Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

1Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Pediatrics, The University of North Carolina at Chapel Hill, 3Pulmonary Diseases and Critical Care, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Toxicology, The University of North Carolina at Chapel Hill
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Insan gönüllülerin yüzeysel sıyrık biyopsi yoluyla elde edilen nazal epitel hücreleri, doku kültürü ekler üzerine genişletilmiş ve aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, kirpikli olmayan silli hücre kültürleri, sonuçta hava sıvı arayüzü yetiştirilir. Farklılaşmış nazal epitel hücre kültürleri solunum mukozasını eğitim için uygun deneysel modeller sunar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer II, W. A., Jaspers, I. Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface. J. Vis. Exp. (80), e50646, doi:10.3791/50646 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kullanılarak in vitro modellerde insan primer epitel hücre mikrobik enfeksiyonların veya teneffüs maddeleri bağlamında, solunum epitel önemli işlevleri anlaşılması çok önemlidir. Hastalıklı toplumlardan elde edilen hücrelerin doğrudan karşılaştırmalar bize farklı fenotipleri karakterize ve epitel hücre fonksiyon değişiklikleri arabuluculuk yatan mekanizmaları incelemek için izin verir. İnsan trakeobronşiyal bölgedeki epitel hücreleri kültür iyi belgelenmiş oldu, ama bronş fırçalar biyopsilerin ile bağlantılı insan akciğer dokusu veya invaziv kullanılabilirliği ile sınırlıdır. Burun epitel hücreleri çok daha az invazif yüzeysel sıyrık burun biyopsiler sayesinde elde edilir ve konular hiçbir önemli yan etkileri ile birden çok kez biyopsi alınabilir. Ayrıca, burun, solunum sistemine giriş noktası olduğunu ve bu nedenle bu tür mikrobik ajanlar gibi hava kaynaklı stres her türlü maruz ilk sitelerden biri, Kirleticiler, ya da allerjenler.

Kısaca, insan gönüllülerden elde burun epitelyum hücreleri kaplanmış doku kültür levhaları üzerinde genişletilmiş ve daha sonra, hücre kültürü ekler üzerine aktarılır. Ortak akışkanlığa eriştikten sonra hücreler, daha fazla fizyolojik olarak uygun koşullar oluşturur birkaç hafta, için, hava-sıvı arayüzü (ALI) 'de kültürlenmiştir olmaya devam etmektedir. ALI kültür kalıntıları üreten kirpikli ve mukus hem de hücreler ile insan burun epitelyumuna benzer bir morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini sergileyen bir farklı epiteline gelen tanımlı medya kullanır. Farklılaşmış burun epitel hücreleri ile doku kültür ekleri araştırma soruları (farmakolojik maddeler ile tedavi, lentiviral vektörler, gazlara maruz kalma veya mikrobiyal maddeler ile enfeksiyon ile transdüksiyon) bağlı olarak çeşitli yollarla manipüle edilebileceğini ve değişen sayıda farklı noktalar için analiz edilebilir hücresel ve moleküler yolları, fonksiyonel changes, morfoloji, vb

Farklılaştırılmış insan nazal epitel hücrelerinin in vitro modellerinde büyük ölçüde in vivo burun epiteli taklit olduğunu organotipik deneysel modelleri kullanılarak yeni ve önemli araştırma soruları için müfettişler sağlayacaktır.

Introduction

Tekniğin gol

Solunum yollarındaki epitel hücreleri (EC) doğrudan bu patojenlerin, alerjenlerin veya hava kirleticileri olarak inhale çevresel stres, maruz kalınabilecek ilk siteler arasında yer alıyor. EC yapısal bir bariyer daha vardır: Bu çözünür aracıların 4-6 ve 7-9 Surfac ligandlar / reseptörlerinin ekspresyonunun serbest bırakılması yoluyla, solunum bağışıklık tepkisini başlatmak 1-3 ve düzenleyen bir santral olarak hareket ederler. Ölümsüz hücre çizgileri, in vitro olarak solunum ECS incelemek için model olarak kullanılabilir olsa da, in vivo olarak gözlemlenen ile benzer polarize kirpikli ve mukus üreten hücrelerin, oluşan heterojen hücre popülasyonu içine ayırt başarısız. In vivo olarak gözlenen, solunum epitel önemli özelliklerini özetlemek için, primer hava yolu EC kullanılabilir. Bu nedenle hedefimiz, burun ECS (UEM) kullanan bizim yöntemini optimize etmek olduğunu, insan gönüllülerden elde. NECs in vivo görülen burun epitelinin özellikleri birçok farklı temasa geçiniz taklit eden bir hücre kültürü modeli elde edilmiştir, in vitro olarak genişletilmiş ve kültürlenir.

Gerekçe

In vivo durumda taklit eden insan primer EC'ler ile in vitro modellerinin kullanımı - Bu çalışmada tarif edildiği gibi -, hastalık EC'ler belirli farklılıklar, solunum yolu epitel ile bağlantılı fizyolojik parametreleri ya da EC'ler ve diğer hücre tipleri arasındaki etkileşimi incelemek için benzersiz olanaklar sunar , dendritik hücre 10 gibi, doğal katil hücreler, 11 ya da makrofajlar. Çeşitli yöntemler mevcut Bronkoskopi esnasında fırça biyopsi yoluyla elde edilen invazif veya aksi takdirde iptal akciğer dokusundan 12-17 den edilebilir bronş ECS, kullanmaktadır. Buna ek olarak, tam olarak farklılaşmış insan solunum yolu epitel hücre kültürleri elde etmek için ticari kaynaklar MatTek, Ashland, MA, Clonetics'ten dan (EpiAirway modeli vararaştırmacılar farklı vericilerden seçebilirsiniz Lonza'dan, Basel, İsviçre, Epithelix Sars gelen MucilAir, Cenevre İsviçre), dan. Bununla birlikte, sınırlı bir ticari olarak temin edilebilir epitel hücreleri veya parametrelerin öngörülmüş sınırlı havuzunun, ticari olarak primer insan solunum yolu ECS elde etmekle bağlantılı maliyet ve atılır akciğer dokusu ya da yeni elde edilen insan bronşiyal, biyopsi yapılan doku için sınırlı erişim, birçok araştırmacı yasaklamak tamamen farklılaşmış insan hava yolu EC'lere çalışmalar yapmasına. Bu nedenle, 1), non-invaziv elde edilen insan NECs kullanmak 2) farklılaştırılmış insan epitel kültürleri veren bir protokol sağlar, ve 3) varolan doku kültürü altyapısı ile en laboratuvar ortamlarında tekrarlanabilir olacak bir teknik geliştirmek için yola çıktı.

Mevcut Teknikleri / Modeller üzerinde Avantajları

Taze NECs elde edilmesi, bronşiyal veya küçük solunum yolu EC ile karşılaştırıldığında, çok daha az invaziv bir bireydirs hiçbir önemli yan etkileri ile birden çok kez biyopsi alınabilir ve yüzeysel sıyrık burun biyopsi aksi araştırma ile ilgili bronkoskopilerin hak olmaz hastalıklı toplumlarda yapılabilir. NECs elde noninvaziv yüzeysel sıyrık biyopsileri araştırmacı başarılı olmak için araştırma amacına uygun vb yaş, cinsiyet, hastalık durumu da dahil olmak üzere, donör spesifikasyonuna a priori olarak ayarlamanızı sağlar. Araştırma çalışmaları tasarlarken Böylece, araştırmacılar, ticari satıcıları, ya da tasarım invaziv bronkoskopi çalışmalardan pahalı farklılaşmış hücre kültürü modelleri satın almak, klinik olarak mevcut dokuların / epitel örnek ile sınırlı değildir. Buna ek olarak, NECs elde etmek için kolaylıkla gözlenen bulgular istatistiksel doğrulama artırır, farklı vericilerden temin edilmiş hücrelerde deneyler yeteneğini arttırır. Son olarak, burun hava kaynaklı stres herhangi bir maruz ilk sitelerinden biridir. Bu nedenle, in organotipik üretilmesiBurun epitel taklit eden in vitro kültür sistemleri kolayca bu hücre kültür sistemi kullanılarak elde edilebilir viral parçacıklar, kirleticiler, alerjen veya gazlardan oluşan teneffüs çalışmaları için yararlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Plastik Ware hazırlayın: Coat Plakalı

  1. , 12 oyuklu plakanın her oyuğuna 500 ul PureCol (1:100, steril su ile seyreltilmiş) ilave edin.
  2. 30 dakika için bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe edilir, PureCol çıkarın ve hücreleri plakaya ilave önce HBSS sağ ile yıkayın (aşağıdaki adım 3.1).

2. Alınması ve İnsan temasa geçiniz ön-muamelesi Biyopsi

  1. Burun kazıma biyopsi
    1. Spekulum ile bir işletim otoskop üzerinde 9 mm yeniden polipropilen nazal spekulum (Model 22009) üzerinden direkt görüş altında burun turbinat astar yüzeysel ECS (Model 21700) edinin. Bu cihaz, burun kıvrımlarının ve hareket esneklik uygun görselleştirme sağlar.
    2. Kafa biraz geriye doğru eğik veya muayene masasına sırtüstü pozisyonda yatarken düz bir destekli bir sandalyede dik oturmuş konu ile biyopsi.
    3. Burun deliğine otoskop spekulum ve alt turbi takınNate aydınlatma ile görüntülendi.
    4. Konkanın arka genişletilmiş distal ucu ile spekulum ile steril bir termoplastik küret yerleştirin.
    5. Konka alt yüzeyinde hafif basınç kullanarak, küret mukoza yüzey 5x arasında çizilen ve geri çekilir. Kılcal hareket ile tutulan mukoza hücrelerinin başarılı bir alma küretin fincan belirgin olacaktır.
  2. RPMI 1640, 8 ml buz üzerinde taşınmasını içeren bir 15 ml konik bir tüp içinde numunesi yerleştirin.
  3. , Prob almak P-1000 pipet ile gergedan probu dokuyu çıkarmak, sonda atmak için forseps kullanın
  4. Santrifüj, aspire süpernatant (dikkat: pelet aspire dikkat) (4 ° C, 400 xg, 5 dk) pelet için.
  5. 100x DNase 1 10 ul 1 ml begm pelet tekrar.
  6. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. Santrifüj (4 ° C, 400 xg, 5 dk), süpernatant aspire etmeyin!

3. SPlastik üzerine eed Hücreler (Gün 0)

  1. Plakadan PureCol çıkarın ve HBSS ile yıkayın (adım 1.2 'de bakınız).
  2. (Medya bir menisküs kuyunun merkezinde görünene kadar, 80-100 ul) kaplanmış plakanın (biyopsi boyutuna bağlı olarak) 1-4 kuyulara begm + + ortamının en az bir hacim.
  3. Dikkatli bir şekilde çok fazla ortam aspire olmadan tüpten biyopsi doku pelet kaldırmak için bir P-1000 pipet kullanın.
  4. , Kuyuların ortasına pelet aktarın hücrelerin bir küme olarak birlikte biyopsi tutmak ve tek bir hücre süspansiyonu yapmak kadar bozmazlar. Seribaşı olabilir 4 kuyulara kadar iyi bir biyopsi verimleri. Doku kültürü kuluçka makinesine (37 ° C,% 5 CO2,>% 90 nispi nem) içine plaka koyun.
  5. (Menisküs bozmadan) yeterli ortam var olduğundan emin olmak için iki saat sonra kontrol edin.
  6. Gün1, 24 saat post-tohumlama: tüm oyuklara her yıkanarak yapışmayan hücreler (eğimli plaka toplanması ve bir P-1000, c hücreleri ile ortam toplamaBir 1.5 ml santrifüj tüpüne ollect tüm kaynaklar).
  7. Santrifüj (4 ° C, 400 xg, 5 dk).
  8. Hücre süspansiyonu santrifüje tabi da: 0. günde ekildi hücrelere begm + + ve + begm ortam karışımı, 250 ul, yaklaşık 250 ul ekleyin.
  9. Tekrar yapışkan olmayan hücreler için 3,1-3,5 adımları tekrarlayın.
  10. Gün 2-5: Günlük hücre değişim ortamı;, her bir kuyunun 500 ul medya eklemek begm + + medya aşamalı (günde 2 miktarını azaltmak ekimden sonra: 125 ul begm + + artı 375 ul begm +, tohumlama sonra gün3 ve şu günlerde: 73 ul begm + + artı 427 ul begm +).

4. Hücreler şişeler içinde genişletilmesi

  1. Günlük hücreleri izlemek, onlar aşağıdaki gibi% 80-90 confluency (uzun sürer eğer genellikle 5-7 gün biyopsi sonrası, başarıyla büyümek olmaz) kaldırma hücreleri ulaştığında:;% 0.25 tripsin 500 ul ekleyin dikkatle aspire medya hücreler müstakil kadar iyi başına (genellikle 2-3 dakika sürer) 37 ° C'de saklayın.
  2. Ihtiyacı hazırlanmasıbir 15 ml tüp içinde Soya fasulyesi tripsin inhibitörü (SBTI) (1 ml Tripsin başına 750 ul) ed hacmi.
  3. Tekrar tekrar yukarı pipetleme ve tripsin çözüm aşağı hücreleri çıkarmak; SBTI ile 15 ml konik tüp transferi müstakil hücreler.
  4. Hücrelerle boruya HBSS eklemek, toplam 1 ml HBSS ile her kuyu durulayın.
  5. , (4 ° C, 400 xg, 5 dk) pelet 1 ml begm + medya ortamı, tekrar süspansiyon aspire ve tüp vortekslemedeki santrifüj.
  6. Pelet boyutuna bağlı olarak bir T25 ya da T75 şişede hücreleri genişletmek (bu p1; yaklaşık iki birbirine kuyu bir T75 şişesi gitmek, bir birleşen iyi bir T25 için yeterli, genellikle 2 birleşen kuyuları tek T75 verim).
    1. (A T75 boyunca 5 ml her biri, bir T25 için her biri 3 mi) şişelere begm + ekleyin.
    2. Şişelere hücre süspansiyonu ekleyin. Bir doku kültür inkübatörü içine şişeler aktarın.
  7. 24 saat post-şişe-tohumlama: şişeye (a T25 3 mi, bir T75 10 mi) ilave begm + ortam ekleyin.

5. Doku Kültürü Ekler üzerinde Hücreleri tohum

  1. Şişeden Ortamı çıkarın ve tripsin (T25 için 3 mi, T75 şişesi için 4 ml) ekleyin.
  2. Hücreler müstakil kadar 37 ° C'de inkübe edin (yaklaşık 2-3 dakika).
  3. SBTI (1 mi Tripsin başına 750 ul> T25, T75 için 3 ml 2.25 ml) bir 15 ml tüp içinde hazırlayın.
  4. Aşağı şişeyi bantlama ve yukarı pipetleme hücreleri çıkarmak ve SBTI ile konik tüp transferi.
  5. 15 ml tüp HBSS eklemek, HBSS (T25, T75 boyunca 2 ml için 1 mi) ile şişe durulayın.
  6. Santrifüj(4 ° C, 400 x g, 5 dk) topak haline dikkatlice süpernatant kaldırmak.
  7. Tabak hazırlayın: seribaşı olacak kaç tabak karar, örnek kod ve numarası, geçiş sayısı (yani p2) ve tarih ile plakaları etiket. Bazal odasına 700 ul begm + ortam ekleyin.
  8. Tüp vorteks 1 mi begm ALI ortamı içinde hücre pelletini.
  9. Bir hemositometreyle ile hücrelerin sayısı (bir T25 genellikle yaklaşık 4 milyon hücrelerini üretir, T75 adacık bağlı kadar 20 milyon hücre olabilir; tek 12 plaka için hücrelerin 1-2000000 kullanın) ile hücre süspansiyonu sulandırmak (plaka başına 2.5 ml ortam içinde 1.2 x 10 6 hücre) tohumlandı gereken plakaların miktarı için gerekli olan toplam hacme begm ALI ortamı (Not:. hücrelerin kısmı dondurulacak istiyorsunuz, tüp etiket ve hücreleri uzaklaştırmak burada: genellikle) ortam dondurma içinde 2 ml, 2 x 10 6 hücre dondurma
  10. Her kaplanmamış Corning 12well apikal hücre tarafına 200 ul hücre süspansiyonu ekleyintakın (> bu konuda 80,000-150,000 hücre / eklemek olacaktır; 0.4 mikron gözenek polyester (polietilen tereftalat (PET)) membran uç ile 12 mm transwells); doku kültürü inkübatör içine aktarın.
  11. 24 saat sonra apikal ortamı (200 ul büyüme ortamı) değiştirin.
  12. Hücre kültürleri bakımı: (begm ALI medya; 700 ul Bazolateral ve 200 ul apikal) medya değiştirin her gün. Uçlar hücreleri (tek tabaka hiçbir delik görebilir) tamamen konfluent kadar su altında muhafaza edilmesi gerekir. Bu hücreler büyük ihtimalle uygun olmayacak daha uzun sürerse, hücre sayısına bağlı olarak, bu, genellikle, 2-6 gün arasında sürer.

6. Bir kez Hücreler (transwells üzerindeki hücreler tamamen karışmış olduğu zaman) Tamamen karışmış olan Hava Sıvı Arayüzü kurmak

  1. Hücreler, 48 saat boyunca 500 nm retinoik asit ile takviye edilmiş begm ALI ortamı ile iki apikal ve bazolateral ortamı yerine tamamen konfluent kez.
  2. Retinoik asit eklendikten sonra 48 saat begm ALI ortamı desteklenmiş: PneumaCult-ALI Bakım Orta (aşağıdaki üreticinin talimatları) hazırlayın: (bazal bölümlerinde genellikle 8.5 ml tek plaka için) gerekli ortamın hacmini hesaplayın; 1 ml başına eklemek Komple Bankası Orta PneumaCult :

    10 ul PneumaCult 100x Bakım Supplement
    2 ul (2 mg / ml stok çözeltisi) Heparin
    (96 ul / ml stok çözeltisi) 5 ul hidrokortizon.

  3. Tüm ortamları çıkarın ve bazolateral tarafta yalnızca (apikal tarafında hiçbir orta) 700 ul PneumaCult-ALİ bakım medya ekleyebilirsiniz.
  4. AAH 4 hafta için hücre kültürlerinin bakımı:
    1. Medya (Çarşamba ve Cuma zamanlama bizim için iyi çalışır, Pazartesi) her gün değiştirin.
    2. ALI'de bir hafta sonra, bir hafta (Çarşamba) bir kez apikal yüzey durulanır: dikkatle aspire, inkübatör 10 dakika tutmak, apikal tarafında 200 ul HBSS eklemekHBSS (HBSS kapalı emme pipet ucunda 200 ul ipuçlarını kullanabilirsiniz, Biyolojik güvenlik kabini vakum tuzak bağlı cam pipet bir 9 kullanın).

Not: Değişim plakalar arasında ipuçları yanı sıra Bazolateral karşı apikal yüzeyinden geçerken ipuçları değişen. AAH yaklaşık 2 hafta sonra, hücreler ayırt etmek için başlangıç ​​ve kirpikler görünür. Hücre kültürleri ALI yaklaşık 4 hafta sonra tam farklılaşma ulaşır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NECs burada açıklanan protokol in vivo durumu (Şekil 1) temsil eden ve silli olmayan silli hücrelerin oluşan EC'ler bir heterojen tabaka halinde yeniden ayırt aşağıdaki kültürlenmiştir. Farklılaşmış temasa geçiniz bazıları (AB / PAS, Şekil 1B kullanarak mavi boyama hücreleri) üreten mukus vardır. Burada sunulan protokol optimize edilmiş olsa da, farklılaşma genel hücre popülasyonlarında (: mukus üreten hücreleri: silli hücrelerin değişik oranları, yani non-silli hücre) dağıtımı ile ilgili olarak değişebilir, hatta daha fazla yassı epitel verim. Bu varyasyonlar donör nüfus bağlıdır ve bu nedenle daha önce sigara içenler 18 NECs kullanarak gösterdiği gibi, altta yatan bir hastalık fenotip özetini temsil edebilir. 2 farklı protokol ve medya formülasyonları kullanarak bırakıyorsa yeniden farklılaşmış temasa geçiniz örneklerini göstermektedir. Hücreler ve skuamözküboidal ne kirpikli ve bir yalancı solunum epitel (Şekil 2) taklit yok. ne

Şekil 1
Şekil 1. Yeniden farklılaşmış insan NEC kültürü. NECs% 4 PFA ile sabit ve parafin içine gömüldü. Kültürler (19 de tarif edilen metotlar takip edilerek) hematoksilin ve eozin (A) ve Alsiyan periyodik / mavi asit-Schiff (B) ile boyandı. Görüntüleri net bir organizasyon, bir kübik yapısı, mukus üreten goblet hücreleri yanı sıra kirpikli EC'lere ile NECs göstermektedir.

Şekil 2,
Şekil 2. Hematoksilen ve eozin optimal kültürlerin parafin-gömülü bölümü lekeli. Bırakıyorsa farklılaşma ile NEC kültürler. Hücreler skuamöz görünür, hiçbir cuboidal yapısı, hiçbir silli hücre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Solunum EC eksojen uyaranlara 20 insan vücudu korumak değil, aynı zamanda çözünür arabulucular veya doğrudan reseptör-ligand hücre-hücre etkileşimleri sekresyon yoluyla başlatmak ve solunum bağışıklık savunma yanıtları 1-3 düzenleyen bir santral gibi hareket etmek fiziksel bir bariyer sadece sağlamak. Ayrıca, immün yanıt olarak EC'ler rolünü incelemek için hasta popülasyonlarında EC'ler arasındaki potansiyel farklılıkları incelemek için ya da EC'ler eksojen stres etkilerini incelemek için, bu durum in vivo özetlemek için önemlidir. İnsan solunum yolları gibi silli hücrelerin, goblet hücreleri ve bazal hücre 20 farklı epitel hücreleri dahil olmak üzere, birden fazla 40 farklı hücre tipleri 20 içerir. Bizim protokol yüzeysel burun biyopsi kazıma büyük ölçüde, in vivo olarak, burun epiteli taklit ki, NEC kültürleri elde edildi, yeniden farklılaşma geçmesi genişletilmiş ve kültüre edilebilir NECs elde etmek üzere işlenebilir açıklamaktadır.

Organotipik primer insan farklı temasa geçiniz, bu in vitro modelin kullanımı, çeşitli uygulamalar için benzersiz olanakları sağlar. Bu hastalık temasa geçiniz (örneğin, kistik fibrozis, astım, sigara) belirli farklılıklar, bir hastalığın altında yatan mekanizmaları yanı sıra, hava kirleticileri (örn. ozon, dizel egzoz, sigara dumanı) 18,21-23 kontrollü maruz eğitim veriyor. Ayrıca, doku kültür ekleri üzerinde büyümüş farklı NECs kontrollü bir ortamda hücre-hücre etkileşimleri incelemek sağlayan, diğer hücre tipleri (örneğin, dendritik hücreler, doğal katil hücreler, ya da makrofajlar) 10,11 ile birlikte-kültür kendilerini katmaktadır.

Birçok daha önce yayınlanmış çalışmalar 24-27 kullanılmıştır bronşiyal epitel hücreleri, kültürlenmesini ve temasa geçiniz yeniden ayırt tarif olup. Kullanımı ile karşılaştırıldığında temasa geçiniz kullanılması avantajlı olabilir neden Çeşitli nedenler bkzbronşiyal EC. İlk olarak, yüzeysel burun kazıma biyopsilerin fırça biyopsi elde etmek için bir bronkoskopi daha ucuzdur. İkincisi, önceden var olan çeşitli hastalıkların (örneğin astımlı ayırmak) elde edilen bu alt solunum yolu epitel hücreleri için bir araştırma ile ilgili bronkoskopi gerçekleştirmek için gerçekçi değildir. Ancak, Rhino Probe ile alt nazal konka alt yüzeyini kazıma az invaziv prosedür bu konularda yapılabilir. Üçüncü olarak, kazıma burun biyopsi herhangi bir önemli yan etki olmadan 28-30 (biyopsi arasında, genellikle yaklaşık 4 hafta), aynı birey üzerinde birden çok kez yapılabilir. Dördüncü olarak, NECs, hava kirleticiler, alerjenler ya da patojenler gibi çevre stres, inhale maruz ilk hücreler arasında olan ve bu nedenle hava yolu epitelial hücreler üzerinde bu stres etkilerini incelemek için in vitro bir model değerli temsil eder.

Yeniden farklılık çeşitli hücre kültür sistemlerientiated insan EC (MatTek, Ashland, MA, Lonza'dan Clonetics'ten, Basel, İsviçre, Epithelix Sars gelen MucilAir, Cenevre İsviçre örneğin EpiAirway modeli) piyasada bulunmaktadır. Bu ticari olarak temin edilebilen hücre kültürleri, uzun bir süre için sabit kalır ve iyi karakterize edilir. Bununla birlikte, pahalı ve çalışmalar genellikle farklı bireylerden alınan örnekler içinde az sayıda sınırlıdır. Ek olarak, tedarikçi tarafından sunulan mevcudiyetine bağlıdır verici nüfus kontrol etmek zordur. Taze yüzeysel sıyrık biyopsisi ile NECs elde araştırmacı (vb yaş, cinsiyet, ırk, kilo, vücut kitle indeksi, hastalık durumu, ilaç kullanımı gibi) konu özelliklerini kontrol etmek ve potansiyel takip geri yeniden çağrı gönüllülere sağlar kadar.

Genel olarak, ALI da yeniden ayırt insan solunum yolu seyahati yayınlanmış protokoller (bronşial veya nazal olarak) EC benzer prosedürler şunları içerir: obtaining EC, doku kültürü şişelerinde hücreleri genişleyen ve gözenekli hücre kültürüne aktarılması ALI de farklılaşması için ekler. Protokoller ortamı, büyüme faktörü takviyeleri, pasaj sayısı, insertlerin kaplama ve ALI kurmadan önce temasa geçiniz aktivasyonunun türüne göre değişir. Bir protokolde, elde etmek ve sindirim sonra hücreler, kaplanmamış ekler doğrudan tohumlanmış ve sadece kullanım 13 önce ALI birkaç gün muhafaza ederken, diğer protokoller birkaç hafta ALI 12,14,15 da yeniden ayırt etmek için kültürlenmesini içerir . Kolajen ya da diğer hücre dışı matris bileşenleri ile ekler kaplama hakkında hiçbir tutarlılık var: Bazı protokoller kaplamaya ihtiyaç ise 12,15 diğerleri kaplanmamış ekler 13,14 kullanın. Bununla birlikte, kültür koşulları, büyük önem taşımaktadır, özellikle kuluçka ayarlardır. % 5 ayarlanmalıdır>% 90 olması gerekmektedir bağıl nem, ve CO2, olan çokönemli faktörler ALI hücre kültürünün kurumasını önlemek ve medya tampon yardım etmek. Deneyimlerimizi paylaşmak amacıyla, biz hiçbir% 100 başarı oranı olduğunu burada belirtmek istiyorum. Bazı NEC örnekler ekler uygun olmaz veya confluency asla ulaşacak Bazı burun sıyrık biyopsi örnekleri, doku kültürü plakası uymayan. Yıllar içinde, burada açıklanan protokolünü kullanarak bizim genel başarı oranı% 80 civarındadır. Deneyimlerimiz, sigara içenler olarak tanımlanan hastalıklı nüfus, gelen temasa geçiniz kültürleme sağlıklı sigara içenlerle temasa geçiniz daha zor olduğunu gösteriyor

Birincil insan ile temasa geçiniz yetiştiricilik için bizim protokol biz yılda optimize birkaç önemli adımları içermektedir: 1.. Onlar doku kültürü ekler numaralı seribaşı önce NECs sadece iki kez genişletilir. 2. İnsertler kaplanmamış kullanılır. 3. Doku kültürü plakaları üzerine serpildi sonra, NuSerum miktarı kademeli olarak hücreler doku kültüründen kaldırarak önlemek azaltılırplakalar. 4. NECs yeniden farklılaşma tam sağlamak için deneyler onları kullanmadan önce ALI en az 25-28 gün tutulur. Özetle, burada açıklanan protokol ALI'de kültürü ve yeniden ayırt insan temasa geçiniz için optimize edilmiş bir protokol içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar yardımcı girişler için Lisa Dailey teşekkür etmek istiyorum.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES013611 ve HL095163) hibe tarafından desteklenen, Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü (FAMRI) ve Çevre Koruma Ajansı (CR83346301) ve herhangi bir çıkar çatışması ilan etti. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Bu makalede açıklanan araştırma Çevresel Tıp, Astım ve Kuzey Carolina-Chapel Hill Üniversitesi'nde Akciğer Biyoloji Merkezi ile işbirliği anlaşması CR83346301 aracılığıyla ABD Çevre Koruma Ajansı tarafından finanse edilmiş olmasına rağmen, tabi olmamıştır Ajans en gerekli akran ve politika incelemesi ve bu nedenle mutlaka ajansın görüşlerini yansıtmamaktadır ve hiçbir resmi onay sonucuna varılamaz. Mansiyon of ticari isimler ve ticari ürünler kullanım için onay ya da tavsiye niteliğinde değildir. Loretta Müller kişisel bir hibe ile İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasal speculum Welch Allyn Model 22009 9 mm, reusable polyproylene
Operating otoscope Welch Allyn Model 21700
Rhino probe cell cuvette Arlington Scientific SY-96-092 bend the head of the cuvette a little more
12-well culture plates Corning 3512
Transwell membrane cell culture inserts Corning 3460
Tissue culture flask Corning 430639 and 430641 T25 and T75 vented flask
RPMI 1640 media (with L-Glutamine) Gibco 11875
Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium Cell applications 511-500
BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium Lonza CC-3170 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution Gibco 25080 Use as it is.
NuSerum BD Biosciences 355104 Use as it is.
BAMBANKER freezing media BAMBANKER 302-14681 Use as it is.
CoolCell Biocision HTBCS-136 (CryoPrep alcohol-free cell freezing container)
PureCol AdvancedBioMatrix 5005-B dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate
HBSS with Ca2 and Mg2+ Gibco 14025
DNAse 1 Sigma DN25 Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media
Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red Gibco 25200-056 Use at it is
Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) Sigma T6522 Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml
Retinoic acid Sigma R7632 Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution).

All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol.
DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate Gibco 11995
Bovine Pituitary Extract Gibco 13028-014 Used for BEGM ALI media.
Nystatin Sigma N4014-50 mg Make up a solution of 3.3 mg/ml.
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water.
PneumaCult-ALI media StemCell 5001 This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below.
Hydrocortisone StemCell 7904 Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution)
Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) StemCell 7980 Use at it is.
Filter flasks (500 ml) Corning 431097 0.22 μm pore size
Filter tubes (50 ml) Millipore SCGP00525 Steriflip, 0.22 μm pore size
Pipette tips - ART Barrier Tips Molecular Bioproducts 2139RI, 2069RI, 2179RI
Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml
ddH2O, absolute ethanol, ice
CO2 incubator
refrigerated centrifuge
biological safety cabinet
pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes
gloves
lab coat with tight cuffs
Media and solutions used: Recipe Used for
General remark: always warm the media to room temperature
BEGM media
  • 500 ml BEGM Cell Application media with one aliquot of retinoic acid
(mix them half-half and filter )
  • 500 ml BEGM Lonza media with one aliquot of single quot supplements
  • digestion of the biopsy
BEGM+ media
  • 50 ml BEGM media
  • maintaining cells on plastic in the plates (passage0)
  • 10 μl retinoic acid (working solution)
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
  • maintain the cells in the flask
BEGM++ media
  • 50 ml Lonza’s BEGM media with supplements
  • seeding fresh cells in 12-well plate on plastic
  • 1 ml Sodium BiCarb
  • maintaining cells in the plates on plastic (passage0; only partially)
  • 2.5 ml NuSerum
  • seeding cells in the flask (passage1; partially)
BEGM ALI media
  • 250 ml DMEM-H
  • Maintaining cells on the transwell before they go ALI
  • 250 ml BEGM including supplements
  • 2 ml Bovine Pituitary Extract (12.5 mg/ml solution)
  • 1 ml Nystatin (3.3 mg/ml solution)
  • 75 μl BSA (10 mg/ml solution)
200X Hydrocortisone Stock Solution (96 μl/ml solution)
  • 200 μl dissolved hydrocortisone
  • As a supplement to the PneumaCult-ALI Complete Base Medium for the last day in the flask and when cells are on inserts
  • 4250 μl dissolved sodium chloride
  • 540 μl ddH2O
  • 10 μl absolute ethanol
Filter solution through 0.22 μm filter, aliquot solution and store at -20 °C, avoid additional freeze/thaw cycles
PneumaCult-ALI Complete Base Media
  • 450 ml PneumaCult-ALI Basal Medium
  • Base medium for all three PneumaCult-ALI media
  • 50 ml PneumaCult 10x Supplement
  • The PneumaCult media is light sensitive, thus always keep it in the dark
(this is stable for 2 weeks at 2-8 °C or for up to 6 months at -20 °C)
PneumaCult-ALI Maintenance Medium Per 1 ml of PneumaCult-ALI Complete Base Medium add: ALI culture on inserts
  • 10 μl PneumaCult 100x Maintenance Supplement
  • 2 μl Heparin (of a 2 mg/ml stock solution)
  • 5 μl Hydrocortisone (of a 96 μl/ml stock solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
  2. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
  3. Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. (2012).
  4. Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
  5. Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
  6. Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
  7. Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
  8. Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
  9. Obeidy, P., Sharland, A. F. NKG2D and its ligands. Int J. Biochem. Cell Biol. 41, 2364-2367 (2009).
  10. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. (2010).
  11. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. (2013).
  12. Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
  13. Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
  14. Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39, (2003), 266-269 (2003).
  15. Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
  16. Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
  17. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
  18. Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
  19. Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
  20. Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
  21. Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
  22. Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
  23. Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
  24. Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. (2012).
  25. Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
  26. Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
  27. Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
  28. Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
  29. Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
  30. Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).

Comments

1 Comment

  1. Can you describe in more detail how the paraffin-embedding and sectioning is performed? We are experiencing technical issues with our attempts at H&E. The transwell membranes "curl" and cells are lost. Does the thickness of the sectioning matter (5 um)? Thank you for this great tutorial.

    Reply
    Posted by: Kathy S.
    February 22, 2016 - 12:22 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics