Dyrkning af human Nasal epithelialceller på Air Liquid grænseflade

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nasale epitelceller, opnået gennem overfladisk skrabe biopsi af frivillige, der er udvidet og overført til vævsdyrkningssystemer skær. Efter at have nået konfluens, dyrkes celler på luft væske-grænsefladen, hvilket gav kulturer af cilierede og ikke-cilierede celler. Differentierede nasale epitel cellekulturer give levedygtige eksperimentelle modeller til at studere det respiratoriske slimhinde.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

In vitro modeller med humane primære epitelceller er afgørende i forståelsen nøglefunktioner i åndedrætsorganerne epitel i forbindelse med mikrobielle infektioner eller inhalerede agenter. Direkte sammenligninger af celler opnået fra syge befolkninger giver os mulighed for at karakterisere forskellige fænotyper og dissekere de underliggende mekanismer medierende ændringer i epitelcelle funktion. Dyrkning epitelceller fra den menneskelige tracheobronchial region er veldokumenteret, men er begrænset af tilgængeligheden af ​​menneskelige lungevæv eller invasiv forbundet med at opnå de bronchiale børster biopsier. Nasal epitelceller opnås gennem langt mindre invasive overfladiske nasal skrab biopsier og fagene kan biopsi flere gange med ingen væsentlige bivirkninger. Derudover næsen er indgangen til luftvejene og derfor en af ​​de første steder at blive udsat for nogen form for luft-bårne stressfaktor, såsom mikrobielle midler, forurenende stoffer eller allergener.

Kort fortalt nasale epitelceller opnået fra humane frivillige udvidet belagte vævskulturplader, og derefter overført til cellekultur skær. Efter at have nået konfluens, fortsætter cellerne med at blive dyrket ved luft-væske-grænsefladen (ALI), i flere uger, hvilket skaber mere fysiologisk relevante betingelser. Den ALI kultur tilstand bruger definerede medier, der fører til en differentieret epithel, som udviser morfologiske og funktionelle egenskaber svarende til den menneskelige næseepitelet, med både cilierede og slim producerende celler. Vævskultur skær med differentierede nasale epitelceller kan manipuleres i en række forskellige måder, afhængigt af de forskningsspørgsmål (behandling med farmakologiske midler, transduktion med lentivirusvektorer, udsættelse for gasser eller infektion med mikrobielle midler) og analyseret for mange forskellige endpoints, der spænder fra cellulære og molekylære veje, funktionel lmanges, morfologi, etc.

In vitro modeller for differentierede humane nasale epitelceller vil sætte efterforskerne til at løse nye og vigtige forskningsresultater spørgsmål ved hjælp organotypiske eksperimentelle modeller, der i vid udstrækning efterligne næseepitelet in vivo.

Introduction

Mål af teknikken

Epitelceller (ECS) i luftvejene er blandt de første steder, der skal direkte udsat for inhalerede miljømæssige stressfaktorer, såsom patogener, allergener eller luftforurenende stoffer. ECS mere end en strukturel barriere: De fungerer som et omstillingsbord til at initiere og regulere immunrespons respiratoriske 1-3 via frigivelse af opløselige mediatorer 4-6 og ekspression af ligander / receptorer på deres overflad 7-9. Mens immortaliserede cellelinjer kan anvendes som modeller til at studere respiratorisk EC'er in vitro, de undlader at differentiere i heterogene cellepopulationer sammensat af polariseret cilierede og slim-producerende celler, svarende til hvad der observeres in vivo. Sammenfattende vigtige egenskaber i luftvejene epitel observeret in vivo kan de primære luftvejs EC'er anvendes. Derfor er vores mål var at optimere vores metode udnytter nasal ECs (NEC) opnået fra frivillige. De nationale Europass-centre udvides og dyrket in vitro, hvilket giver en cellekultur model for differentierede nationale emissionslofter som efterligner mange af funktionerne i næseepitelet set in vivo.

Grundlag

Brugen af in vitro-modeller med humane primære ECs efterligner in vivo-situationen - som beskrevet i denne undersøgelse - giver enestående muligheder for at studere sygdomsspecifikke forskelle hos ECS, fysiologiske parametre forbundet med luftvejsepitel, eller interaktionerne mellem ECS og andre celletyper, såsom dendritiske celle 10, naturlige dræberceller 11 eller makrofager. Adskillige eksisterende metoder udnytter bronchiale ECS der kan opnås invasivt via børste biopsier under bronchoscopies, eller fra andet kasseret lungevæv 12-17. Derudover findes der kommercielle kilder for at opnå fuldt differentierede humane luftveje epitelcellekulturer (EpiAirway model fra Mattek, Ashland, MA, Cloneticsfra Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir fra Epithelix Sars, Genève Schweiz), hvor efterforskere kan vælge mellem forskellige donorer. Men på grund af den begrænsede pulje af kommercielt tilgængelige epitelceller begrænsede eller ordineret sæt parametre, omkostningerne forbundet med kommercielt opnå primære humane luftveje ECS og den begrænsede adgang til kasserede lungevæv eller frisk opnåede human bronkial biopsi væv, forbyde mange efterforskere fra at foretage undersøgelser i fuldt differentierede humane luftveje ECS. Derfor er vi i gang med at udvikle en teknik, der vil 1) anvende non-invasivt opnåede menneskelige NEC, 2) give en protokol giver kulturer differentierede humane luftvejsepitel, og 3) kunne reproduceres i de fleste lab indstillinger med en eksisterende vævskultur infrastruktur.

Fordele i forhold til eksisterende teknikker / modeller

Indhentning friske nationale Europass-centre, i forhold til bronkial eller små luftveje ECS er langt mindre invasive, individuels kan biopsi flere gange med ingen væsentlige bivirkninger, og overfladiske nasale skrab biopsier kan udføres i syge befolkningsgrupper, som ellers ikke ville kvalificere sig til forskningsrelaterede bronchoscopies. Noninvasive overfladiske skrab biopsier for at opnå NEC'erne tillade investigator at indstille donor specifikation a priori, herunder alder, køn, status sygdom, osv. i overensstemmelse med det mål, forskning, der skal udføres. Således, når designe forskningsundersøgelser efterforskere er ikke begrænset af klinisk tilgængelige væv / epiteliale prøve, købe dyre differentierede cellekulturmodeller fra kommercielle leverandører eller design invasive bronkoskopi studier. Desuden lethed at opnå NEC'erne øger evnen til at udføre eksperimenter i celler fra forskellige donorer, som øger statistisk validering af observerede resultater. Endelig næsen er et af de første steder at blive udsat for nogen form for luftbårne stressfaktorer. Således genererer organotypisk ivitro dyrkningssystemer efterligner næseepitelet er anvendelige til at studere inhalation af viruspartikler, forurenende stoffer, allergikere, eller gasser, som let kan opnås ved hjælp af denne cellekultursystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Forbered Plastic Ware: Frakke Plate

  1. Tilsæt 500 pi PureCol (1:100 fortyndet med sterilt vand) til hver brønd i en plade med 12 brønde.
  2. Der inkuberes ved 37 ° C i en inkubator i 30 minutter, fjern PureCol og skylles med HBSS lige før tilsættes cellerne til pladen (se trin 3.1 nedenfor).

2. Indhentning og forbehandle biopsi for Human NEC'erne

  1. Nasal skrabe biopsi
    1. Opnå overfladiske ECs foring nasale muslingebenene under direkte udsyn gennem en 9 mm genbruges nasal polypropylen spekulum (model 22009) på et operationsbord otoskop med speculum (Model 21700). Denne enhed giver optimal visualisering af den nasale muslingebenene og fleksibilitet af bevægelse.
    2. Udfør biopsier med emnet siddende oprejst i en straight-backed stol med hoved vippes lidt tilbage eller liggende i rygleje på en undersøgelse bordet.
    3. Sæt otoskop spekulum i næseboret og ringere TurbiNate visualiseret med belysning.
    4. Sæt en steril termoplastisk curette gennem spekulum med spidsen udvides distalt til bagsiden af ​​turbinat.
    5. Ved hjælp af et let tryk på den nedre overflade af turbinat er curette trukket hen over slimhindeoverfladen 5x og tilbagetrukket. En vellykket hentning af slimhindeceller indehaves af kapillarvirkning vil være tydelig i kop curette.
  2. Anbring prøven i en 15 ml konisk rør med 8 ml RPMI 1640, transport på is.
  3. Brug pincet til at hente sonden, fordrive væv fra næsehorn sonde med en P-1000 pipette kassere sonde
  4. Centrifuge at bundfælde (4 ° C, 400 xg 5 min), aspirat supernatant (opmærksomhed: Pas på ikke at aspirere pellet).
  5. Pellet resuspenderes i 1 ml BEGM med 10 ul af 100x DNase 1.
  6. Inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
  7. Centrifuge (4 ° C, 400 xg 5 min), må du IKKE aspirere supernatanten!

3. SEed cellerne på Plastic (dag 0)

  1. Fjern PureCol fra pladen og skylles med HBSS (se også trin 1.2).
  2. Tilføj en mindste mængde BEGM + + medier (80-100 pi, indtil en menisk medier vises i midten af ​​brønden) i 1-4 brønde (afhængigt biopsi størrelse) af den overtrukne plade.
  3. Brug en P-1000 pipette til forsigtigt at fjerne pillen af ​​biopsi væv fra røret, uden sugning for meget medier.
  4. Overfør pelleten i midten af ​​brøndene holde biopsi sammen som en klynge af celler, og ikke bryder op for at gøre en enkelt cellesuspension. En god biopsi udbytter op til 4 brønde, der kan seedet. Sæt pladen i vævskultur inkubator (37 ° C, 5% CO 2,> 90% relativ fugtighed).
  5. Check efter to timer for at sikre, at der er tilstrækkelig medier (uden at forstyrre menisken).
  6. Day1, 24 timers post-seeding: indsamle alle ikke-klæbende celler i alle brønde (vippe plade og indsamle medier med celler i en P-1000, collect alle brønde i et 1,5 ml centrifugerør).
  7. Centrifuge (4 ° C, 400 x g, 5 min).
  8. Mens centrifugering cellesuspension: tilføje omkring 250 ul BEGM + + og 250 pi BEGM + medier blanding til cellerne podet på dag 0.
  9. Gentag trin 3,1-3,5 for de ikke-adhærente celler.
  10. Dag 2-5: skift medier af cellerne dagligt, tilsæt 500 pi medier til hver brønd, reducere mængden af ​​BEGM + + medier trinvis (dag 2 efter såning: 125 ul BEGM + + plus 375 ul BEGM +, dag3 efter såning og de følgende dage: 73 gl BEGM + + plus 427 ul BEGM +).

4.. Udvidelse af cellerne i Kolber

  1. Monitor celler dagligt, når de har nået 80-90% sammenflydning (normalt 5-7 dage efter biopsi, hvis de tager længere de ikke vil vokse med held) at løfte celler som følgende: omhyggeligt aspiratprøver medier tilsættes 500 pi af 0,25% trypsin brønd, holde dem ved 37 ° C, indtil cellerne er frigjort (det tager normalt 2-3 min.)
  2. Forbered behoveted volumen Soy Bean trypsininhibitor (SBTI) (750 pi per 1 ml trypsin) i et 15 ml rør.
  3. Løsne celler ved gentagen pipettering op og ned trypsinopløsning, transfer løsnede celler i 15 ml konisk rør med SBTI.
  4. Skyl alle brønde med i alt 1 ml HBSS, tilsæt HBSS til røret med cellerne.
  5. Centrifugeres for at pelletere (4 ° C, 400 x g, 5 min), aspireres medierne, resuspender i 1 ml BEGM + medier og vortexes røret.
  6. Udvid celler i en T25 eller T75 kolbe afhængig pillestørrelse (dette er p1, cirka to sammenflydende brønde gå ind i en T75 kolbe, en sammenflydende godt, er nok til en T25, som regel 2 sammenflydende brønde giver en T75).
    1. Tilføj BEGM + til kolberne (5 ml hver for en T75, 3 ml hver for en T25).
    2. Tilføj cellesuspensionen til kolberne. Overfør kolber i en vævskultur-inkubator.
  7. 24 timers post-kolbe-seeding: tilføje ekstra BEGM + medier til kolben (3 ml til en T25, 10 ml til en T75).

5.. Frø cellerne på Tissue Culture Inserts

  1. Fjern medierne fra kolben og tilsæt trypsin (3 ml for T25, 4 ml til T75 kolbe).
  2. Inkuberes ved 37 ° C, indtil cellerne er frigjort (ca. 2-3 minutter).
  3. Forbered SBTI (750 pi per 1 ml trypsin> 2,25 ml for T25, 3 ml til T75) i et 15 ml rør.
  4. Løsne celler ved at tape kolben og pipettering op og ned og overføre til konisk rør med SBTI.
  5. Kolben skylles med HBSS (1 ml til T25, 2 ml til T75), tilsæt HBSS til 15 ml rør.
  6. Centrifugeat bundfælde (4 ° C, 400 xg 5 min), fjernes supernatanten forsigtigt.
  7. Forbered pladerne: beslutte, hvor mange plader vil være seedet, mærke pladerne med kodeeksempler og nummer, passage nummer (dvs. P2) og dato. Tilføj 700 pi BEGM + medier til det basale kammer.
  8. Resuspender cellepelleten i 1 ml BEGM ALI medier ved hvirvelbehandling røret.
  9. Tæl cellerne med et hæmocytometer (T25 normalt producerer omkring 4 millioner celler en T75 kan have op til 20 millioner celler, afhængigt af holmen, brug 1-2 millioner af celler til en 12-brønds plade) og fortyndes cellesuspensionen med BEGM ALI medier til det samlede behov for mængden af plader, der skal seedes (1,2 x 10 6 celler i 2,5 ml medier per plade) volumen (bemærk:. Hvis en del af cellerne vil blive fastfrosset, Label røret og fjerne celler her: vi normalt fryse 2 x 10 6 celler i 2 ml frysning medier)
  10. Tilsæt 200 pi cellesuspension til den apikale side af hver uovertrukne Corning 12well celleIndsæt (> dette vil være omkring 80,000-150,000 celler / insert, 12 mm Transwells med 0,4 um pore polyester (polyethylenterephthalat (PET)) membran insert), overføre til vævsdyrkningsinkubator.
  11. Efter 24 timer ændre apikale medie (200 pi ekspansion medium).
  12. Vedligeholdelse af cellekulturer: Skift medier (BEGM ALI medier 700 ul basolateral og 200 pi apikale) hver anden dag. Skær skal opretholdes under vandet, indtil cellerne er helt sammenflydende (ingen huller i monolag er synlige). Afhængig af celleantal dette normalt tager mellem 2-6 dage, hvis det tager længere tid cellerne vil højst sandsynligt ikke være levedygtig.

6.. Etablere Air Liquid grænseflade Når cellerne er helt Confluent (Når cellerne i Transwells er helt Konfluent)

  1. Når cellerne er helt sammenflydende udskifte begge apikale og basolaterale medier med BEGM ALI medier suppleret med 500 nM retinsyre for 48 timer.
  2. 48 timer efter tilsætning af retinsyre supplerede BEGM ALI medier: Forbered PneumaCult-ALI Maintenance Medium (efter producentens anvisninger): Beregn rumfanget af medium behov (for en plade normalt 8,5 ml til basale rum), tilsættes pr 1 ml PneumaCult Komplet Base Medium :

    10 pi PneumaCult 100x forsørgertillæg
    2 pi Heparin (af en 2 mg / ml stamopløsning)
    5 pi Hydrocortison (i en 96 ul / ml stamopløsning).

  3. Fjern alle medier og tilsæt 700 ul PneumaCult-ALI vedligeholdelse medier til den basolaterale side kun (ingen medium på den apikale side).
  4. Vedligehold cellekulturer til 4 uger ved ALI:
    1. Skift medierne hver anden dag (mandag, onsdag og fredag ​​tidsplan fungerer godt for os).
    2. Efter en uge på ALI, en gang om ugen (onsdage) den apikale overflade skylles: tilsættes 200 ul HBSS til den apikale side, holde dem i 10 minutter i inkubatoren forsigtigt aspireresHBSS (brug en 9 i glaspipette knyttet til vakuum fælden i den biologiske sikkerhed fryser, skal du bruge 200 tips ul på spidsen af ​​pipetten at suge fra HBSS).

Bemærk: Skift tip mellem plader, såvel som at ændre de tips, når man går fra apikale overflade versus basolateral. Efter ca 2 uger på ALI, celler begynder at differentiere og cilier vises. Cellekulturer nå fuld differentiering efter ca 4 uger på ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NEC'erne dyrket efter den her beskrevne protokol re-differentiere til en heterogen lag af EC'er sammensat af cilierede og ikke-cilierede celler, som repræsenterer in vivo situation (figur 1). Nogle af de differentierede NEC'erne slim producerer (celler farvning i blå bruge AB / PAS, figur 1B). Selv om den her præsenterede protokol er optimeret, kan differentiering varierer med hensyn til fordelingen af de samlede cellepopulationer (dvs. forskellige forhold af cilierede celler: slimproducerende celler: ikke-cilierede celler) eller endda give en mere pladeepitel. Disse variationer kan afhænge af donor befolkning og repræsenterer derfor sammenfatning af en underliggende sygdom fænotype, som vi tidligere har vist, at bruge NEC fra rygere 18 2 viser eksempler på suboptimale re-opdelte NEC'erne bruger en anden protokol og medier formuleringer. Figur. Cellerne er skællede oghverken cuboidal heller cilierede og ikke efterligne en pseudostratified respiratorisk epitel (figur 2).

Figur 1
Figur 1. Re-differentierede humane NEC kultur. NEC'erne blev fikseret med 4% PFA og indlejret i paraffin. Kulturer blev farvet med hematoxylin og eosin (A) og Alcian Blue / periodisk syre-Schiff (B) (efter fremgangsmåder beskrevet i 19). Billederne viser NEC'erne med en klar organisation, en terningformet struktur, slimproducerende slimceller samt cilierede ECS.

Figur 2
Figur 2. Hæmatoxylin og eosin farves paraffinindstøbt sektion af suboptimal kulturer. NEC kulturer med suboptimal differentiering. Celler vises skællede, ingen cuboidal struktur ingen cilierede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Respiratory ECs giver ikke kun en fysisk barriere for at beskytte den menneskelige krop fra eksogene stimuli 20, men også fungere som et omstillingsbord til at iværksætte og regulere respiratoriske immunforsvar respons 1-3 via sekretion af opløselige mediatorer eller direkte receptor-ligand celle-celle interaktioner. For yderligere at undersøge den rolle, ECS immunrespons, at undersøge potentielle forskelle blandt ECS fra syge befolkninger eller for at studere virkningerne af udefrakommende stressfaktorer til ECS, er det vigtigt at rekapitulere in vivo situationen. De menneskelige luftveje indeholde mere end 40 forskellige celletyper 20 herunder forskellige epitelceller, såsom cilierede celler, slimceller og basale celler 20. Vores protokol beskriver, hvordan en overfladisk nasal skrabning biopsi kan behandles til opnåelse af NEC, der kan udvides og dyrkede at gennemgå re-differentiering, hvilket gav NEC kulturer, som i vid udstrækning efterligner næseepitelet in vivo.

Brugen af denne in vitro-model af organotypiske primære humane differentierede NEC'erne giver unikke muligheder for forskellige applikationer. Det gør det muligt at studere sygdomsspecifikke forskelle i NEC (fx cystisk fibrose, astma, rygning), underliggende mekanismer på en sygdom, samt kontrollerede eksponeringer for luftforurenende stoffer (fx ozon, diesel udstødning, cigaretrøg) 18,21-23. Desuden differentierede NEC'erne dyrket på vævskulturplader skær egner sig til co-kultur med andre celletyper (fx dendritiske celler, naturlige dræberceller eller makrofager) 10,11, gør det muligt at undersøge celle-celle interaktioner i en kontrolleret indstilling.

Vi beskriver dyrkningen og re-differentierende af NEC, og ikke bronkiale epitelceller, der er blevet anvendt i mange tidligere offentliggjorte undersøgelser 24-27. Vi ser forskellige grunde anvendelsen af ​​NEC kan være fordelagtigt i forhold til brugen afbronchiale ECS. Først, få overfladiske nasal skrab biopsier er billigere end at udføre en bronkoskopi for at opnå børste biopsier. For det andet, for en række af præ-eksisterende sygdomme (f.eks afskære astmatikere), er det urealistisk at gennemføre et forsknings-relateret bronkoskopi til opnået lavere luftveje epitelceller. Dog kan mindre invasiv procedure skrabe nedre flade af den nedre nasal turbinate med Rhino Probe udføres i disse områder. For det tredje kan nasale skrab biopsier udføres på de samme personer flere gange (normalt omkring 4 uger i mellem biopsier) uden væsentlige bivirkninger 28-30. For det fjerde, NEC'erne er blandt de første celler til at blive udsat for inhaleret miljømæssige stressfaktorer, såsom luftforurenende stoffer, patogener eller allergener og dermed repræsenterer værdifuld in vitro modeller til at studere virkningerne af disse stressfaktorer på luftvejs epitelceller.

Forskellige cellekultursystemer af re-adskillerentiated human ECS kommercielt tilgængelige (fx EpiAirway model fra Mattek, Ashland, MA, Clonetics fra Lonza, Basel, Schweiz, MucilAir fra Epithelix Sars, Genève Schweiz). Disse kommercielt tilgængelige cellekulturer forblive stabile i en lang periode og er godt karakteriseret. Men de er dyre, og studierne er normalt begrænset til et lille antal prøver fra forskellige individer. Desuden er det vanskeligt at styre bloddonorer, som afhænger af tilgængeligheden fremlagt af leverandøren. Frisk opnå NEC'erne med overfladiske skrab biopsier tillader investigator at styre underlagt egenskaber (såsom alder, køn, race, vægt, body mass index, status sygdom, brug af medicin, osv.) og til at re-call frivillige tilbage til en potentiel opfølgning op.

Generelt alle offentliggjorte protokoller for re-differentierende humane luftveje (enten bronkial eller nasal) ECS på ALI omfatter lignende procedurer: obtaining EC'er, udvidelse af cellerne i vævskulturkolber og overføre dem til porøst cellekultur skær til differentiering på ALI. Protokollerne varierer i type medie, vækstfaktoren kosttilskud, antallet af passage, overfladebehandling af skærene, og aktivering af de nationale emissionslofter før oprettelse af ALI. Mens der i en protokol, efter at have indhentet og fordøje, er cellerne seedet direkte på ubestrøget skær og kun holdt et par dage på ALI før brug 13, andre protokoller omfatter dyrkning i flere uger til at re-differentiere på ALI 12,14,15 . Der er ingen konsekvens om at overtrække skær med collagen eller andre ekstracellulære matrixkomponenter: mens nogle protokoller kræver belægning 12,15 andre bruger ikke-coatede skær 13,14. Men dyrkningsbetingelser er af stor betydning, især inkubator indstillinger. Den relative fugtighed, som skal være> 90%, og CO 2, som bør justeres til 5% er megetvigtige faktorer for at undgå udtørring af ALI cellekultur og hjælpe buffer medierne. For at dele vores erfaringer, vi ønsker at nævne her, at der ikke er 100% succesrate. Nogle nasal skrab biopsiprøver ikke overholder vævskulturpladen, mens nogle NEC prøver ikke vil overholde de indsatser, eller vil aldrig nå sammenflydning. I årenes løb har vores samlede succesrate under anvendelse af protokollen beskrevet her er cirka 80%. Vores erfaring viser, at dyrkning af NEC fra definerede syge befolkningsgrupper, såsom rygere, er mere udfordrende end NEC fra raske ikke-rygere

Vores protokol til dyrkning af primære humane NEC'erne indeholder flere vigtige skridt, som vi optimeret gennem årene: 1.. De nationale emissionslofter kun udvidet to gange, før de udsås på vævskultur skær. 2. Skærene er brugt uden belægning. 3. Når podet på vævskulturplader, er mængden af ​​NuSerum trinvis nedsættes for at undgå, at cellerne løft fra vævskulturplader. 4.. De nationale emissionslofter holdes mindst 25-28 dage på ALI før du bruger dem i forsøg for at sikre fuldstændig re-differentiering. Sammenfattende protokollen beskrevet her inkluderer en optimeret protokol til kultur og re-differentiere menneskelige NEC'erne på ALI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Lisa Dailey de nyttige input.

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (ES013611 og HL095163), Flight Attendant Medical Research Institute (FAMRI) og Environmental Protection Agency (CR83346301) og erklærer nogen interessekonflikt. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health. Selv om forskning er beskrevet i denne artikel er blevet finansieret delvist af det amerikanske Environmental Protection Agency gennem samarbejdsaftale CR83346301 med Center for Environmental Medicine, Astma og Lung Biology ved University of North Carolina Chapel Hill, har det ikke været udsat for agenturets nødvendige peer og politikken og derfor ikke nødvendigvis afspejler de synspunkter, bureau, og ingen officiel påtegning skal udledes herfra. Nævn of firmanavne eller kommercielle produkter udgør ikke godkendelse eller anbefaling til brug. Loretta Müller er støttet af den schweiziske National Science Foundation med et personligt tilskud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
  2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
  3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. (2012).
  4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
  5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
  6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
  7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
  8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
  9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
  10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. (2010).
  11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. (2013).
  12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
  13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
  14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39, (2003), 266-269 (2003).
  15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
  16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
  17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
  18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
  19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
  20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
  21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
  22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
  23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
  24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. (2012).
  25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
  26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
  27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
  28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
  29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
  30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics