एयर तरल इंटरफेस पर मानव नाक उपकला कोशिकाओं के संवर्धन

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

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Summary

मानव स्वयंसेवकों की सतही परिमार्जन बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त की नाक उपकला कोशिकाओं, ऊतकों संस्कृति आवेषण पर विस्तार किया है और स्थानांतरित कर रहे हैं. Confluency तक पहुँचने पर, कोशिकाओं रोमक और गैर रोमक कोशिकाओं की संस्कृतियों उपज, हवा तरल इंटरफेस में बड़े हो रहे हैं. विभेदित नाक उपकला सेल संस्कृतियों सांस mucosa के अध्ययन के लिए व्यवहार्य प्रयोगात्मक मॉडल उपलब्ध कराते हैं.

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Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

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Abstract

का उपयोग इन विट्रो मॉडल में मानव प्राथमिक उपकला कोशिकाओं माइक्रोबियल संक्रमण या साँस एजेंटों के संदर्भ में श्वसन उपकला के महत्वपूर्ण कार्यों को समझने में जरूरी है. रोगग्रस्त आबादी से प्राप्त कोशिकाओं की प्रत्यक्ष तुलना हमें अलग phenotypes विशेषताएँ और उपकला सेल समारोह में परिवर्तन मध्यस्थता अंतर्निहित तंत्र काटना करने की अनुमति. मानव tracheobronchial क्षेत्र से उपकला कोशिकाओं संवर्धन अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, लेकिन ब्रोन्कियल ब्रश बायोप्सी प्राप्त करने के साथ जुड़े मानव फेफड़े के ऊतकों या invasiveness की उपलब्धता सीमित है. नाक उपकला कोशिकाओं बहुत कम आक्रामक सतही नाक परिमार्जन बायोप्सी के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं और विषयों कोई महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव के साथ कई बार biopsied किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, नाक श्वसन प्रणाली को प्रवेश बिंदु है और इसलिए इस तरह के सूक्ष्म जीवाणु एजेंट के रूप में वायु जनित तनाव के किसी भी प्रकार के संपर्क में होने वाली पहली साइटों में से एक, प्रदूषण, या एलर्जी.

संक्षेप में, मानव स्वयंसेवकों से प्राप्त नाक उपकला कोशिकाओं लेपित टिशू कल्चर प्लेट पर विस्तार किया है, और फिर सेल संस्कृति आवेषण पर स्थानांतरित कर रहे हैं. Confluency तक पहुँचने पर, कोशिकाओं को और अधिक physiologically प्रासंगिक परिस्थितियों बनाता है जो कई हफ्तों के लिए, हवा तरल इंटरफेस (अली) में संवर्धित किया जाना जारी है. अली संस्कृति हालत उत्पादन रोमक और बलगम दोनों कोशिकाओं के साथ मानव नाक उपकला के समान रूपात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं, दर्शाती है कि एक विभेदित उपकला के लिए अग्रणी परिभाषित मीडिया का उपयोग करता है. विभेदित नाक उपकला कोशिकाओं के साथ ऊतक संस्कृति आवेषण अनुसंधान सवाल (औषधीय एजेंटों के साथ इलाज, lentiviral वैक्टर, गैसों के संपर्क में, या माइक्रोबियल एजेंटों के साथ संक्रमण के साथ पारगमन) के आधार पर विभिन्न तरीकों से में चालाकी और से लेकर कई अलग endpoints के लिए विश्लेषण किया जा सकता है सेलुलर और आणविक मार्ग, कार्यात्मक चर्चाAnges, आकृति विज्ञान, आदि

विभेदित मानव नाक उपकला कोशिकाओं की इन विट्रो मॉडल में काफी हद तक इन विवो में नाक उपकला कि नकल organotypic प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करके उपन्यास और महत्वपूर्ण अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए जांचकर्ताओं सक्षम हो जाएगा.

Introduction

तकनीक का लक्ष्य

वायुमार्ग में उपकला कोशिकाओं (ईसीएस) सीधे ऐसी रोगजनकों, एलर्जी या वायु प्रदूषण के रूप में साँस पर्यावरण तनाव, के संपर्क में होने वाली पहली साइटों में से एक हैं. ईसीएस एक संरचनात्मक बाधा तुलना में अधिक हैं: वे घुलनशील मध्यस्थों 4-6 और उनके surfac 7-9 पर ligands / रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति की रिहाई के माध्यम से सांस की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-3 आरंभ और विनियमित करने के लिए एक स्विचबोर्ड के रूप में कार्य. अमर सेल लाइनों विट्रो में सांस ईसीएस अध्ययन करने के लिए मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, वे इन विवो में मनाया जाता है के समान polarized रोमक और बलगम उत्पादक कोशिकाओं से बना विषम सेल आबादी में अंतर करने में विफल. Vivo में मनाया श्वसन उपकला के महत्वपूर्ण विशेषताओं पुनरावृत्ति करना, प्राथमिक airway ईसीएस इस्तेमाल किया जा सकता है. इसलिए, हमारे लक्ष्य नाक ईसीएस (एनईसीएस) का उपयोग हमारी विधि का अनुकूलन के लिए था मानव स्वयंसेवकों से प्राप्त. एनईसीएस विवो में देखा नाक उपकला की सुविधाओं के कई mimics जो विभेदित एनईसीएस की एक सेल संस्कृति मॉडल उपज, इन विट्रो में विस्तार किया है और सुसंस्कृत हैं.

औचित्य

vivo स्थिति में नकल उतार मानव प्राथमिक ईसीएस के साथ इन विट्रो मॉडल का उपयोग - इस अध्ययन में वर्णित के रूप में -, रोग ईसीएस के विशिष्ट मतभेद, airway उपकला के साथ जुड़े शारीरिक मापदंड, या ईसीएस और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय संभावनाओं देता है इस तरह के वृक्ष के समान सेल के रूप में 10, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं 11 या मैक्रोफेज. कई मौजूदा तरीकों bronchoscopies दौरान ब्रश बायोप्सी के माध्यम से invasively प्राप्त, या अन्यथा खारिज फेफड़े के ऊतकों 12-17 से किया जा सकता है जो ब्रोन्कियल ईसीएस, उपयोग. इसके अलावा, पूरी तरह से विभेदित मानव airway उपकला सेल संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए वाणिज्यिक सूत्रों MatTek, Ashland, एमए, Clonetics से (EpiAirway मॉडल मौजूद हैंजांचकर्ताओं अलग दाताओं से चुन सकते हैं जहां Lonza, बेसल, स्विट्जरलैंड, Epithelix सार्स से MucilAir, जिनेवा स्विट्जरलैंड), से. हालांकि, क्योंकि सीमित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकला कोशिकाओं, या मापदंडों के निर्धारित सेट के सीमित पूल, व्यावसायिक रूप से प्राथमिक मानव airway ईसीएस प्राप्त करने के साथ जुड़े लागत, और त्याग फेफड़े के ऊतकों या हौसले से प्राप्त मानव ब्रोन्कियल बायोप्सी ऊतक तक सीमित पहुंच, कई जांचकर्ताओं निषेध पूरी तरह से विभेदित मानव airway ईसीएस अध्ययन के संचालन से. इसलिए, हम 1), गैर invasively प्राप्त मानव एनईसीएस उपयोग 2) विभेदित मानव airway उपकला की संस्कृतियों से बेदखल एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और 3) एक मौजूदा टिशू कल्चर बुनियादी सुविधाओं के साथ सबसे प्रयोगशाला सेटिंग्स में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हो जाएगा कि एक तकनीक विकसित करने के लिए निकल पड़े.

मौजूदा तकनीक / मॉडल से अधिक लाभ

ताजा एनईसीएस प्राप्त करने, ब्रोन्कियल या छोटे airway ईसी की तुलना में, बहुत कम आक्रामक, व्यक्तिगत हैकोई महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव के साथ कई बार biopsied किया जा सकता है, और सतही नाक परिमार्जन बायोप्सी अन्यथा अनुसंधान से संबंधित bronchoscopies लिए पात्र नहीं होगा जो रोगग्रस्त आबादी में आयोजित किया जा सकता है. एनईसीएस प्राप्त करने के लिए अवेध्य सतही परिमार्जन बायोप्सी अन्वेषक पूरा किया जा करने के लिए अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार आदि आयु, लिंग, रोग की स्थिति, सहित, दाता विनिर्देश एक प्राथमिकताओं सेट करने के लिए अनुमति देते हैं. अनुसंधान अध्ययन डिजाइन इस प्रकार, जब जांचकर्ताओं वाणिज्यिक विक्रेताओं, या डिजाइन आक्रामक ब्रोंकोस्कोपी पढ़ाई से महंगा विभेदित सेल संस्कृति मॉडल की खरीद, चिकित्सकीय उपलब्ध ऊतकों / उपकला नमूना द्वारा ही सीमित नहीं हैं. इसके अलावा, एनईसीएस प्राप्त करने के लिए आसानी मनाया निष्कर्षों के सांख्यिकीय सत्यापन को बढ़ाता है, जो अलग दाताओं से कोशिकाओं में प्रयोगों का संचालन करने की क्षमता बढ़ जाती है. अन्त में, नाक वायु जनित तनाव के किसी भी प्रकार के संपर्क में होने वाली पहली साइटों में से एक है. इस प्रकार, में organotypic सृजननाक उपकला नकल उतार विट्रो संस्कृति सिस्टम को आसानी से इस सेल संस्कृति प्रणाली का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जो वायरल कणों, प्रदूषण, एलर्जी, या गैसों की साँस लेना के अध्ययन के लिए उपयोगी होते हैं.

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Protocol

1. प्लास्टिक वेयर तैयार: कोट प्लेट

  1. 12 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl PureCol (1:100 बाँझ पानी से पतला) जोड़ें.
  2. 30 मिनट के लिए एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, PureCol हटाने और कोशिकाओं की थाली के लिए जोड़ रहे पहले HBSS सही से कुल्ला (नीचे 3.1 कदम देखें).

2. प्राप्त करने और मानव एनईसीएस की pretreating बायोप्सी

  1. नाक परिमार्जन बायोप्सी
    1. वीक्षक के साथ एक ऑपरेटिंग ओटोस्काप पर एक 9 एमएम पुन: प्रयोज्य polypropylene नाक वीक्षक (मॉडल 22,009) के माध्यम से प्रत्यक्ष दृष्टि के तहत नाक turbinates अस्तर सतही ईसीएस (मॉडल 21700) प्राप्त करें. यह डिवाइस नाक turbinates और गति का लचीलापन का इष्टतम दृश्य प्रदान करता है.
    2. सिर को पीछे थोड़ा झुका या एक परीक्षा की मेज पर एक लापरवाह स्थिति में झूठ बोल के साथ एक सीधे समर्थित कुर्सी में ईमानदार बैठा विषय के साथ बायोप्सी प्रदर्शन.
    3. नथुने में ओटोस्काप वीक्षक और अवर turbi डालेंनैट रोशनी के साथ कल्पना.
    4. Turbinate के पीछे करने के distally बढ़ाया टिप के साथ वीक्षक के माध्यम से एक बाँझ थर्माप्लास्टिक curette डालें.
    5. Turbinate के अवर सतह पर कोमल दबाव का प्रयोग, curette mucosal सतह 5x भर में तैयार की और से मुकर गया है. केशिका क्रिया द्वारा आयोजित mucosal कोशिकाओं का एक सफल पुनर्प्राप्ति curette के कप में स्पष्ट हो जाएगा.
  2. RPMI 1640 के 8 मिलीग्राम, बर्फ पर परिवहन युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में नमूना रखें.
  3. , जांच पुनः प्राप्त एक पी -1000 पिपेट साथ राइनो जांच से ऊतक बेदखल, जांच त्यागने संदंश का प्रयोग करें
  4. अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला Aspirate (ध्यान: गोली महाप्राण नहीं सावधान) (4 डिग्री सेल्सियस, 400 XG, 5 मिनट) गोली.
  5. 100x DNase 1 की 10 μl के साथ 1 मिलीलीटर BEGM में गोली Resuspend.
  6. 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  7. अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस, 400 XG, 5 मिनट), सतह पर तैरनेवाला aspirate नहीं है!

3. एसप्लास्टिक पर eed कोशिकाओं (0 दिन)

  1. थाली से PureCol निकालें और HBSS के साथ कुल्ला (भी 1.2 कदम देखें).
  2. (मीडिया के एक meniscus अच्छी तरह के केंद्र में प्रकट होता है जब तक, 80-100 μl) लेपित प्लेट की (बायोप्सी आकार पर निर्भर करता है) 1-4 कुओं में BEGM + + मीडिया का एक न्यूनतम मात्रा में जोड़ें.
  3. ध्यान से बहुत ज्यादा मीडिया aspirating बिना, ट्यूब से बायोप्सी ऊतक की गोली को निकालने के लिए एक पी -1000 पिपेट का प्रयोग करें.
  4. , कुओं के बीच में गोली स्थानांतरण कोशिकाओं का एक समूह के रूप में एक साथ बायोप्सी रखने के लिए, और एक एकल कक्ष निलंबन बनाने के लिए ऊपर तोड़ नहीं है. वरीयता प्राप्त किया जा सकता है कि 4 कुओं के लिए एक अच्छा बायोप्सी पैदावार. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2,> 90% सापेक्ष आर्द्रता) में थाली रखो.
  5. (Meniscus परेशान बिना) पर्याप्त मीडिया है कि वहाँ आश्वस्त करने के लिए दो घंटे के बाद की जाँच करें.
  6. Day1, 24 घंटा बाद बोने: सभी कुओं की सभी गैर पक्षपाती कोशिकाओं (झुकाव प्लेट इकट्ठा करने और एक पी 1000, सी में कोशिकाओं के साथ मीडिया इकट्ठाएक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ollect सभी कुओं).
  7. अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस, 400 XG, 5 मिनट).
  8. सेल निलंबन centrifuging जबकि: 0 दिन पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं को BEGM + + और BEGM + मीडिया मिश्रण के 250 μl के बारे में 250 μl जोड़ें.
  9. दोहराएँ गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए 3.1-3.5 कदम.
  10. दिन 2-5: दैनिक कोशिकाओं के परिवर्तन मीडिया;, प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 500 μl मीडिया जोड़ने BEGM + + मीडिया stepwise (2 दिन की मात्रा को कम बोने के बाद: 125 μl BEGM + + प्लस 375 μl BEGM +, बोने के बाद day3 और बाद के दिनों: 73 μl BEGM + + प्लस 427 μl BEGM +).

4. बोतल में कोशिकाओं के विस्तार

  1. दैनिक कोशिकाओं पर नजर रखने, वे निम्नलिखित के रूप में 80-90% confluency (वे अब लेने के लिए आम तौर पर अगर 5-7 दिन बायोप्सी के बाद, वे सफलतापूर्वक विकास नहीं होगा) लिफ्ट कोशिकाओं तक पहुँच चुके हैं एक बार:, 0.25% trypsin के 500 μl जोड़ने ध्यान से महाप्राण मीडिया कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं जब तक अच्छी तरह से प्रति, (यह आमतौर पर 2-3 मिनट लगते हैं) 37 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए उन्हें.
  2. जरूरत के तैयार करेंएक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सोया trypsin अवरोध करनेवाला (SBTI) (1 मिलीलीटर Trypsin प्रति 750 μl) की एड मात्रा.
  3. बार बार ऊपर pipetting द्वारा और trypsin समाधान नीचे कोशिकाओं को जगह देना; SBTI साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरण अलग कोशिकाओं.
  4. कोशिकाओं के साथ ट्यूब HBSS जोड़ने, कुल 1 मिलीलीटर HBSS में साथ सभी कुओं कुल्ला.
  5. , (4 डिग्री सेल्सियस, 400 XG, 5 मिनट) गोली 1 मिलीलीटर BEGM + मीडिया में मीडिया, resuspend aspirate और ट्यूब भंवर अपकेंद्रित्र.
  6. गोली आकार के आधार पर एक T25 या T75 फ्लास्क में कोशिकाओं का विस्तार (इस P1 है, लगभग दो मिला हुआ कुओं एक T75 फ्लास्क में जाना, एक मिला हुआ अच्छी तरह से एक T25 के लिए पर्याप्त है, आम तौर पर 2 मिला हुआ कुओं एक T75 उपज).
    1. (एक T75 के लिए 5 मिलीलीटर प्रत्येक, एक T25 के लिए 3 मिलीग्राम प्रत्येक) बोतल को BEGM + जोड़ें.
    2. बोतल के लिए सेल निलंबन जोड़ें. एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में बोतल स्थानांतरण.
  7. 24 घंटा बाद कुप्पी बोने: कुप्पी (एक T25 के लिए 3 मिलीग्राम, एक T75 के लिए 10 मिलीग्राम) के लिए अतिरिक्त BEGM + मीडिया जोड़ें.

5. टिशू कल्चर इंसर्ट पर कक्ष बीज

  1. कुप्पी से मीडिया निकालें और trypsin (T25 के लिए 3 मिलीग्राम, T75 फ्लास्क के लिए 4 मिलीलीटर) जोड़ें.
  2. कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते (लगभग 2-3 मिनट).
  3. SBTI (1 मिलीलीटर Trypsin प्रति 750 μl> T25, T75 के लिए 3 मिलीग्राम के लिए 2.25 मिलीग्राम) एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में तैयार करें.
  4. नीचे कुप्पी टेप और ऊपर pipetting और से कोशिकाओं को जगह देना और SBTI साथ शंक्वाकार ट्यूब को हस्तांतरण.
  5. 15 मिलीलीटर ट्यूब को HBSS जोड़ने, HBSS (T25, T75 के लिए 2 मिलीलीटर के लिए 1 मिलीग्राम) के साथ फ्लास्क कुल्ला.
  6. अपकेंद्रित्र(4 डिग्री सेल्सियस, 400 XG, 5 मिनट) गोली, ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  7. प्लेटों की तैयारी: वरीयता प्राप्त होने जा रहे हैं कि कितने प्लेटों का फैसला, नमूना कोड और संख्या, मार्ग संख्या (यानी P2) और तारीख के साथ प्लेटें लेबल. बेसल चैम्बर के लिए 700 μl BEGM + मीडिया जोड़ें.
  8. ट्यूब vortexing द्वारा 1 मिलीलीटर BEGM अली मीडिया में सेल गोली Resuspend.
  9. एक hemocytometer साथ कक्षों की गणना (एक T25 आमतौर पर लगभग 4 मिलियन कोशिकाओं का उत्पादन, एक T75 आइलेट के आधार पर करने के लिए 20 मिलियन कोशिकाओं हो सकता है, एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए कोशिकाओं का 1-2 लाख का उपयोग) और साथ सेल निलंबन पतला (प्रति प्लेट 2.5 एमएल मीडिया में 1.2 x 10 6 कोशिकाओं) वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए कि प्लेटों की राशि के लिए आवश्यक कुल मात्रा को BEGM अली मीडिया (नोट:. कोशिकाओं के हिस्से के जमे हुए किया जा चाहते हैं, ट्यूब लेबल और कोशिकाओं को हटाने यहाँ: हम आम तौर पर) मीडिया ठंड के 2 मिलीलीटर में 2 x 10 6 कोशिकाओं फ्रीज
  10. प्रत्येक uncoated Corning 12well सेल के शिखर की ओर करने के लिए 200 μl सेल निलंबन जोड़ेंसम्मिलित (> इस बारे में 80,000-150,000 कोशिकाओं / सम्मिलित किया जाएगा, 0.4 माइक्रोन रोमकूप पॉलिएस्टर (polyethylene terephthalate (पीईटी)) झिल्ली डालने के साथ 12 मिमी transwells), टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित.
  11. 24 घंटे के बाद, शिखर मीडिया (200 μl विस्तार मध्यम) बदल जाते हैं.
  12. सेल संस्कृतियों को बनाए रखने: (BEGM अली मीडिया, 700 μl basolateral और 200 μl शिखर) मीडिया बदलें हर दूसरे दिन. इंसर्ट कोशिकाओं (monolayer में कोई छेद दिखाई दे रहे हैं) पूरी तरह से मिला हुआ हैं जब तक जलमग्न बनाए रखा जाना है. यह कोशिकाओं की संभावना सबसे अधिक व्यवहार्य नहीं होगा अब लगता है अगर सेल नंबर के आधार पर यह आमतौर पर 2-6 के बीच दिन लगते हैं.

6. एक बार कोशिकाओं (transwells पर कोशिकाओं को पूरी तरह मिला हुआ हैं जब) पूरी तरह से मिला हुआ हैं एयर तरल इंटरफेस की स्थापना

  1. कोशिकाओं 48 घंटे के लिए 500nm retinoic एसिड के साथ पूरक BEGM अली मीडिया के साथ दोनों शिखर और basolateral मीडिया की जगह पूरी तरह से मिला हुआ हैं एक बार.
  2. Retinoic एसिड जोड़ने के बाद 48 घंटा BEGM अली मीडिया के पूरक: PneumaCult अली रखरखाव मध्यम (निम्नलिखित निर्माता के निर्देशों) तैयार: (बेसल डिब्बों के लिए आमतौर पर 8.5 मिलीलीटर एक थाली के लिए) की जरूरत माध्यम की मात्रा की गणना, 1 मिलीलीटर प्रति जोड़ने पूरा आधार मध्यम PneumaCult :

    10 μl PneumaCult 100x रखरखाव अनुपूरक
    2 μl (एक 2 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान के) हेपरिन
    (एक 96 μl / एमएल शेयर समाधान के) 5 μl Hydrocortisone.

  3. सभी मीडिया निकालें और basolateral ओर केवल (शिखर तरफ कोई मध्यम) को 700 μl PneumaCult अली रखरखाव मीडिया जोड़ें.
  4. अली पर 4 हफ्तों के लिए सेल संस्कृतियों को बनाए रखने:
    1. मीडिया (बुधवार और शुक्रवार को निर्धारित समय से हमारे लिए अच्छी तरह से काम करता है, सोमवार) हर दूसरे दिन बदलें.
    2. अली पर एक सप्ताह के बाद, एक सप्ताह (बुधवार) एक बार शिखर सतह rinsed है: ध्यान से महाप्राण, इनक्यूबेटर में 10 मिनट के लिए उन्हें रखने के लिए, शिखर की ओर करने के लिए 200 μl HBSS जोड़HBSS (HBSS बंद चूषण पिपेट की नोक पर 200 μl युक्तियों का उपयोग, जैविक सुरक्षा कैबिनेट में वैक्यूम जाल से जुड़ी कांच विंदुक में एक 9 का उपयोग करें).

नोट: परिवर्तन प्लेटों के बीच टिप्स, और साथ ही basolateral बनाम शिखर सतह से जब जा सुझावों बदल रहा है. अली पर के बारे में 2 सप्ताह के बाद, कोशिकाओं को अलग करने के लिए शुरू और सिलिया दिखाई देते हैं. सेल संस्कृतियों अली पर के बारे में 4 हफ्तों के बाद पूर्ण भेदभाव तक पहुँचने.

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Representative Results

एनईसीएस यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में vivo स्थिति (चित्रा 1) का प्रतिनिधित्व रोमक और गैर रोमक कोशिकाओं से बना ईसीएस के एक विषम परत में फिर से अंतर कर निम्न संवर्धित. विभेदित एनईसीएस में से कुछ (एबी / पीए, चित्रा 1 बी का उपयोग नीले रंग में धुंधला कोशिकाओं) का निर्माण बलगम हैं. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अनुकूलित है हालांकि, भेदभाव समग्र सेल आबादी (: बलगम के उत्पादन की कोशिकाओं: रोमक कोशिकाओं की यानी अलग अनुपात गैर रोमक कोशिकाओं) के वितरण के संबंध के साथ भिन्न हो सकते हैं या यहां तक कि एक अधिक स्क्वैमस उपकला उपज. इन बदलावों दाता आबादी पर निर्भर करती है और इसलिए हम पहले से धूम्रपान करने वालों में 18 से एनईसीएस का उपयोग कर दिखा दिया है, के रूप में एक अंतर्निहित रोग phenotype की आवृत्ति प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. 2 एक अलग प्रोटोकॉल और मीडिया योगों का उपयोग suboptimal फिर से विभेदित एनईसीएस के उदाहरण से पता चलता है. कोशिकाओं स्क्वैमस हैं औरआयातफलकी न ही रोमक और एक pseudostratified श्वसन उपकला (चित्रा 2) की नकल नहीं है. न तो

चित्रा 1
चित्रा 1. पुनः भेदभाव मानव परिषद संस्कृति. एनईसीएस 4% पीएफए ​​के साथ तय की और आयल में एम्बेडेड थे. संस्कृतियों (19 में वर्णित तरीकों का पालन) hematoxylin और eosin (ए) और Alcian आवधिक / ब्लू एसिड Schiff (बी) के साथ दाग रहे थे. छवियों को एक स्पष्ट संगठन, एक आयातफलकी संरचना, बलगम उत्पादक जाम कोशिकाओं के साथ ही रोमक ईसीएस के साथ एनईसीएस दिखा.

चित्रा 2
चित्रा 2. Hematoxylin और eosin suboptimal संस्कृतियों का आयल एम्बेडेड अनुभाग दाग. Suboptimal भेदभाव के साथ परिषद संस्कृतियों. कोशिकाओं स्क्वैमस दिखाई देते हैं, कोई cuboidaएल संरचना, कोई रोमक कोशिकाओं.

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Discussion

श्वसन ईसीएस एक्सोजेनस उत्तेजनाओं 20 से मानव शरीर की रक्षा, लेकिन यह भी घुलनशील मध्यस्थों या प्रत्यक्ष रिसेप्टर ligand सेल सेल बातचीत के स्राव के माध्यम से शुरू करने और सांस की प्रतिरक्षा रक्षा प्रतिक्रियाओं 1-3 विनियमित करने के लिए एक स्विचबोर्ड के रूप में कार्य करने के लिए एक शारीरिक बाधा न केवल प्रदान करते हैं. इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में ईसीएस की भूमिका का अध्ययन करने के लिए कोढ़ आबादी से ईसीएस के बीच संभावित मतभेद की जांच करने के लिए, या ईसीएस पर एक्सोजेनस तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, यह vivo स्थिति पुनरावृत्ति करने के लिए महत्वपूर्ण है. मानव एयरवेज ऐसे रोमक कोशिकाओं, जाम कोशिकाओं और बेसल कोशिकाओं के रूप में 20 अलग उपकला कोशिकाओं, सहित 40 से अधिक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के 20 होते हैं. हमारे प्रोटोकॉल एक सतही नाक परिमार्जन बायोप्सी काफी हद तक इन विवो में नाक उपकला जो नकल, परिषद संस्कृतियों उपज पुनः भेदभाव से गुजरना करने के लिए विस्तारित और संवर्धित किया जा सकता है कि एनईसीएस उपज के लिए कार्रवाई की जा सकती कैसे करें.

organotypic प्राथमिक मानव विभेदित एनईसीएस की इस में इन विट्रो मॉडल का उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करता है. यह रोग एनईसीएस (जैसे सिस्टिक फाइब्रोसिस, अस्थमा, धूम्रपान) के विशिष्ट मतभेद, एक रोग के अंतर्निहित तंत्र है, साथ ही वायु प्रदूषण (जैसे ओजोन, डीजल निकास, सिगरेट के धुएं) 18,21-23 को नियंत्रित जोखिम का अध्ययन कर देता है. इसके अलावा, टिशू कल्चर आवेषण पर हो विभेदित एनईसीएस एक नियंत्रण स्थापित करने में सेल सेल बातचीत की जांच करने की इजाजत दी, अन्य कक्षों प्रकार (जैसे वृक्ष के समान कोशिकाओं, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, या मैक्रोफेज) 10,11 के साथ सह संस्कृति के लिए उधार दे.

हम कई पहले से प्रकाशित अध्ययन 24-27 में इस्तेमाल किया गया है जो ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं, संवर्धन और एनईसीएस की फिर से फर्क वर्णन है, और नहीं. के उपयोग की तुलना में एनईसीएस का उपयोग फायदेमंद हो सकता है क्यों हम विभिन्न कारणों से देखते हैंब्रोन्कियल ईसीएस. सबसे पहले, सतही नाक परिमार्जन बायोप्सी प्राप्त करने ब्रश बायोप्सी प्राप्त करने के लिए एक ब्रोंकोस्कोपी प्रदर्शन की तुलना में महंगा है. दूसरा, पहले से मौजूद बीमारियों की एक किस्म के लिए (जैसे अस्थमा तोड़) यह प्राप्त कम airway उपकला कोशिकाओं के लिए एक शोध से संबंधित ब्रोंकोस्कोपी बाहर ले जाने के लिए अवास्तविक है. हालांकि, एक राइनो जांच के साथ अवर नाक turbinate के अवर सतह scraping की कम आक्रामक प्रक्रिया इन विषयों में किया जा सकता है. तीसरा, नाक परिमार्जन बायोप्सी कोई महत्वपूर्ण दुष्प्रभाव 28-30 बिना (बायोप्सी के बीच में आमतौर पर लगभग 4 सप्ताह) एक ही व्यक्ति पर कई बार प्रदर्शन किया जा सकता है. चौथा, एनईसीएस ऐसी वायु प्रदूषण, रोगजनकों या एलर्जी के रूप में पर्यावरण तनाव, साँस को उजागर करने की पहले की कोशिकाओं के बीच में हैं और इसलिए airway उपकला कोशिकाओं पर इन तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में मूल्यवान प्रतिनिधित्व करते हैं.

फिर से अलग की विभिन्न सेल संस्कृति प्रणालियोंentiated मानव ईसीएस (MatTek, Ashland, एमए, Lonza से Clonetics, बेसल, स्विट्जरलैंड, Epithelix सार्स से MucilAir, जिनेवा स्विट्जरलैंड से जैसे EpiAirway मॉडल) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. उन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल संस्कृतियों एक लंबे समय अवधि के लिए स्थिर रहेगा और अच्छी तरह से विशेषता है. हालांकि, वे महंगे हैं और पढ़ाई आमतौर पर अलग अलग व्यक्तियों से नमूनों की कम संख्या को सीमित कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, यह आपूर्तिकर्ता से प्रस्तुत की उपलब्धता पर निर्भर करता है जो दाता जनसंख्या को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. हौसले सतही परिमार्जन बायोप्सी के साथ एनईसीएस प्राप्त अन्वेषक (जैसे उम्र, लिंग, जाति, वजन, बॉडी मास इंडेक्स, रोग की स्थिति, दवा का उपयोग, के रूप में) विषय विशेषताओं को नियंत्रित करने और एक संभावित पालन के लिए वापस फिर से कॉल स्वयंसेवकों करने के लिए अनुमति देता है ऊपर.

सामान्य में, अली पर फिर से फर्क मानव airway के लिए सभी प्रकाशित प्रोटोकॉल (ब्रोन्कियल या नाक या तो) ईसीएस इसी तरह की प्रक्रियाओं में शामिल हैं: obtaininजी ईसीएस, टिशू कल्चर बोतल में कोशिकाओं का विस्तार, और झरझरा सेल संस्कृति के लिए उन्हें स्थानांतरित अली पर भेदभाव के लिए सम्मिलित करता है. प्रोटोकॉल मीडिया, वृद्धि कारक की खुराक, passaging की संख्या, आवेषण की कोटिंग, और अली की स्थापना से पहले एनईसीएस की सक्रियता के प्रकार में भिन्नता है. एक प्रोटोकॉल में, प्राप्त करने और पचाने के बाद, कोशिकाओं uncoated आवेषण पर सीधे वरीयता प्राप्त हैं और केवल उपयोग 13 से पहले अली पर कुछ दिनों रखा, जबकि अन्य प्रोटोकॉल कई हफ्तों अली 12,14,15 पर फिर से अंतर करने के लिए संवर्धन शामिल . कोलेजन या अन्य बाह्य मैट्रिक्स घटकों के साथ सम्मिलित करता कोटिंग के बारे में कोई निरंतरता नहीं है: कुछ प्रोटोकॉल कोटिंग की आवश्यकता है जबकि 12,15 दूसरों uncoated आवेषण 13,14 का उपयोग करें. हालांकि, संस्कृति की स्थिति, बहुत महत्व का विशेष रूप से इनक्यूबेटर सेटिंग कर रहे हैं. 5% पर समायोजित किया जाना चाहिए जो> 90% होने की जरूरत है, जो सापेक्ष आर्द्रता, और सीओ 2, हैं बहुतमहत्वपूर्ण कारकों अली सेल संस्कृति के बाहर सुखाने से बचने और मीडिया बफर करने में मदद करेगा. हमारे अनुभव साझा करने के लिए आदेश में, हम कोई 100% सफलता दर है कि यहां उल्लेख करना चाहता हूँ. कुछ परिषद के नमूने आवेषण का पालन नहीं करेंगे या confluency तक कभी नहीं होगा, जबकि कुछ नाक परिमार्जन बायोप्सी के नमूने, टिशू कल्चर प्लेट का पालन नहीं करते. इन वर्षों में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग हमारी समग्र सफलता दर लगभग 80% है. हमारा अनुभव इस तरह के धूम्रपान करने वालों के रूप में परिभाषित किया रोगग्रस्त आबादी से एनईसीएस के संवर्धन स्वस्थ गैर धूम्रपान करने वालों से एनईसीएस से ज्यादा चुनौतीपूर्ण है कि पता चलता है

प्राथमिक मानव एनईसीएस के संवर्धन के लिए हमारे प्रोटोकॉल हम वर्षों से अनुकूलित जो कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं: 1. वे ऊतक संस्कृति आवेषण पर वरीयता प्राप्त पहले एनईसीएस केवल दो बार विस्तार कर रहे हैं. 2. आवेषण uncoated इस्तेमाल कर रहे हैं. 3. टिशू कल्चर प्लेट पर वरीयता प्राप्त एक बार, NuSerum की राशि चरणबद्ध कोशिकाओं टिशू कल्चर से लिफ्ट बंद से बचने के लिए कम हैप्लेटें. 4. एनईसीएस पुनः भेदभाव पूर्ण आश्वस्त करने के लिए प्रयोगों में उनका इस्तेमाल से पहले अली पर कम से कम 25-28 दिनों के लिए रखा जाता है. संक्षेप में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अली पर संस्कृति और फिर से अंतर कर मानव एनईसीएस के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल शामिल है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों उपयोगी जानकारी के लिए लिसा Dailey धन्यवाद देना चाहूंगा.

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (ES013611 और HL095163) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, उड़ान परिचर चिकित्सा अनुसंधान संस्थान (FAMRI), और पर्यावरण संरक्षण एजेंसी (CR83346301) और ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. इस आलेख में वर्णित अनुसंधान पर्यावरण चिकित्सा, अस्थमा और उत्तरी कैरोलिना चैपल हिल के विश्वविद्यालय में फेफड़े जीवविज्ञान के लिए केंद्र के साथ सहयोग समझौता CR83346301 के माध्यम से अमेरिका पर्यावरण संरक्षण एजेंसी द्वारा वित्त पोषित में भाग गया है, यह अधीन नहीं किया गया है एजेंसी की आवश्यकता सहकर्मी और नीति की समीक्षा और इसलिए जरूरी एजेंसी के विचारों को प्रतिबिंबित नहीं करता है, और कोई आधिकारिक समर्थन inferred किया जाना चाहिए. मेंशन ओF व्यापार के नाम या वाणिज्यिक उत्पादों के उपयोग के लिए बेचान या सिफारिश का गठन नहीं है. लोरेटा मुलर एक निजी अनुदान के साथ स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

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References

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Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

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