. بالإضافة إلى ذلك، وسهولة الحصول على NECS يزيد من القدرة على إجراء التجارب في الخلايا من مختلف الجهات المانحة، مما يعزز من التحقق من صحة النتائج الإحصائية لوحظ. أخيرا، الأنف هي واحدة من المواقع الأولى أن تتعرض إلى أي نوع من الضغوطات المحمولة جوا. وبالتالي، وتوليد عضوي النمط فيالمختبر أنظمة محاكاة الثقافة الظهارة الأنفية هي مفيدة لدراسة استنشاق الجسيمات الفيروسية، والملوثات، حساسية، أو الغازات، وهو ما يمكن تحقيقه بسهولة باستخدام هذا النظام ثقافة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد بلاستيك وير: معطف بلايت

  1. إضافة 500 ميكرولتر PureCol (1:100 المخفف بالماء المعقم) إلى كل بئر من لوحة 12 جيدا.
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 30 دقيقة، وإزالة PureCol وشطف مع HBSS الحق قبل أن يتم إضافة خلايا لوحة (راجع الخطوة 3.1 أدناه).

2. والحصول على خزعة من Pretreating NECS الإنسان

  1. خزعة الأنف كشط
    1. الحصول ECS السطحية المبطنة للالمحارات الأنفية تحت الرؤية المباشرة من خلال 9 ملم قابلة لإعادة الاستخدام منظار الأنف البولي بروبلين (نموذج 22009) على منظار الأذن مع منظار التشغيل (نموذج 21700). يوفر هذا الجهاز التصور الأمثل للالمحارات الأنفية والمرونة في الحركة.
    2. إجراء الخزعات مع موضوع يجلس منتصبا على كرسي مستقيم المدعومة مع إمالة الرأس إلى الخلف قليلا أو الكذب في موقف ضعيف على طاولة الفحص.
    3. إدراج منظار منظار الأذن إلى الأنف وturbi أدنىتصور نيت مع الإضاءة.
    4. إدراج مجرفة بالحرارة معقمة من خلال منظار مع طرف مددت بشكل أقصى إلى الجزء الخلفي من المحارة.
    5. باستخدام ضغط لطيف على سطح السفلي من المحارة، يوجه مجرفة عبر 5X سطح الغشاء المخاطي وتراجع. وسوف استرجاع ناجحة من الخلايا المخاطية التي عقدها عمل شعري يكون واضحا في كوب من مجرفة.
  2. وضع العينة في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 8 مل من RPMI 1640، نقل على الجليد.
  3. استخدام ملقط لاسترداد التحقيق، طرد الأنسجة من وحيد القرن التحقيق مع ماصة-P 1000، تجاهل التحقيق
  4. أجهزة الطرد المركزي لتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، طاف نضح (انتباه: الحرص على عدم نضح بيليه).
  5. resuspend الكرية في 1 مل BEGM مع 10 ميكرولتر من الدناز 100X 1.
  6. احتضان عند RT لمدة 20 دقيقة.
  7. الطرد المركزي (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، لا NOT نضح طاف!

3. Sعيد على خلايا البلاستيك (يوم 0)

  1. إزالة PureCol من لوحة وشطف مع HBSS (انظر أيضا الخطوة 1.2).
  2. إضافة الحد الأدنى من حجم BEGM + + وسائل الاعلام (80-100 ميكرولتر، حتى يظهر الغضروف المفصلي وسائل الإعلام في وسط البئر) في الآبار 1-4 (اعتمادا على حجم خزعة) من لوحة المغلفة.
  3. استخدام ماصة P-1000 لإزالة بعناية بيليه من الأنسجة خزعة من الأنبوب، دون الشفط وسائل الإعلام أكثر من اللازم.
  4. نقل بيليه في منتصف الآبار، والحفاظ على خزعة معا كمجموعة من الخلايا، وليس لتفريق لجعل تعليق خلية واحدة. A غلة خزعة جيدة تصل إلى 4 الآبار التي يمكن المصنف. وضع لوحة في نسيج الثقافة الحاضنة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2،> الرطوبة النسبية 90٪).
  5. تحقق بعد ساعتين للتأكد من أن هناك ما يكفي من وسائل الإعلام (من دون إزعاج الغضروف المفصلي).
  6. Day1، 24 ساعة بعد البذر: جمع كل الخلايا غير ملتصقة من جميع الآبار (لوحة الميل وجمع وسائل الإعلام مع الخلايا في P-1000، جollect جميع الآبار في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي).
  7. الطرد المركزي (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق).
  8. بينما الطرد المركزي تعليق خلية: إضافة حوالي 250 ميكرولتر من BEGM + + و 250 ميكرولتر من BEGM + خليط سائل الإعلام إلى الخلايا المصنفة في اليوم 0.
  9. كرر الخطوات من 3،1-3،5 للخلايا غير ملتصقة.
  10. يوم 2-5: وسائل الإعلام تغيير الخلايا اليومية، إضافة 500 وسائل الاعلام ميكرولتر إلى كل بئر، والحد من كمية BEGM + + متدرج وسائل الإعلام (اليوم 2 بعد البذر: 125 ميكرولتر BEGM + + بالإضافة إلى 375 ميكرولتر BEGM +، DAY3 بعد البذر والأيام التالية: 73 ميكرولتر BEGM + + بالإضافة إلى 427 ميكرولتر BEGM +).

4. توسيع الخلايا في قوارير

  1. رصد خلايا يوميا؛ بمجرد أن وصلت إلى 80-90٪ confluency (عادة بعد 5-7 أيام من خزعة، إذا كانت تستغرق وقتا أطول فإنها لن تنمو بنجاح) خلايا رفع على النحو التالي: وسائل الإعلام نضح بعناية؛ إضافة 500 ميكرولتر من التربسين 0.25٪ لكل بئر، والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (وعادة ما يستغرق 2-3 دقائق).
  2. إعداد الحاجةحجم الطبعه من فول الصويا التربسين المانع (SBTI) (750 ميكرولتر لكل 1 مل التربسين) في أنبوب 15 مل.
  3. إزاحة الخلايا مرارا وتكرارا من قبل pipetting صعودا وهبوطا في حل التربسين، ونقل خلايا منفصلة في أنبوب مخروطي 15 مل مع SBTI.
  4. شطف جميع الآبار في مجموع مع 1 مل HBSS، إضافة HBSS إلى أنبوب مع الخلايا.
  5. أجهزة الطرد المركزي لتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقائق)، ونضح وسائل الإعلام، resuspend في 1 مل BEGM + وسائل الإعلام ودوامة الأنبوب.
  6. توسيع الخلايا في T25 T75 قارورة أو اعتمادا على حجم بيليه (هذا هو P1؛ حوالي بئرين متموجة يذهب إلى واحد قارورة T75، متموجة واحد هو جيدا بما فيه الكفاية لT25 واحد، وعادة ما تسفر 2 الآبار متموجة T75 واحد).
    1. إضافة BEGM + لقوارير (5 مل كل لT75، 3 مل لكل لT25).
    2. إضافة تعليق الخلية إلى القوارير. نقل القوارير إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
  7. 24 ساعة بعد قارورة-البذر: إضافة وسائل الاعلام إضافية BEGM + إلى قارورة (3 مل إلى T25، 10 مل إلى T75).

5. بذر خلايا في الأنسجة الثقافة إدراجات

  1. إزالة وسائل الإعلام من القارورة وإضافة التربسين (3 مل لT25، T75 4 مل قارورة).
  2. احتضان عند 37 درجة مئوية حتى يتم فصل الخلايا (حوالي 2-3 دقائق).
  3. إعداد SBTI (750 ميكرولتر لكل 1 مل التربسين> 2.25 مل T25، T75 3 مل ل) في أنبوب 15 مل.
  4. إزاحة الخلايا عن طريق تسجيل القارورة وpipetting صعودا وهبوطا، ونقل إلى أنبوب مخروطي مع SBTI.
  5. شطف القارورة مع HBSS (1 مل T25، T75 2 مل ل)، إضافة HBSS إلى أنبوب 15 مل.
  6. أجهزة الطرد المركزيلتكوير (4 ° C، 400 x ج، 5 دقيقة)، وإزالة طاف بعناية.
  7. إعداد لوحات: تحديد كيفية العديد من لوحات ستكون المصنفة، تسمية لوحات مع نموذج التعليمات البرمجية والعدد، عدد مرور (أي P2) والتاريخ. إضافة 700 ميكرولتر BEGM + وسائل الإعلام إلى غرفة القاعدية.
  8. resuspend الكرية خلية في 1 مل سائل الإعلام BEGM ALI من قبل vortexing الأنبوب.
  9. عد الخلايا مع عدادة الكريات (أ T25 عادة ما تنتج حوالي 4 ملايين الخلايا؛ لT75 يمكن أن يصل إلى 20 مليون خلية اعتمادا على جزيرة، واستخدام 1-2000000 الخلايا لمدة 12 لوحة جيدا) وتمييع تعليق الخلية مع وسائل الإعلام BEGM ALI إلى الحجم الكلي اللازم لكمية من لوحات التي ينبغي المصنفة (1.2 × 10 6 خلايا في 2.5 مل سائل الإعلام في لوحة) (ملاحظة: إذا كان جزء من الخلايا تريد أن تكون مجمدة، تسمية أنبوب وإزالة الخلايا هنا: نحن عادة تجميد 2 × 10 6 خلايا في 2 مل من تجميد وسائل الاعلام)
  10. إضافة 200 ميكرولتر تعليق خلية إلى الجانب قمية كل خلية كورنينج 12well غير المصقولإدراج (> هذا سيكون حوالي 80،000-150،000 الخلايا / إدراج؛ 12 ملم مع 0.4 ميكرومتر transwells البوليستر المسام (البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET)) إدراج غشاء)؛ نقل في نسيج الثقافة الحاضنة.
  11. بعد 24 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام القمي (200 ميكرولتر المتوسطة التوسع).
  12. الحفاظ على الثقافات الخلية: تغيير وسائل الإعلام (BEGM ALI سائل الإعلام؛ 700 ميكرولتر basolateral و200 قمية ميكرولتر) كل يوم. إدراج يجب الحفاظ المغمور حتى الخلايا هي متكدسة تماما (عدم وجود ثقوب في أحادي الطبقة مرئية). اعتمادا على عدد الخلايا هذا عادة ما يستغرق ما بين 2-6 أيام، وإذا كان يستغرق وقتا أطول فإن الخلايا الأرجح لن تكون قابلة للحياة.

6. إنشاء واجهة الهواء السائل مرة واحدة في الخلايا هي مندمج تماما (عندما خلايا في Transwells هي تماما مندمج)

  1. مرة واحدة في الخلايا هي متكدسة تماما تحل محل كل وسائل الإعلام وقمية basolateral مع وسائل الاعلام BEGM ALI تستكمل مع 500nM حمض الريتينويك لمدة 48 ساعة.
  2. 48 ساعة بعد إضافة حمض الريتينويك تستكمل BEGM ALI سائل الإعلام: إعداد PneumaCult-ALI الصيانة متوسطة (تعليمات الشركة التالية و): احسب حجم المتوسطة اللازمة (لوحة واحدة عادة 8.5 مل لمقصورات القاعدية)، ويضاف لكل 1 مل PneumaCult كاملة قاعدة متوسطة :

    10 ميكرولتر PneumaCult 100X الملحق الصيانة
    2 ميكرولتر الهيبارين (من محلول المخزون 2 ملغ / مل)
    5 ميكرولتر هيدروكورتيزون (من محلول المخزون 96 ميكرولتر / مل).

  3. إزالة جميع وسائل الإعلام وإضافة 700 ميكرولتر PneumaCult-ALI سائل الإعلام الصيانة إلى الجانب basolateral فقط (وليس المتوسطة على الجانب القمي).
  4. الحفاظ على مزارع الخلايا لمدة 4 أسابيع في ALI:
    1. تغيير وسائل الإعلام كل يوم (الاثنين والأربعاء والجمعة الجدول الزمني يعمل بشكل جيد بالنسبة لنا).
    2. بعد أسبوع واحد على ALI، مرة واحدة في الأسبوع (الأربعاء) يتم شطف السطح القمي: إضافة 200 ميكرولتر HBSS إلى الجانب القمي، والاحتفاظ بها لمدة 10 دقيقة في الحاضنة، نضح بعنايةHBSS (استخدام 9 في الزجاج ماصة تعلق على فخ الفراغ في خزانة السلامة البيولوجية، واستخدام 200 ميكرولتر نصائح على غيض من ماصة لشفط قبالة HBSS).

ملاحظة: تغيير نصائح بين لوحات، وكذلك تغيير نصائح عند الانتقال من سطح قمية مقابل basolateral. بعد حوالي 2 أسابيع في ALI، تبدأ الخلايا على التمايز وتظهر أهداب. مزارع الخلايا تصل إلى التمايز كامل بعد حوالي 4 أسابيع في ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مثقف NECS بعد بروتوكول هنا وصفت إعادة التفريق، في طبقة غير متجانسة من ECS يتألف من خلايا مهدبة وغير مهدبة، ويمثل الوضع في الجسم الحي (الشكل 1). بعض NECS المتباينة هي المخاط إنتاج (خلايا تلطيخ في الزرقاء باستخدام AB / PAS، الشكل 1B). على الرغم من أن بروتوكول المعروضة هنا هو الأمثل، ويمكن التفريق تختلف فيما يتعلق بتوزيع السكان الخلية الكلي (أي نسب مختلفة من الخلايا المهدبة: الخلايا المنتجة للمخاط: خلايا غير مهدبة) أو حتى تسفر عن مزيد من ظهارة الحرشفية. ويمكن لهذه التغيرات تعتمد على السكان المانحة، وبالتالي تمثل خلاصة من النمط الظاهري الأمراض الكامنة، كما أننا أثبتنا سابقا باستخدام NECS من المدخنين 18. يبين الشكل 2 أمثلة عن اختلاف إعادة الأمثل NECS باستخدام بروتوكول مختلفة وتركيبات وسائل الإعلام. الخلايا الحرشفية هي ولا مكعبية ولا مهدبة ولا تقليد ظهارة التنفسي كاذب (الشكل 2).

الشكل 1
الشكل 1. ثقافة NEC الإنسان متباينة إعادة. كانت ثابتة NECS مع PFA 4٪ وجزءا لا يتجزأ من البارافين. كانت ملطخة الثقافات مع الهيماتوكسيلين ويوزين (A) والألسيان الأزرق / الدوري حمض شيف (B) (التالية الأساليب المذكورة في 19). الصور تظهر NECS مع منظمة واضحة، بنية مكعبة، والخلايا المنتجة للمخاط القدح وكذلك مهدبة ECS.

الرقم 2
الشكل 2. الهيماتوكسيلين ويوزين ملطخة القسم جزءا لا يتجزأ من البارافين من الثقافات دون المستوى الأمثل. الثقافات NEC مع تمايز دون المستوى الأمثل. الخلايا الحرشفية تظهر، لا cuboidaهيكل لتر، أي خلايا مهدبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توفير ECS الجهاز التنفسي ليس فقط حاجز مادي لحماية جسم الإنسان من مؤثرات خارجية 20، ولكن أيضا بمثابة لوحة مفاتيح لبدء وتنظيم الاستجابات الدفاع المناعي الجهاز التنفسي 1-3 عن طريق إفراز وسطاء للذوبان أو مستقبلات يجند المباشر التفاعلات خلية خلية. من أجل مواصلة دراسة دور ECS في الاستجابة المناعية، لدراسة الخلافات المحتملة بين ECS من السكان المريضة، أو لدراسة آثار الضغوطات الخارجية على ECS، فمن المهم أن ألخص الوضع في الجسم الحي. الشعب الهوائية الإنسان تحتوي على أكثر من 40 أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك خلايا الظهارية 20 مختلفة، مثل خلايا مهدبة، والخلايا القاعدية والخلايا الكأسية 20. يصف بروتوكول لدينا كيف يمكن معالجتها خزعة الأنف كشط سطحية لانتاج NECS التي يمكن توسيعها وإعادة تربيتها على الخضوع التمايز، مما أسفر الثقافات NEC، والتي تحاكي إلى حد كبير الظهارة الأنفية في الجسم الحي.

استخدام هذا النموذج في المختبر عضوي النمط من NECS متباينة الإنسان الأساسية يوفر إمكانيات فريدة لمختلف التطبيقات. لأنها تتيح دراسة الاختلافات مرض معين من NECS (مثل التليف الكيسي، الربو، والتدخين)، وآليات الكامنة وراء المرض، وكذلك التعرض للرقابة لملوثات الهواء (مثل الأوزون، عادم الديزل، ودخان السجائر) 18،21-23. بالإضافة إلى ذلك، NECS متباينة نمت على إدراج زراعة الأنسجة تصلح للمشاركة في الثقافة مع أنواع الخلايا الأخرى (مثل الخلايا الجذعية، والخلايا القاتلة الطبيعية، أو الضامة) 10،11، مما يسمح لدراسة التفاعلات خلية خلية في الإعداد للرقابة.

نحن تصف زراعة وإعادة التفريق من NECS، وليس الخلايا الظهارية القصبية، والتي تم استخدامها في العديد من الدراسات المنشورة سابقا 24-27. ونحن نرى عدة أسباب لماذا استخدام NECS يمكن أن تكون مفيدة بالمقارنة مع استخدامالقصبي ECS. أولا، الحصول على الخزعات سطحية كشط الأنف هو أقل تكلفة من إجراء تنظير القصبات للحصول على خزعات الفرشاة. الثاني، لمجموعة متنوعة من الأمراض الموجودة مسبقا (مثل قطع المصابين بالربو) فمن غير الواقعي لإجراء تنظير القصبات المرتبطة بالبحوث إلى الحصول على أقل الخلايا الظهارية مجرى الهواء. ومع ذلك، فإن إجراء أقل الغازية من كشط السطح السفلي للالمحارة الأنفية السفلية مع الكركدن التحقيق لا يمكن أن يؤديها في هذه المواضيع. الثالث، الخزعات كشط الأنف يمكن أن يؤديها على نفس الأفراد عدة مرات (عادة حوالي 4 أسابيع بين خزعات) من دون أي آثار جانبية كبيرة 28-30. الرابع، NECS هي من بين الخلايا الأولى أن تتعرض لاستنشاق الضغوطات البيئية، مثل ملوثات الهواء، ومسببات الأمراض أو المواد المسببة للحساسية، وبالتالي تمثل قيمة نماذج في المختبر لدراسة آثار هذه الضغوطات على الخلايا الظهارية مجرى الهواء.

مختلف النظم خلية ثقافة إعادة تختلف-تتوفر تجاريا (مثل نموذج EpiAirway من ماتيك، آشلاند، MA، Clonetics من ونزا، بازل، سويسرا، MucilAir من Epithelix سارس، جنيف سويسرا) entiated ECS الإنسان. تلك الثقافات الخلية المتاحة تجاريا تبقى مستقرة لفترة زمنية طويلة وتتميز أيضا. ومع ذلك، فهي مكلفة والدراسات عادة ما تقتصر على عدد قليل من العينات من مختلف الأفراد. بالإضافة إلى ذلك، فإنه من الصعب للسيطرة على السكان من الجهات المانحة، والذي يعتمد على توافر المقدمة من المورد. الحصول على الخزعات طازجة NECS مع كشط سطحية يسمح للمحقق للسيطرة على خصائص الموضوع (مثل العمر والجنس والعرق والوزن ومؤشر كتلة الجسم، والحالة المرضية، واستخدام الأدوية، الخ) والمتطوعين إعادة استدعاء مرة أخرى لمتابعة المحتملة يصل.

بشكل عام، كل البروتوكولات نشرت لإعادة التفريق-الهوائية الإنسان (إما الشعب الهوائية أو الأنف) ECS في ALI تتضمن إجراءات مماثلة: obtaininز ECS، وتوسيع الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة، وتحويلها إلى ثقافة الخلية التي يسهل اختراقها إدراج للتمايز في ALI. البروتوكولات تختلف في نوع من وسائل الإعلام، والمكملات عامل النمو، وعدد من الركض، وطلاء للإدراج، وتفعيل NECS قبل تأسيس ALI. بينما في بروتوكول واحد، بعد الحصول على وهضم، والخلايا هي المصنفة مباشرة على إدراج غير المصقول وأبقى فقط بضعة أيام في ALI قبل الاستخدام 13؛ تشمل البروتوكولات الأخرى زراعة لعدة أسابيع لإعادة التفريق، في 12،14،15 ALI . ليس هناك اتساق حول طلاء إدراج مع الكولاجين أو غيرها من مكونات المصفوفة خارج الخلية: في حين أن بعض البروتوكولات تتطلب طلاء 12،15 الآخرين استخدام إدراج غير المصقول 13،14. ومع ذلك، ظروف الثقافة هي ذات أهمية كبيرة، خصوصا الإعدادات الحاضنة. الرطوبة النسبية، والتي يجب أن تكون> 90٪، وثاني أكسيد الكربون التي ينبغي تعديلها في 5٪ هي جداعوامل هامة لتجنب الجفاف من زراعة الخلايا وتساعد علي تخفيف من وسائل الإعلام. من أجل تبادل الخبرات لدينا، ونحن نريد أن نذكر هنا أنه ليس هناك نسبة نجاح 100٪. بعض عينات خزعة الأنف كشط لا تلتزم لوحة زراعة الأنسجة، في حين أن بعض العينات NEC لا تلتزم إدراج أو لن يصل confluency. على مر السنين، ومعدل النجاح العام لدينا باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا هو ما يقرب من 80٪. وتبين تجربتنا أن زراعة من NECS من السكان المريضة محددة، مثل المدخنين، هو أكثر صعوبة من NECS من الأصحاء غير المدخنين

لدينا بروتوكول للزراعة من NECS الإنسان الأساسية يشتمل على العديد من الخطوات الرئيسية التي نحن الأمثل على مر السنين: 1. يتم توسيع NECS مرتين فقط قبل أن يتم المصنفة على أنها ملحقة زراعة الأنسجة. 2. يتم استخدام إدراج غير المصقول. 3. مرة واحدة المصنفة على لوحات زراعة الأنسجة، ويتم تقليل كمية NuSerum تدريجي لتجنب أن الخلايا يقلع من زراعة الأنسجةلوحات. 4. يتم الاحتفاظ NECS 25-28 يوما على الأقل في ALI قبل استخدامها في تجارب لضمان استكمال إعادة التمايز. وباختصار، فإن بروتوكول الموصوفة هنا يتضمن البروتوكول الأمثل للثقافة وإعادة التفريق-NECS الإنسان على ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر ليزا دايلي للمدخلات مفيدة.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (ES013611 وHL095163)، ومضيفات معهد البحوث الطبية (FAMRI)، وكالة حماية البيئة (CR83346301) وتعلن أي تضارب في المصالح. المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. وإن كان قد مولت البحث الموضحة في هذه المقالة في جزء من وكالة حماية البيئة في الولايات المتحدة من خلال التعاون CR83346301 اتفاق مع مركز الطب البيئي والربو وعلم الأحياء الرئة في جامعة نورث كارولينا، تشابل هيل، لم يخضع ل الوكالة نظير المطلوبة واستعراض السياسات وبالتالي لا تعكس بالضرورة وجهة نظر الوكالة، وليس موافقة رسمية يجب أن يكون تفسيره. يذكر سالأسماء التجارية و أو المنتجات التجارية لا يشكل موافقة أو توصية للاستخدام. ويدعم وريتا مولر من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية بمنحة الشخصية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
  2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
  3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. (2012).
  4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
  5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
  6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
  7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
  8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
  9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
  10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. (2010).
  11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. (2013).
  12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
  13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
  14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39, (2003), 266-269 (2003).
  15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
  16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
  17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
  18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
  19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
  20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
  21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
  22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
  23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
  24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. (2012).
  25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
  26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
  27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
  28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
  29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
  30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics