الخلايا الدبقية الصغيرة زراعة من الجهاز العصبي المركزي حديثي الولادة والكبار

1Program in Neuroscience, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Sciences, Stony Brook University, 3Program in Molecular and Cellular Pharmacology, Stony Brook University
* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ونحن الخطوط العريضة لطرق فعالة وسريعة العزلة / ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة قابلة للحياة من القشرة الدماغية حديثي الولادة والحبل الشوكي الكبار. تشريح والطلاء من الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية يمكن إنجازه في غضون 90 دقيقة، مع موسم الحصاد دبقية اللاحقة التي تجري ~ 10 يوما بعد تشريح الأولي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bronstein, R., Torres, L., Nissen, J. C., Tsirka, S. E. Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System. J. Vis. Exp. (78), e50647, doi:10.3791/50647 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة هي المقيم الخلايا الشبيهة بلعم من الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وعلى هذا النحو، لهما أدوار بالغة الأهمية في العمليات الفسيولوجية والمرضية مثل CNS نضوج في التنمية، والتصلب المتعدد، وإصابات الحبل الشوكي. ويمكن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتجنيدهم للعمل بسبب الاصابة العصبية أو التحفيز، مثل تلف المحاور ينظر في مرض التصلب العصبي المتعدد أو الصدمة الدماغ الدماغية الناجمة عن السكتة الدماغية. ويعتقد أن هذه الأعضاء مناعيا من الجهاز العصبي المركزي أيضا أن يكون الأدوار في اللدونة متشابك في ظل ظروف غير مرضية. نحن توظيف بروتوكولات لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة حديثي الولادة والكبار والتي تهدف إلى تحقيق أقصى قدر من أرقام الهواتف المحمولة قابلة للحياة مع التقليل من المتغيرات التباس، مثل وجود CNS الأخرى أنواع الخلايا والحطام خلية ثقافة. نحن نستخدم مكونات الجهاز العصبي المركزي كبير وملحوظ بسهولة (مثل القشرة، شرائح الحبل الشوكي)، مما يجعل العملية برمتها مجدية وقابلة للتكرار. استخدام الخلايا الكبارS هو البديل المناسب لاستخدام الأطفال حديثي الولادة الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، كما درس العديد من الأمراض تؤثر في الأساس على الحبل الشوكي بعد الولادة. هذه الأنظمة الثقافة هي أيضا مفيدة لاختبار تأثير مباشرة من المركبات التي قد تمنع أو إما تعزيز التنشيط دبقية. منذ تفعيل دبقية صغيرة يمكن أن تشكل نتائج مرض في الجهاز العصبي المركزي الكبار، وهناك حاجة لفي نظم المختبر في الخلايا الدبقية الصغيرة التي حديثي الولادة والكبار يمكن تربيتها ودراستها.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية مقيم في الجهاز العصبي المركزي، تشبه بشكل وثيق الضامة الطرفية في البنية والوظيفة 1. وقد ثبت مؤخرا أن الخلايا دبقية بعد الولادة مستمدة من الأسلاف النخاعي بدائية ويتم إنشاؤها قبل اليوم الثامن من مرحلة التطور الجنيني، تقلب فكرة سابقة أن الأسلاف المكونة للدم بعد الولادة هي مصدر الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ بالغ 2. أنها تلعب دورا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية ويمكن أن تستجيب بسرعة للعدوى أو إصابة عن طريق الإفراج عن السيتوكينات الموالية للالتهابات أو المضادة للالتهابات 3. وهكذا الخلايا الدبقية الصغيرة تشمل وحدة قائمة بذاتها في الجهاز العصبي المركزي التي يمكن التلاعب بها لتؤثر على تطور المرض. تطوير أساليب قوية وقابلة للتكرار لعزل وثقافة الأطفال حديثي الولادة أو الكبار خلايا دبقية المهم أن الدراسات المستقبلية.

ومن المعروف الخلايا الدبقية الصغيرة ليكونوا لاعبين الحرجة في عدد من الحالات المرضية في الدماغ. وفي الآونة الأخيرة، رولES آخذة في الظهور للخلايا في نمو الدماغ العادي وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة يبلعم فائض الخلايا العصبية السلف من التلفيف المسنن من الحصين 1 و 4. الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أيضا أن تعدل العديد من الحالات العصبية التي تؤثر على الحبل الشوكي، مثل MS، ألم الأعصاب، وإصابات الحبل الشوكي 5-7. الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي تتفاعل بشكل مختلف مقارنة مع الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ استجابة لإشارات التنشيط 8، 9، ربما بسبب وجود خلافات في البيئة المحلية. وبالتالي فإنه من المهم لإنشاء المناسبة في نظام المختبر للثقافة ودراسة الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي. الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة إنتاج أكثر بكثير من الموالية للالتهابات خلوى أكسيد النيتريك مقارنة مع الخلايا البالغة بعد في التحفيز المختبر مع الإنترفيرون γ أو TNF-A 10،11 مزيد من تسليط الضوء على الحاجة إلى استخدام خلايا بالغة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق بعض الأمراض.

بروتوكول نستخدمها في المختبر لCUlture الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة هو الاختلاف من الأساليب الحديثة التي تستخدم اهتزاز الثقافات الدبقية المختلطة في محاولة لإزالة الخلايا الدبقية الصغيرة من سطح خلية ثقافة قارورة 12. نحن أيضا تصف طريقة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة من البالغين الماوس الحبل الشوكي على أساس بروتوكول وصف لأول مرة من قبل ييب، وآخرون 13. يوفر هذا الأسلوب وسيلة أسرع لخلايا بالغة ثقافة مقارنة البروتوكولات الأخرى المتاحة 14. إعداد الناتج هو 70٪ الخلايا الدبقية الصغيرة، وتتكون النسبة الباقية من الخلايا النجمية. على الرغم من أن نقاء ثقافتنا هو أقل بالمقارنة مع غيرها من وسائل نشر 13، وهذا النظام الثقافة هي مفيدة لإستكشاف دبقية في استجابة الثقافة لمختلف المحفزات تفعيل وكذلك لدراسة الأمراض التي تؤثر بشكل رئيسي في النخاع الشوكي والتي قوية استجابة التهابية هو السمة الرئيسية.

وقد تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التي وصفها ستوني بروك اجلامعاتتاي IACUC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تشريح (يوم 0)

  1. لحث على التخدير لP0-2 الجراء الفأر مع انخفاض حرارة الجسم. مسح رؤوس الجراء مع Kimwipe غارقة في الايثانول 70٪ لتطهير الأنسجة.
  2. إزالة الرؤوس مع زوج من مقص، وذلك باستخدام 4 الجراء في 10 سم لوحة الثقافة. وضع رؤساء في طبق بتري تحتوي العازلة الجليد الباردة هانك.
  3. ترسيخ رؤساء باستخدام ملقط المنحني من خلال تجويف العين وإزالة بعناية الجلد الذي يغطي الجمجمة مع microforceps مستقيم.
  4. إزالة العظام في الجمجمة مع microforceps على التوالي، وذلك باستخدام الحذر لعدم ثقب أو تلف القشور. الطريقة الأكثر فعالية هو لبدء إزالة بدءا بالقرب من المخيخ، والذي يقع عند قاعدة الرأس، كما سيتم تجاهل هذه المنطقة.
  5. إزالة الدماغ مع ملعقة صغيرة، ووضع (4) العقول في طبق بتري الطازجة التي تحتوي على المخزن المؤقت هانك الجليد الباردة.
  6. جميع الخطوات من هذه النقطة على الاستفادة microforceps ويتم تنفيذها تحت ديسيهالمجهر كشن. تبدأ على الجانب البطني من الدماغ، ومرساة الأنسجة من خلال عقد المخيخ وجعل اثنين من الشقوق الصغيرة على جانبي الدماغ المتوسط. يجب الحرص على عدم قطع كل الطريق من خلال الأنسجة، كما تغطي القشور الدماغ المتوسط ​​في هذه المنطقة.
  7. ندف بلطف المخ الأوسط والمخيخ في قطعة واحدة من القشور اثنين. ينبغي للقشرات اثنين تشكيل شكل مقعر.
  8. فصل القشور اثنين وتوجيه القشرة واحدة مع الجانب الإنسي فوق لمزيد من تشريح. الحصين يمكن أن يكون صعبا للاحتفال، ولكن يقع مقابل من البصلة الشمية الذي يظهر على شكل عقيدات صغيرة على نهاية مدببة من القشرة.
  9. إزالة الحصين، الذي يحتوي على شكل الهلال. الوجه القشرة أكثر لعرض الجانب الظهري.
  10. باستخدام البصلة الشمية كنقطة انطلاق، وإزالة جميع السحايا والبصلة الشمية نفسها من القشرة.
  11. يجب وضع قشرات تشريح في أنابيب مخروطية 15 مل مع 14 مل من العقيدد ملحي هانك مخزنة على الجليد.

2. الثقافة الخلية (يوم 0)

  1. ما قبل معطف 10 سم الأنسجة أطباق الثقافة مع 5 ميكروغرام / مل من بولي-D-يسين (PDL) المخفف في الماء تعقيمها لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. نضح PDL، وألواح يغسل مرة واحدة مع الماء تعقيمها. لوحة الجافة تحت الأشعة فوق البنفسجية في نسيج الثقافة هود لمدة 20 دقيقة. هذه الخطوة يجب أن يؤديها قبيل عملية تشريح.
  3. العازلة نضح هانك من الأنابيب التي تحتوي على القشور من 4 أدمغة كل، وتطبيق 4 مل من 1X التربسين / EDTA الحل، يسحن الأنسجة مع P1000 طرف، وأنابيب مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 4 مل من وسائل الاعلام دبقية كاملة في أنبوب لوقف عملية الهضم الأنزيمية، ومزيج، وتدور باستمرار في محتويات دورة في الدقيقة 1.5K لمدة 5 دقائق.
  5. نضح طاف وتكرار غسل مع 4 مل من وسائل الإعلام كاملة. Resuspend الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام دبقية كاملة (DMEM مع FBS 10٪، 1٪ البيروفات الصوديوم، 0.08٪ جنتاميسين)، ومرشح من خلال 40 الصغرىن شبكة مصفاة الخلية.
  6. لوحة في مناطق ذات كثافة من 8 القشور لكل 10 مل في 10 سم نسيج لوحة الثقافة والمكان في نسيج الثقافة الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (انظر الخلايا الدبقية الصغيرة بروتوكول الكبار).

(يوم 3)

  1. تغيير وسائل الإعلام في جميع الأطباق ثقافة الخلية مع وسائل الاعلام دبقية كاملة.

(اليوم 10)

  1. إضافة 400 ميكرولتر من 60 ملم في HBSS يدوكائين (لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة) في المتوسط ​​من 10 سم لوحات زراعة الأنسجة واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة.
  2. جمع وسائل الإعلام / التعليق خلية من لوحة، ويغسل مرة واحدة مع لوحة العازلة هانك. جمع غسل العازلة لاسترداد ما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة.
  3. إضافة 5 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) إلى تعليق خلية إلى تركيز النهائي من 50 ميكرومتر أو في 1/100 التخفيف.
  4. تدور باستمرار تعليق خلية في 1،000 x ج (1،500 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق في 1 مل DMEM مع FBS 1٪.
  5. عد عدد الخلايا قابلة للحياة (وفقا مي الكبارcroglia 3.1/3.2) والخلايا الانقسام في لوحات زراعة الأنسجة في كثافة التجريبية المطلوب. ويتم حصاد ما يقرب من 1X10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة من سم لوحة تحتوي على 10 القشور من 4 العقول. لالمناعي، فمن المستحسن كثافة 2.5x10 4 خلايا لكل 18 مم ساترة.
  6. سماح لا تقل عن 24 ساعة لخلايا دبقية للعودة بالكامل إلى متشعبة، دولتهم يستريح قبل استخدامها.

نص البروتوكول: (الكبار الخلايا الدبقية الصغيرة)

1. مجموعة الأنسجة

  1. الأنسجة معطف لوحات ثقافة مع بولي-D-يسين (PDL) لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تغسل الصحون مرة واحدة مع الماء تعقيمها مباشرة قبل الاستعمال.
  2. الموت ببطء الماوس عن طريق CO 2 الخنق والتأكد من أن القتل الرحيم كاملة. تنظيف منطقة الحبل الشوكي مع الايثانول 70٪.
  3. باستخدام زوج من مقص قطع الجلد على الجزء العلوي من النخاع الشوكي، ثم انتقل إلى قطع الحبل الشوكي خارج المنطقة من T1 إلى T12. قطعما تبقى العضلات الخروج من الجانبين من الحبل الشوكي.
  4. خفض ببطء فقرات باستخدام microscissors كما كنت عقد بلطف النخاع الشوكي مع أطراف أصابعك. يجب الحرص على عدم ثقب النخاع الشوكي والأنسجة لينة جدا. استخراج ببطء النخاع الشوكي باستخدام microforceps.
  5. غمر الحبل الشوكي في طبق بتري تحتوي HBSS الجليد الباردة. باستخدام مجهر الضوء إزالة جميع السحايا مرئية باستخدام microforceps
  6. قطع الحبل الشوكي إلى أجزاء مستعرضة صغيرة بما يكفي لتوليد عدة شظايا. سمك شظايا لا ينبغي أن يكون أكثر من 2 ملم من أجل تسهيل عملية الهضم كفاءة. نقل القطع الحبل الشوكي إلى 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على 1 مل HBSS الجليد الباردة. الحفاظ على أنبوب على الجليد حتى الخطوة الهضم.

2. هضم الأنسجة

  1. نضح HBSS من أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على أنسجة الحبل الشوكي. يجب الحرص على عدم نضح أي قطعة من النسيج.
  2. إضافة 1 مل من التربسين (2.5 ز / L المشع الخنزيري التربسين و 0.2 غرام / لتر EDTA في HBSS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. لوقف عملية الهضم وإزالة التربسين وإضافة 3 مل من الابتدائية المتوسطة الخلايا الدبقية الصغيرة التي تحتوي على مصل لوقف عملية الهضم الأنزيمية.
  4. الماصة صعودا وهبوطا لإزاحة الأنسجة. تعليق تصفية الخلية باستخدام 40 ميكرومتر مصفاة الخلية.

3. عد الخلايا وتصفيح

  1. مزيج حجم مساو من تعليق خلية وحل دابي.
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  3. لوحة في مناطق ذات كثافة بين 5 7x10 5 خلية / مل في PDL المغلفة 35 × 10 ملم الأطباق. الطلاء في مناطق ذات كثافة أقل منع نمو الخلايا حتى عندما تم زراعة الخلايا في 12 لوحات جيدة والتي لها مساحة أصغر مقارنة مع 35 × 10 ملم الأطباق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد مثال من خلايا دبقية يستريح والمفعلين يمكنهم في الشكل 1. تم تصور والخلايا الدبقية الصغيرة 24 ساعة بعد الطلاء (الشكل 1A) ويحمل متشعبة مورفولوجيا (يستريح). التعرض للكاشف فتيلة، عديد السكاريد الشحمي البكتيرية (LPS) يؤدي إلى إحداث تغييرات في التشكل دبقية كما تصبح الخلايا تفعيلها (1B الشكل).

ويرد مثال من عد الخلايا للتصفيح في الشكل 2. ونظرا لوجود حطام خلية، وأضيف دابي Fluoromount (بدلا من التريبان الأزرق) إلى حجم مساو من تعليق خلية ووضعها في عدادة الكريات لخلية العد كما هو موضح في 4 و 13. تم تصور الخلايا إيجابية دابي باستخدام المجهر الفلورسنت. استخدام الإعداد حقل مشرق سهلت على عدد دقيق للخلايا الحاضر (الشكل 2). تم الحصول على حوالي 7x10 5 خلايا لكل الحبل الشوكي الماوس.

محتوى "> كانت مطلية الخلايا في PDL المغلفة 35 × 10 مم أطباق زراعة الأنسجة. وجدناه هو أن طلاء مع PDL خطوة حاسمة، كخلايا لم تلتزم / تنمو إلا إذا كانت لوحات مغلفة. الخلايا الدبقية الصغيرة نعلق بشكل كامل إلى لوحة الثقافة بعد حوالي يومين في الثقافة (الشكل 3). الحبل الشوكي للفئران MacGreen، والذي تم استخدامه GFP صريح تحت سيطرة الخلايا الدبقية الصغيرة / بلعم المروج CSF-1R، لهذه التجربة.

الشكل 1
الشكل 1. صورة الممثل من الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة بعد يومين في الثقافة. ومثقف الخلايا الدبقية الصغيرة من P0 C57/BL6 الجراء الماوس، ومطلي coverslips على غير المصقول في مناطق ذات كثافة من 2.5 × 10 5 خلية / مل. أ، ج. الخلايا الدبقية الصغيرة غير المعالجة التي عادت إلى يستريح، دولة متشعبة، ب، د . الخلايا الدبقية الصغيرة التعامل مع 100 نانوغرام / مل LPS لمدة 4 ساعة وتظهر المنشط، شكل أميبية؛ Iba1 (الأخضر وعلامة محددة لالضامة / الدبقية الصغيرة بروتين سطح الخلية) تم استخدامها لتصور الخلايا، بينما تم استخدام الصور مجال مشرق لل إظهار السكان الخلية بشكل عام. وقد استخدم دابي Fluoromount لتصور النوى وتشير إلى نقاء الثقافة.

الشكل 2
الشكل 2. كان العد الخلية. دابي Fluoromount مختلطة مع حجم مساو من تعليق خلية ووضعها في عدادة الكريات. نحن الجمع بين brightfield والإعداد مضان لتصور الخلايا إيجابية دابي والشبكة عدادة الكريات لعدد خلايا دقيقة.

"FO: SRC =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3.jpg "/>
الشكل (3). صور الممثل من الكبار الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي بعد يومين في الثقافة. أ. تم استخدام الحبل الشوكي لفأر MacGreen لهذا الإجراء الثقافة. كانت مطلية الخلايا في PDL المغلفة 35 × 10 مم طبق زراعة الأنسجة في مناطق ذات كثافة من 7x10 5 خلية / مل. ب. صورة حقل مشرق من الخلايا الدبقية الصغيرة الحبل الشوكي بعد يومين في الثقافة. الخلايا الدبقية الصغيرة (الأسهم الزرقاء) والخلايا النجمية (الأسهم الحمراء) وترد. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الدبقية الصغيرة تعدل CNS السير العادي فضلا عن الاستجابات الالتهابية لمختلف الأمراض. وقد تورط إعادة عرض متشابك وظيفية من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في الحفاظ على التوازن الطبيعي للدماغ 15. خلال تتالي العصبية يشاركون في إزالة الخلايا العصبية السلف من التلفيف المسنن من الحصين 4، 16. وبالتالي، فمن الضروري وضع نظام الثقافة التي لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة والكبار، التي سوف تغطي رقعة واسعة من التنمية ومرحلة البلوغ، في جميع أنحاء التي لها وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة منفصلة متعددة. وقد أوجزنا طريقة سريعة وفعالة لثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي والدماغ الكبار حديثي الولادة. كنا قادرين على الحصول على الاستعدادات خلية في الكبار التي كانت 70٪ مع الخلايا الدبقية الصغيرة النسبة الباقية تتكون من الخلايا النجمية، ونقاء محضرات دبقية حديثي الولادة تقترب من 100٪.

ونظرا لدور ثاتي الخلايا النجمية وفي تنظيم الدولة تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة 17-19، فمن المهم لتحسين ظروف التربية لتحسين نقاء الثقافة. وإن كان الجمع بين تعليق الخلية مع حجم مساو من دابي Fluoromount يسمح لعدد خلايا دقيقة، فإنه ليس من الممكن التمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة من أنواع الخلايا الأخرى باستخدام هذا الأسلوب. لتحسين نقاء إعداد دبقية الكبار، ويمكن تحضين Dynabeads GFP المغلفة مع تعليق الخلية المستمدة من MacGreen الفئران، التي بالفعل صريحة GFP 20 خلايا الدم النخاعي. واقتراح آخر يتمثل في لوحة تعليق الخلية المختلطة في أطباق الثقافة التي لم يتم المغلفة سابقا مع PDL لمنع التعلق نجمي 13. ومع ذلك، فقد وجدنا أن لا تنمو الخلايا على لوحة ما لم تكن قد تم المغلفة سابقا، والتي في أيدينا هي التي تنطبق على كل من الخلايا حديثي الولادة والكبار.

العديد من البروتوكولات التي تصف طرق ISOLأوجه وطلي من الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية إما من الفئران أو الماوس أنسجة المخ الاستفادة تهز الثقافات الدبقية مختلطة لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة، وبالتالي الحصول على السكان تنقيته للتجارب المصب 12. بروتوكول لدينا يختلف بشكل ملحوظ في معظم باستثناء خطوة والهز، والتركيز بدلا من ذلك على تنقية من السكان دبقية فقط من خلال ظروف زراعة معاير بدقة. في تجربتنا، والهز الثقافات الدبقية مختلطة من أجل إزالة الخلايا الدبقية الصغيرة غير فعالة، ولكن لديه عيب كبير واحد - حقيقة أن الخلايا الدبقية الصغيرة اهتزت يستغرق اياما كثيرة للعودة إلى كامل يستريح مورفولوجيا 12. قد يكون هذا إشكالية بالنظر إلى أن تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة لديك تشكيل جانبي خلوى مختلفة إلى حد كبير 21. بروتوكول لدينا، في حين أخذ وقتا أطول قليلا للحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة النقية، ويحافظ على الخلايا في حالة الراحة طوال الوقت. كما هو الحال مع الكبار الإعدادية التي نوقشت في الفقرة التالية، ولكن العائق واحد من أسلوبنا هو possiبيليتي من التلوث صغيرة من أنواع الخلايا الأخرى، وهي الخلايا النجمية.

أسلوبنا لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الكبار اختلافا كبيرا من قبل الإيجاد الأساليب. العديد من البروتوكولات ندعو إلى استخدام الطرد المركزي المتدرج الكثافة (Percoll) فضلا عن استخدام التدفق الخلوي للحصول على السكان دبقية نقي 22. في أسلوبنا في خلق ثقافة دبقية مستقرة من الحبل الشوكي الكبار ونحن لا تستخدم إما تقنية، الأمر الذي يجعل لوقت أقل بكثير بروتوكول طويلا ومعقدا للباحث أن يتبع. في حين أن الغالبية العظمى من الاستعدادات دبقية الكبار يأتي من أنسجة المخ، ويتكون الحبل الشوكي من أنواع الخلايا نفسها - وبالتالي لدينا بروتوكول يعرض مقارنة عادلة إلى الأساليب المذكورة سابقا 22. واحد المقايضة في بروتوكول لدينا هو إعداد دبقية أقل قليلا نقية، وتتألف من 70٪ الخلايا الدبقية الصغيرة، مع جزء المتبقي من الخلايا التي يتم معظمها من أوريجي نجمين. يحتمل أن يتم التغلب على هذا التناقض باستخدام خطوة إضافية من العزلة من أكثر الخلايا الدبقية الصغيرة النقي باستخدام نوع من الخلايا علامات محددة جدا من سلالة دبقية مثل IBA-1 و F4/80 مترافق إلى حبات مغناطيسية.

معظم الدراسات التي تقيم دور الخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض العصبية التي تؤثر أجريت النخاع الشوكي باستخدام خلايا من الدماغ حديثي الولادة، ورغم أن هذا هو نهج متين للرد على أسئلة حول دور لالخلايا الدبقية الصغيرة في التطور الطبيعي وكذلك الأمراض التي تؤثر على الدماغ على وجه التحديد، شعرنا أن أسلوب أكثر تحديدا كان لابد من تأسيس لدراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي الكبار. لدينا طريقة حديثي الولادة هو وسيلة فعالة جدا للرد على معظم أسئلة بخصوص الأداء الطبيعي للدماغ وكذلك في بعض الحالات المرضية، وطريقة الكبار هو بديل جيد لاستخدام الخلايا حديثي الولادة لمثل هذه الدراسات نظرا للتقلب في الاستجابة المناعيةق بين الخلايا الدبقية الصغيرة حديثي الولادة والكبار والخلايا الدبقية الصغيرة بين من الدماغ والحبل الشوكي 6-9. الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم الحصول عليها من كلا الأساليب المذكورة هي أيضا مناسبة لفي المختبر دراسات الثقافة المشتركة (ونحن في المقام الأول ثقافة لهم مع الخلايا العصبية أو الخلايا قليلة التغصن في مختبرنا) التي تتناول تأثير الخلايا الدبقية الصغيرة على أنواع الخلايا الأخرى وكذلك استجابة حديثي الولادة والكبار دبقية إلى تفعيل المحفزات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونود أن نشكر أعضاء المختبر Tsirka لنصائحهم وتعليقات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل R01NS42168 إلى المجموعة، 12PRE12060489 إلى RB، وهو NSF-3MT IGERT وتيرنر أطروحة الزمالة إلى LT، و NSF-3MT IGERT إلى JCN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA, 5mM Invitrogen 15567-028
Lidocaine, 60mM Sigma L-5647
Trypan Blue Sigma T8154
Trypsin/EDTA Cellgro 25-052-CI
DMEM, 1X Cellgro 10-017
Sodium Pyruvate Cellgro 25-000-Cl
Gentamycin Sulfate Biowittaker 17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish Falcon 353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml Dilute 1:20
HBSS, 1X Cellgro 20-023-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
  3. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
  4. Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
  6. Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. 383087 (2011).
  7. Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
  8. Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
  9. Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
  10. Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
  11. Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
  12. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
  13. Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
  14. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
  15. Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
  16. Tremblay, M. -È, Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
  17. DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
  18. Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
  19. Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
  20. Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
  21. Ekdahl, C. Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
  22. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics