Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

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Summary

Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

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Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

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Abstract

In-vitro-Modelle mit humanen primären Epithelzellen sind wesentlich für das Verständnis wichtigen Funktionen des respiratorischen Epithels im Rahmen von mikrobiellen Infektionen oder inhaliert Mittel. Direkte Vergleiche von Zellen von erkrankten Populationen erlauben es uns, verschiedene Phänotypen charakterisieren und sezieren die zugrunde liegenden Mechanismen der Vermittlung Veränderungen in epithelialen Zellfunktion. Kultivierung epithelialer Zellen aus dem menschlichen Tracheobronchialbereich ist gut dokumentiert, aber wird durch die Verfügbarkeit von humanem Lungengewebe oder Invasivität bei der Beschaffung der Bronchien Bürsten Biopsien Dritter. Nasen Epithelzellen durch viel weniger invasive Nasen oberflächliche Schürf Biopsien erhalten und Themen kann mehrfach ohne signifikante Nebenwirkungen biopsiert werden. Darüber hinaus ist die Nase der Einstiegspunkt für die Atemwege und damit eine der ersten Websites, um jede Art von luftgetragenen Stressor ausgesetzt werden, wie Mikroben, Schadstoffe oder Allergene.

Kurz gesagt, werden Nasenepithelzellen an menschlichen Freiwilligen erhalten auf beschichteten Gewebekulturplatten ausgebaut und dann auf Zellkultureinsätze übertragen. Beim Erreichen der Konfluenz werden Zellen weiterhin an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche (ALI) für mehrere Wochen, die mehr physiologisch relevanten Bedingungen schafft, kultiviert werden. Die ALI Kulturbedingungen verwendet definierten Medien, die zu einer differenzierten Epithelien, die morphologischen und funktionellen Eigenschaften ähnlich dem menschlichen Nasenschleimhaut, sowohl mit Flimmerepithel und Schleim produzierenden Zellen aufweist. Gewebekulturplatten mit differenzierten Nasenepithelzellen können in einer Vielzahl von Möglichkeiten, abhängig von den Forschungsfragen (Behandlung mit pharmakologischen Mitteln, Transduktion mit lentiviralen Vektoren, die Exposition gegenüber Gasen oder Infektion mit Mikroben) manipuliert und für zahlreiche verschiedene Endpunkte von analysierende zellulären und molekularen Signalwege, funktionale changes, Morphologie, usw.

In-vitro-Modelle von differenzierten humanen nasalen Epithelzellen wird Ermittlern ermöglichen, neue und wichtige Forschungsfragen mit Hilfe organotypischen experimentelle Modelle, die weitgehend imitieren die Nasenschleimhaut in vivo zu adressieren.

Introduction

Ziel der Technik

Epithelzellen (EC) in den Atemwegen gehören zu den ersten Websites, um direkt mit inhalativen belastenden Umweltfaktoren, wie z. B. Krankheitserreger, Allergene oder Luftschadstoffe ausgesetzt werden. ECs sind mehr als eine strukturelle Barriere: Sie wirken als eine Telefonzentrale über die Freisetzung von löslichen Mediatoren 6.4 und der Expression von Liganden / Rezeptoren auf ihrer surfac 7-9 initiieren und regulieren die Immunantwort Atem 1-3. Während immortalisierten Zelllinien können als Modelle verwendet werden, um Atmungs ECs in vitro zu untersuchen, können sie einfach in heterogenen Zellpopulationen polarisiert Flimmerepithel und Schleim produzierenden Zellen, ähnlich dem, was in vivo beobachtet zusammen unterscheiden. Wichtige Eigenschaften des respiratorischen Epithels in vivo beobachtet rekapitulieren können primäre Atemwegs ECs verwendet werden. Daher ist aus menschlichen Freiwilligen erhalten unser Ziel war es, unsere Verfahren, das Nasen ECs (NEC) optimieren. Die NEC sind in vitro expandiert und kultiviert, was eine Zellkulturmodell von differenzierten NEC, die viele der Funktionen der Nasenschleimhaut in vivo gesehen nachahmt.

Gründe

Die Verwendung von in vitro-Modelle mit humanen Primär ECs imitiert in vivo-Situation - wie in dieser Studie beschrieben - bietet einzigartige Möglichkeiten, um krankheitsspezifische Unterschiede des ECs, physiologische Parameter mit dem Atemwegsepithel verbunden sind, oder die Wechselwirkungen zwischen ECs und anderen Zelltypen zu untersuchen, wie dendritische Zelle 10, natürliche Killerzellen 11 oder Makrophagen. Mehrere bestehende Verfahren nutzen bronchiale ECs, die invasiv über Bürstenbiopsien bei Bronchoskopien von ansonsten entsorgt Lungengewebe von 12 bis 17 erhalten werden können, oder. Außerdem kommerziellen Quellen zu ausdifferenzierten menschlichen Atemwege epithelialen Zellkulturen zu erhalten, existieren (EpiAirway Modell aus MatTek, Ashland, MA, CloneticsLonza, Basel, Schweiz, MucilAir Epithelix von Sars, Genf Schweiz), wo Ermittler können von verschiedenen Spendern zu wählen. Jedoch aufgrund der begrenzten Pool von kommerziell erhältlichen Epithelzellen, begrenzt oder vorgeschriebenen Menge von Parametern, die Kosten, die mit kommerziell erhalten primären menschlichen Atemwege ECs zugeordnet ist und der begrenzte Zugang zu verworfen Lungengewebe oder frisch erhaltenen humanen bronchialen Biopsiegewebe, verbieten viele Forscher aus der Durchführung von Studien in vollständig differenzierten menschlichen Atemwege ECs. Daher wollten wir eine Technik, die 1) nutzen wird nicht-invasiv gewonnen menschlichen NEC, 2) eine Protokoll ergibt Kulturen der differenzierten humanen Epithel der Atemwege, und 3) reproduzierbar sein Labor in den meisten Einstellungen mit einer bestehenden Infrastruktur Gewebekultur zu entwickeln.

Vorteile gegenüber bestehenden Techniken / Modelle

Beschaffung frischen NEC, verglichen mit der kleinen Atemwege der Bronchien oder ECs, ist viel weniger invasive, Einzels kann mehrfach ohne signifikante Nebenwirkungen biopsiert werden, und oberflächliche Schürfnasen Biopsien in erkrankten Populationen, die sonst nicht für die forschungsbezogenen qualifizieren Bronchoskopien durchgeführt werden. Nichtinvasive oberflächliche Schürf Biopsien zu NEC erhalten damit die Ermittler auf Spender Spezifikation gemäß dem Forschungsziel erreicht werden, um von vornherein festgelegt, einschließlich Alter, Geschlecht, Krankheitsstatus, etc.. So bei der Gestaltung Studien Ermittler nicht durch klinisch verfügbaren Gewebe / epithelialen Probe beschränkt, kaufen teure differenzierten Zellkulturmodellen von kommerziellen Anbietern oder Design invasive Studien Bronchoskopie. Darüber hinaus ist die Leichtigkeit zu erhalten, NEC erhöht die Fähigkeit, Experimente in Zellen von verschiedenen Spendern durchzuführen, die statistische Validierung der beobachteten Befunde erhöht. Schließlich ist die Nase eine der ersten Websites auf jede Art von luftgetragenen Stressoren ausgesetzt werden. So erzeugen in organotypischenKultursystemen imitiert die Nasenschleimhaut sind nützlich für das Studium Inhalation von Viruspartikeln, Schadstoffe, Allergen, oder Gase, die leicht unter Verwendung dieser Zellkultur-System erreicht werden können.

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Protocol

1. Bereiten Plastic Ware: Mantel-Kennzeichen

  1. In 500 ul PureCol (1:100 mit sterilem Wasser verdünnt) in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte.
  2. Bei 37 ° C im Brutschrank für 30 Minuten, entfernen Sie die PureCol und spülen Sie mit HBSS rechts, bevor die Zellen zu der Platte gegeben (siehe Schritt 3.1 unten).

2. Beziehen und Vorbehandeln Biopsie der Menschen NEC

  1. Nasen kratzen Biopsie
    1. Erhalten oberflächlichen ECs Auskleidung der Nasenmuscheln unter direkter Sicht durch eine 9 mm wiederverwendbare Polypropylen Nasenspekulum (Modell 22009) auf einem Betriebs Otoskop mit Speculum (Modell 21700). Dieses Gerät bietet eine optimale Visualisierung der Nasenmuscheln und Flexibilität der Bewegung.
    2. Führen Sie die Biopsien mit dem Thema aufrecht in einem Stuhl mit gerader Lehne mit Kopf geneigt leicht zurück oder in Rückenlage auf einem Untersuchungstisch liegend sitzt.
    3. Legen Sie die Otoskop-Spekulum in das Nasenloch und die untere turbinate visualisiert mit Beleuchtung.
    4. Legen Sie eine sterile thermoplastische Löffel durch den Spiegel mit der Spitze distal der Rückseite der Nasenmuschel verlängert.
    5. Mit leichtem Druck an der unteren Fläche des Nasenmuschel wird der Kürette in der Schleimhautoberfläche 5x gezogen und zurückgezogen wird. Eine erfolgreiche Abfrage von Schleimhautzellen durch Kapillarwirkung gehalten werden in der Tasse der Kürette verständlich sein.
  2. Zeigen Probe in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 8 ml RPMI 1640, Transport auf Eis.
  3. Verwenden einer Pinzette, um die Sonde abzurufen, zu entfernen Gewebe von Nashorn-Sonde mit einer P-1000 Pipette, entsorgen Sonde
  4. Zentrifuge pelletiert (4 ° C, 400 xg, 5 min), Überstand absaugen (Achtung: Achten Sie darauf, um das Pellet absaugen).
  5. Resuspendieren des Pellets in 1 ml BEGM mit 10 ul DNase 1 100x.
  6. Inkubieren bei Raumtemperatur für 20 min.
  7. Zentrifuge (4 ° C, 400 × g, 5 min), nicht ansaugen noch den Überstand!

3. Seed die Zellen auf Kunststoff (Tag 0)

  1. Entfernen Sie die PureCol von der Platte und gründlich mit HBSS (siehe auch Schritt 1.2).
  2. Fügen Sie ein Mindestvolumen von BEGM + + Medien (80-100 ul, bis ein Meniskus von Medien im Zentrum der gut erscheint) in 1-4 Brunnen (je nach Größe Biopsie) der beschichteten Platte.
  3. Verwenden Sie ein P-1000 Pipette vorsichtig die Pellet der Biopsiegewebe aus der Tube, ohne Absaugen zu viel Medien.
  4. Übertragen Sie die Pellets in der Mitte der Brunnen, zusammen halten die Biopsie als Cluster von Zellen, und brechen nicht bis zu einer Einzelzellsuspension zu machen. Eine gute Biopsie Ausbeuten von bis zu vier Brunnen, die ausgesät werden kann. Sollten die Platten in Gewebekultur-Inkubator (37 ° C, 5% CO 2,> 90% relative Luftfeuchtigkeit).
  5. Nach zwei Stunden überprüfen, um sicherzustellen, dass genügend Medien (ohne den Meniskus zu stören).
  6. 1. Tag, 24 Stunden nach der Aussaat: sammeln Sie alle nicht-adhärenten Zellen aller Wells (Schwenkscheibe und sammeln Medien mit Zellen in einem P-1000, collect alle Vertiefungen in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen).
  7. Zentrifuge (4 ° C, 400 × g, 5 min).
  8. Während der Zentrifugation Zellsuspension: in etwa 250 ul BEGM + + und 250 ul BEGM + Mediengemisch in die Zellen am Tag 0 beimpft.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.5 für die nicht-adhärenten Zellen.
  10. Tag 2-5: Änderung Medien der Zellen täglich, fügen Sie 500 ul Medien in jede Vertiefung, reduzieren die Menge der BEGM + + Medien schrittweise (Tag 2 nach der Aussaat: 125 ul BEGM + + plus 375 ul BEGM +, day3 nach der Aussaat und die folgenden Tage: 73 ul BEGM + + plus 427 ul BEGM +).

4. Erweiterung der Zellen in den Flaschen

  1. Überwachung der Zellen täglich, sobald sie 80-90% Konfluenz (in der Regel 5-7 Tage nach der Biopsie, wenn sie länger dauern, sie werden nicht erfolgreich zu wachsen) Lift-Zellen wie folgt erreicht haben:, fügen 500 ul von 0,25% Trypsin sorgfältig absaugen Medien pro Well, halten sie bei 37 ° C, bis die Zellen gelöst werden (es dauert in der Regel 2-3 min).
  2. Bereiten Sie die Notwendigkeited Volumen von Sojabohnen Trypsin Inhibitor (SBTI) (750 ul pro 1 ml Trypsin) in einem 15-ml-Tube.
  3. Verdrängen Zellen durch mehrmaliges Auf-und Abpipettieren der Trypsin-Lösung, die Übertragung abgelösten Zellen in der 15 ml konischen Röhrchen mit SBTI.
  4. Spülen Sie alle Brunnen mit insgesamt 1 ml HBSS, fügen HBSS auf das Rohr mit den Zellen.
  5. Zentrifuge pelletiert (4 ° C, 400 xg, 5 min), saugen Sie den Medien, Resuspendieren in 1 ml BEGM + Medien und das Röhrchen vortexen.
  6. Erweitern Zellen in einer T25-oder T75-Flasche je nach Pelletgröße (dies ist p1, etwa zwei zusammenfließenden Brunnen in eine T75-Flasche gehen, auch ist eine konfluente genug für eine T25, in der Regel 2 konfluent Brunnen ergeben ein T75).
    1. In BEGM + zu den Kolben (je 5 ml für eine T75, 3 ml für eine T25).
    2. In der Zellsuspension in die Kolben. Übertragen Sie die Flaschen in einen Brutschrank.
  7. 24 Stunden nach der Aussaat Kolben: add zusätzliche BEGM + Medien in den Kolben (3 ml zu einem T25, 10 ml zu einem T75).

5. Samen der Zellen auf Gewebekultureinsätze

  1. Entfernen Sie die Medien aus dem Kolben und fügen Trypsin (3 ml für T25, 4 ml für T75-Kolben).
  2. Bei 37 ° C, bis die Zellen gelöst werden (ca. 2-3 min).
  3. Bereiten SBTI (750 ul pro 1 ml Trypsin> 2,25 ml für T25, T75 für 3 ml) in einem 15-ml-Tube.
  4. Verdrängen Zellen durch Abkleben der Kolben und Auf-und Abpipettieren und Transfer zum konischen Rohr mit dem SBTI.
  5. Den Kolben mit HBSS (1 ml für T25, 2 ml für T75) Spülen, fügen Sie die HBSS an den 15-ml-Tube.
  6. Zentrifugepelletiert (4 ° C, 400 xg, 5 min), Überstand vorsichtig entfernen.
  7. Bereiten Sie die Platten: entscheiden, wie viele Platten gehen ausgesät zu sein, kennzeichnen Sie die Platten mit Beispielcode und Anzahl, Durchgang Nummer (dh p2) und Datum. In 700 ul BEGM + Medien zur basalen Kammer.
  8. Zellpellet in 1 ml BEGM ALI Medien durch Vortexen die Röhre.
  9. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer (a T25 in der Regel produziert etwa 4 Millionen Zellen, ein T75 kann bis zu 20 Millionen Zellen in Abhängigkeit von der Insel, die Nutzung von 1-2 Millionen Zellen für eine 12-Well-Platte) und verdünnen die Zellsuspension mit BEGM ALI Medien auf das Gesamtvolumen für die Höhe der Platten, die (1,2 x 10 6 Zellen in 2,5 ml Medium pro Platte) ausgesät werden sollte, benötigt. (Hinweis: Wenn ein Teil der Zellen eingefroren werden soll, kennzeichnen das Rohr und Zellen zu entfernen hier: wir einfrieren üblicherweise 2 × 10 6 Zellen in 2 ml Gefriermedium)
  10. In 200 ul Zellsuspension auf der apikalen Seite jeder unbeschichteten Corning 12well Zelleinfügen (> das wird über 80,000-150,000 Zellen / Einsatz sein, 12 mm Transwell mit 0,4 um Poren Polyester (Polyethylenterephthalat (PET))-Membran Einsatz); in Gewebekultur-Inkubator übertragen.
  11. Nach 24 Stunden, ändern Sie die apikal Medien (200 ul Expansionsmedium).
  12. Die Aufrechterhaltung der Zellkulturen: Ändern Sie die Medien (BEGM ALI Medien; 700 ul und 200 ul basolateralen apikal) jeden zweiten Tag. Einsätze müssen gepflegt getaucht werden, bis die Zellen sind total konfluent (keine Löcher in Monolayer sichtbar sind). Je nach Zellzahl dieser nimmt normalerweise zwischen 2-6 Tage, wenn es länger dauert, die Zellen wahrscheinlich nicht lebensfähig sein.

6. Stellen Air flüssig-Grenzfläche Sobald die Zellen vollständig Confluent (wenn die Zellen auf die Transwells sind komplett Confluent)

  1. Sobald die Zellen konfluent sind völlig ersetzen Sie beide apikalen und basolateralen Medien mit BEGM ALI Medien mit 500 nM Retinsäure für 48 Stunden ergänzt.
  2. 48 Stunden nach der Zugabe der Retinsäure ergänzt BEGM ALI Medien: Bereiten PneumaCult-ALI Erhaltungsmedium (nach Herstellerangaben): Berechnen Sie das Volumen des Mediums benötigt (für eine Platte in der Regel 8,5 ml für Grundfächer), fügen Sie pro 1 ml PneumaCult komplette Basismedium :

    10 ul PneumaCult 100x Wartung Supplement
    2 ul Heparin (einer 2 mg / ml Stammlösung)
    5 ul Hydrocortison (einer 96 ul / ml Stammlösung).

  3. Entfernen Sie alle Medien, und fügen Sie 700 ul PneumaCult-ALI Wartung Medien auf der basolateralen Seite (keine Medium auf der apikalen Seite).
  4. Pflegen Sie die Zellkulturen für 4 Wochen in der ALI:
    1. Ändern Sie den Medien jeden zweiten Tag (Montag, Mittwoch und Freitag Zeitplan funktioniert gut für uns).
    2. Nach einer Woche bei ALI, einmal in der Woche (mittwochs) der apikalen Oberfläche gespült wird: in 200 ul HBSS auf der apikalen Seite, halten Sie sie für 10 Minuten in den Inkubator, sorgfältig absaugenHBSS (mit einem 9 in Glaspipette in der Biologischen Sicherheitsschrank zur Vakuumfalle angebracht, verwenden Sie 200 ul-Tipps auf der Spitze der Pipette zur Absaugung der HBSS).

Hinweis: Tipps Veränderung zwischen den Platten, sowie die Änderung die Tipps, wenn man vom Scheitelfläche gegenüber basolateralen. Nach ca. 2 Wochen an der ALI, Zellen beginnen zu differenzieren und Zilien angezeigt. Zellkulturen zu erreichen volle Differenzierung nach ca. 4 Wochen an der ALI.

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Representative Results

NEC kultiviert nach dem hier beschriebenen Protokoll wieder zu differenzieren in eine heterogene Schicht der ECs von Flimmer-und Nicht-Geißelzellen, die die in vivo Situation (Abbildung 1) besteht. Einige der differenzierten NEC sind Schleim produziert (Zellen Färbung in blau mit AB / PAS, Abbildung 1B). Auch wenn die hier vorgestellten Protokoll optimiert wird, kann die Differenzierung in Bezug auf die Verteilung der Gesamt-Zellpopulationen (: Schleim-produzierenden Zellen: dh unterschiedliche Verhältnisse von Flimmerzellen nicht Flimmerzellen) variieren oder sogar ergeben ein Plattenepithel. Diese Schwankungen können sich auf der Spenderpopulation abhängig und stellen daher Rekapitulation einer Grunderkrankung Phänotyp, wie wir zuvor mit NEC von Rauchern 18 demonstriert. Abbildung 2 zeigt Beispiele für suboptimal Wieder differenziert NEC mit einem anderen Protokoll-und Medienformulierungen. Die Zellen sind Plattenepithelkarzinome undweder quader noch Flimmerepithel und keine mehrreihigen respiratorischen Epithels (Fig. 2) zu imitieren.

Figur 1
Fig. 1 ist. Wieder differenzierten menschlichen NEC Kultur. NEC wurden mit 4% PFA fixiert und in Paraffin eingebettet. Kulturen wurden mit Hämatoxylin und Eosin (A) und Alcianblau / Periodsäure-Schiff (B) gefärbt (im folgenden 19 beschriebenen Verfahren). Die Bilder zeigen NEC mit einer klaren Organisation, eine quaderförmige Struktur, Schleim produzierenden Becherzellen sowie ciliated ECs.

Figur 2
2. Hämatoxylin und Eosin gefärbt und in Paraffin eingebetteten Abschnitt suboptimal Kulturen. NEC Kulturen mit suboptimalen Differenzierung. Plattenepithelkarzinom-Zellen erscheinen, keine cuboidal Struktur, keine Geißelzellen.

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Discussion

Atem ECs bieten nicht nur eine physische Barriere, um den menschlichen Körper von exogener Stimuli 20 zu schützen, sondern auch als Telefonzentrale über Sekretion von löslichen Mediatoren oder direkte Rezeptor-Ligand-Zell-Zell-Interaktionen zu initiieren und regulieren Immunabwehrreaktionen der Atemwege 3.1 handeln. Um weiter zu untersuchen, die Rolle von ECs in der Immunantwort, um mögliche Unterschiede zwischen ECs aus erkrankten Populationen zu untersuchen, oder die Auswirkungen exogener Stressoren auf ECs untersuchen, ist es wichtig, die in vivo-Situation zu rekapitulieren. Die menschlichen Atemwege enthalten mehr als 40 verschiedenen Zelltypen, einschließlich 20 verschiedenen epithelialen Zellen, wie Geißelzellen, Becherzellen und Basalzellen 20. Unser Protokoll beschreibt, wie eine oberflächliche Schürfnasen Biopsie kann verarbeitet werden, um NEC, die erweitert werden können und kultiviert, um Re-Differenzierung zu unterziehen, was NEC Kulturen, die weitgehend imitieren die Nasenschleimhaut in vivo ergeben.

Die Verwendung dieser in vitro-Modell der organotypischen primären humanen differenzierten NEC bietet einzigartige Möglichkeiten für verschiedene Anwendungen. Es erlaubt das Studium krankheitsspezifische Unterschiede NEC (zB Mukoviszidose, Asthma, Rauchen), zugrunde liegenden Mechanismen einer Krankheit, sowie kontrollierte Exposition gegenüber Luftschadstoffen (zB Ozon, Dieselabgase, Zigarettenrauch) 18,21-23. Zusätzlich differenziert NEC auf Gewebekultur-Einsätze eignen sich gewachsen Kokultur mit anderen Zelltypen (z. B. dendritische Zellen, natürliche Killerzellen oder Makrophagen) 10,11, was zu Zell-Zell-Wechselwirkungen in einer kontrollierten Umgebung zu untersuchen.

Wir beschreiben die Kultivierung und re-differen NEC und nicht bronchialen Epithelzellen, die in vielen bisher veröffentlichten Studien 24-27 verwendet wurden. Wir sehen verschiedene Gründe, warum die Verwendung von NEC kann vorteilhaft sein im Vergleich zu der Verwendung vonbronchiale ECs. Zunächst erhalten oberflächliche Schürfnasen Biopsien ist weniger teuer als der Durchführung einer Bronchoskopie zu Pinsel Biopsien erhalten. Zweitens, für eine Vielzahl von bereits bestehenden Erkrankungen (z. B. trennen Asthmatiker), ist es unrealistisch, die Durchführung eines forschungsbezogenen Bronchoskopie zu erhalten unteren Atemwege Epithelzellen. Jedoch kann die weniger invasive Verfahren des Abkratzen der unteren Fläche der unteren Nasenmuschel mit Rhino-Sonde in diesen Fächern durchgeführt werden. Drittens Nasen Kratzen Biopsien können von den gleichen Personen mehrmals (in der Regel ca. 4 Wochen zwischen Biopsien) ohne nennenswerte Nebenwirkungen 28-30 durchgeführt werden. Viertens sind NEC unter den ersten Zellen zu Umweltstressfaktoren, wie Luftschadstoffe, Pathogenen oder inhalativen Allergenen ausgesetzt werden und daher wertvolle repräsentieren in-vitro-Modellen, um die Auswirkungen dieser Belastungen auf Epithelzellen der Luftwege zu untersuchen.

Verschiedene Zellkultursysteme von Wieder abweichenzierten Menschen ECs sind im Handel erhältlich (zB EpiAirway Modell aus MatTek, Ashland, MA, Clonetics von Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir Epithelix von Sars, Genf Schweiz). Diese kommerziell erhältlichen Zellkulturen stabil für einen langen Zeitraum und sind gut charakterisiert. Sie sind jedoch teuer, und die Studien sind in der Regel auf eine geringe Anzahl von Proben von unterschiedlichen Individuen beschränkt. Zusätzlich ist es schwierig, die Spenderpopulation, die auf die Verfügbarkeit des Lieferanten vorge hängt steuern. Frisch Erhalt NEC mit oberflächlichen Schürf Biopsien kann der Ermittler unterliegen Merkmale (wie Alter, Geschlecht, Rasse, Gewicht, Body-Mass-Index, Krankheitsstatus, den Gebrauch von Medikamenten, etc.) zu kontrollieren und erneut Anruf Freiwilligen zurück für eine mögliche Folge auf.

Generell sind alle veröffentlichten Protokollen zur Wieder Differenzierung menschlichen Atemwege (Bronchien oder Nasen entweder) ECs an der ALI sind ähnliche Verfahren: obtaining ECs, Expansion der Zellen in Gewebekulturflaschen, und ihre Übertragung auf poröse Zellkultur-Einsätze für die Unterscheidung auf der ALI. Die Protokolle unterscheiden sich in der Art von Medien, die Wachstumsfaktor ergänzt, der Anzahl von Passagieren, die Beschichtung der Einsätze und der Aktivierung der NEC vor dem Herstellen der ALI. Während in einem Protokoll, nach dem Erhalt und Verdauen sind die Zellen ausgesät direkt auf unbeschichtete Einsätze und nur ein paar Tage gehalten an der ALI vor Gebrauch 13, andere Protokolle umfassen Kultivierung für mehrere Wochen wieder zu differenzieren in der ALI 12,14,15 . Es gibt keine Konsistenz über die Beschichtung der Einsätze mit Kollagen oder anderen extrazellulären Matrixkomponenten: Während einige Protokolle erfordern Beschichtungs 12,15 andere verwenden unbeschichteten Einsätze 13,14. Allerdings sind von großer Bedeutung, Kulturbedingungen, vor allem die Inkubator-Einstellungen. Die relative Feuchtigkeit, die zu> 90% sein muss, und das CO 2, das bei 5% eingestellt werden sollte, sind sehrwichtige Faktoren zu vermeiden Austrocknen der ALI Zellkultur und bei der Pufferung der Medien. Um unsere Erfahrungen zu teilen, möchten wir hier erwähnen, dass es keine 100% Erfolgsquote. Einige Nasen Kratzen Biopsieproben nicht von dem Gewebekulturplatte zu haften, während einige NEC Proben nicht an den Einsätzen anhaften oder nie Konfluenz erreichen. Im Laufe der Jahre ist unser Erfolgsquote mit dem hier beschriebenen Protokoll ca. 80%. Unsere Erfahrung zeigt, dass die Kultivierung von NEC aus definierten kranken Bevölkerungen, wie Raucher, ist schwieriger als von NEC gesunde Nichtraucher

Unser Protokoll für die Kultivierung von primären humanen NEC enthält mehrere wichtige Schritte, die wir über die Jahre optimiert: 1. Die NEC sind nur zweimal erweitert, bevor sie auf den Gewebekultureinsätze ausgesät werden. 2. Die Einsätze sind unbeschichtet. 3. Einmal auf Gewebekulturplatten ausgesät, wird die Menge des NuSerum schrittweise reduziert, um zu vermeiden, daß die Zellen Abheben aus der GewebekulturPlatten. 4. Die NEC sind an der ALI, bevor Sie sie in Experimenten, um sicherzustellen, komplettes Re-Differenzierung gehalten mindestens 25-28 Tage. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Protokoll enthält ein optimiertes Protokoll zu Kultur und neu unterscheiden menschlichen NEC an der ALI.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Lisa Dailey für die hilfreichen Inputs danken.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus den National Institutes of Health (ES013611 und HL095163) unterstützt, die Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) und der Environmental Protection Agency (CR83346301) und erklärt, keinen Interessenkonflikt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Obwohl die in diesem Artikel beschriebenen Forschung wurde zum Teil von der US-Umweltschutzbehörde durch Kooperationsvertrag CR83346301 mit dem Zentrum für Umweltmedizin, Asthma und Lungenbiologie an der University of North Carolina-Chapel Hill finanziert wurde, hat er nicht die ausgesetzt worden Agentur erforderlich Peer und Überprüfung der Politik und daher nicht unbedingt die Meinung der Agentur widerspiegeln, und keine offizielle Bestätigung rein zufällig. Erwähnen of Handelsnamen oder Handelsprodukten stellt keine Billigung oder Empfehlung für den Einsatz. Loretta Müller wird durch den Schweizerischen Nationalfonds mit einem persönlichen Zuschuss unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

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