신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

1Program in Neuroscience, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Sciences, Stony Brook University, 3Program in Molecular and Cellular Pharmacology, Stony Brook University
* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

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Bronstein, R., Torres, L., Nissen, J. C., Tsirka, S. E. Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System. J. Vis. Exp. (78), e50647, doi:10.3791/50647 (2013).

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Abstract

미세 아교 같은 같은 CNS 개발의 성숙, 다발성 경화증, 척수 손상 등의 생리 및 병리 과정에서 중요한 역할을 가지고, 중추 신경계 (CNS)의 주민 대식 세포와 같은 호텔입니다. 미세 아교 세포가 활성화하고 MS 또는 뇌졸중으로 인한 허혈성 뇌 손상에서 볼 축삭 손상과 같은 신경 손상이나 자극에 의​​해 행동을 모집 할 수 있습니다. CNS의 이러한 면역 멤버도 아닌 병적 인 상태에서 시냅스 가소성의 역할을하는 것으로 생각된다. 우리는 다른 CNS 세포의 종류와 세포 배양 파편의 존재 등의 혼란 변수를 최소화하면서 가능한 세포 수를 극대화하기위한 것이다 신생아 및 성인 조직에서 배양 미세 아교 세포에 대한 프로토콜을 사용합니다. 우리는 전체 프로세스가 가능하고 재현하게 크고 쉽게 뚜렷한 CNS 구성 요소 (예를 들어, 피질 척수 세그먼트), 사용합니다. 성인 세포의 사용많은 병리는 주로 출생 후 척수에 영향을 미칠 공부로들, 신생아 뇌 미세 아교 세포의 사용에 적합한 대안이다. 이러한 문화 시스템은 또한 어느 억제 또는 아교 활성화를 촉진 할 수 화합물의 효과를 테스트하는 데 유용합니다. 미세 아교 활성화가 성인 CNS의 질병의 결과를 형성 할 수 있기 때문에, 신생아 및 성인 미세 아교 세포는 배양하고 연구 할 수있는 생체 시스템이 필요하다.

Introduction

미세 아교 세포에 가장 가까운 구조와 기능 1 말초 대식 세포를 닮은 CNS의 주민 면역 세포입니다. 그것은 최근 출생 미세 아교 세포가 원시 골수 전구 세포에서 파생 출생 조혈 전구 세포는 성인 뇌의 2 미세 아교 세포의 근원이라는 기존 개념을 upending, 배 발생의 여덟 번째 날 이전에 생성 된 것을 증명하고있다. 그들은 여러 신경 질환의 주요 역할을 담당하고 신속하게 프로 염증 또는 항 염증성 사이토 카인에게 3 출시하여 감염이나 부상에 응답 할 수 있습니다. 따라서 미세 아교 세포는 질병의 진행에 영향을 조작 할 수 CNS의 독립형 장치를 포함. 분리하는 강력하고 재현 방식과 문화 신생아 또는 성인 미세 아교 세포를 개발하는 것은 미래의 연구에 중요합니다.

미세 아교 세포는 뇌 병변의 수가 중요한 선수로 알려져있다. 더 최근에, ROLES는 해마 1, 4의 이가있는 이랑의 미세 아교 세포 phagocytose 초과 신경 전구 세포의 정상적인 두뇌 발달과 기능에있는 셀에 등장하고있다. 미세 아교 세포는 또한 MS와 같은 척수에 영향을주는 여러 가지 신경 학적 상태, 신경 병증 성 통증, 척수 손상 5-7를 조절 할 수 있습니다. 척수 미세 아교 세포는 지역 환경의 차이 때문인 활성화 신호를 8, 9,에 대한 응답으로 뇌의 미세 아교 세포에 비해 다르게 반응합니다. 따라서 문화 체외 시스템에 적절한 설정 및 척수의 미세 아교 세포를 연구하는 것이 중요합니다. 신생아 미세 아교 세포는 IFN-γ 나 TNF-10,11 특정 질병의 맥락에서 미세 아교를 공부하는 성인 세포를 사용하는 필요성을 강조 더.와 생체 자극 후 성인 세포에 비해 프로 염증성 사이토 카인 질소 산화물의 훨씬 더 생산

우리는 세제곱에 실험실에서 채용 프로토콜lture 신생아 미세 아교 세포는 세포 배양 플라스크 (12)의 표면에서 미세 아교를 제거하기위한 노력의 일환으로 혼합 된 아교 문화의 흔들림 활용 최근 방법의 변형입니다. 우리는 또한 첫 번째 깨갱 거리는 소리, (13)에 의해 기술 된 프로토콜을 기반으로 성인 마우스의 척수에서 문화 미세 아교로하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 다른 사용 가능한 프로토콜 14에 비해 문화 성인 세포에 빠른 방법을 제공합니다. 그 결과 준비는 70 % 미세 아교이며 나머지 비율은 성상 세포로 구성되어 있습니다. 우리 문화의 순도가 다른 발표 방법 13에 비해 낮은 있지만,이 문화 시스템은 주로 척수에 영향을 미치는 질병의 연구를위한 다양한 활성화 자극뿐만 아니라 문화의 응답에 아교를 탐험하는 데 유용합니다 강한되는 염증 반응이 주요 기능입니다.

설명 된 모든 프로토콜은 스토니 브룩 Universi에 의해 승인되었습니다타이 IACUC.

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Protocol

1. 해부 (0 일)

  1. 저체온증을 가진 P0-2 마우스 새끼로 마취를 유도. 조직을 소독하기 위해 70 % 에탄올에 담가 Kimwipe와 새끼의 머리를 닦습니다.
  2. 10cm 배양 접시 당 4 새끼을 사용하여 가위로 머리를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 행크의 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 머리를 놓습니다.
  3. 눈 소켓을 통해 곡선 집게를 사용하여 머리를 고정하고 조심스럽게 똑바로 microforceps와 두개골을 덮고있는 피부를 제거합니다.
  4. 구멍을 뚫거나 손상 피질을에주의를 사용하여 직선 microforceps와 두개골 뼈를 제거합니다. 가장 효과적인 방법은이 영역이 삭제됩니다로서, 머리의 기지에 위치한 소뇌 근처부터 제거를 시작하는 것입니다.
  5. 작은 주걱으로 두뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 행크의 버퍼를 포함하는 새로운 배양 접시에 (4) 머리를 놓습니다.
  6. 이 시점에서 모든 단계 microforceps를 활용들이 상자에서 수행됩니다ction의 현미경. 두뇌의 복부 측면에서 시작 소뇌을 잡고 조직을 고정하고 중뇌의 양쪽에 두 개의 작은 절개를합니다. 피질이 지역에서 중뇌 덮개로 조직을 통해 모든 방법을 절단하지 않도록주의해야합니다.
  7. 조심스럽게 두 피질에서 한 조각의 중뇌와 소뇌를 애타게. 두 피질은 오목한 모양을 형성한다.
  8. 자세한 해부 최대 내측에 두 피질과 방향을 하나의 외피를 분리합니다. 해마 관찰하기 어려울 수 있지만 피질의 뾰족한 끝 부분에 작은 결절로 나타납니다 후각 망울의 맞은 편에 위치해 있습니다.
  9. 초승달 모양을하고 있습니다 해마를 제거합니다. 등의 측면을 볼 수 피질을 뒤집어.
  10. 시작 지점으로 후각 전구를 사용하여, 모든 수막과​​ 피질에서 후각 망울 자체를 제거합니다.
  11. 해부 피질로는 Col의 14 ML과 15 ML 원뿔 튜브에 배치해야얼음 D 행크의 버퍼 식염수.

2. 세포 배양 (0 일)

  1. 37 ℃에서 3 시간 동안 멸균 물에 희석 폴리-D-라이신 (PDL) 5 ㎍ / ㎖로 미리 코트 10cm 조직 문화 요리
  2. 멸균 물을 한 번 PDL 및 세척 접시를 대기음. 20 분 조직 문화 후드에서 UV 하에서 건조 판. 이 단계는 해부 과정 직전에 수행해야합니다.
  3. 4 두뇌에서 각각 피질을 포함하는 튜브의 흡인 행크의 버퍼, 1X 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 4 ML을 적용, ° C 배양기 15 분 37 P1000 팁, 장소 튜브로 조직을 씹다.
  4. 소화 효소, 혼합을 중지하고 5 분 1.5K rpm에서 내용을 스핀 다운 튜브 당 전체 미세 아교 미디어의 4 ML을 추가합니다.
  5. 뜨는을 대기음하고 완벽한 미디어의 4 ml의 세척을 반복합니다. 40 마이크로를 통해 10 완전한 미세 아교 미디어의 ML (10 % FBS와 DMEM, 1 %의 나트륨 피루 베이트, 0.08 %의 젠타 마이신), 및 필터에있는 세포를 resuspendN 메쉬 셀 스트레이너.
  6. 37 조직 문화 인큐베이터에서 10 센티미터 조직 배양 플레이트와 장소에 10 ㎖ 당 8 피질의 밀도에 플레이트 ° C와 5 % CO 2 (성인 소교 세포 프로토콜을 참조하십시오.)

(3 일)

  1. 전체 미세 아교 미디어 모두 세포 배양 접시에 용지를 변경합니다.

(주 10)

  1. 60 mm의 400 μl를 10 cm 조직 문화 판의 중간과 15 분 동안 실온 (RT)에 배양에 HBSS (미세 아교 세포를 분리)에 리도카인을 추가합니다.
  2. 판에서 용지 / 세포 현탁액을 수집하고, 행크의 버퍼를 한 번 접시를 씻으십시오. 남아있는 미세 아교 세포를 복구하는 세척 버퍼를 수집합니다.
  3. 50 μM이나 1 / 100 희석 최종 농도로 세포 현탁액을 5 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0)을 추가합니다.
  4. 5 분 1,000 XG (1,500 RPM)에서 세포 현탁액을 스핀 1 % FBS와 1 ML DMEM에 다시 일시 중지합니다.
  5. (생균 수를 세는 성인 미 당croglia 3.1/3.2) 및 원하는 실험 밀도 조직 배양 접시에 세포를 분할. 약 1X10 6 미세 아교 세포는 4 뇌에서 피질을 포함하는 10cm 플레이트에서 수확된다. 면역 들어, 18mm의 coverslip에 당 2.5x10 4 세포의 밀도가 권장됩니다.
  6. 미세 아교 세포의 적어도 24 시간을 완전히 사용하기 전에 자신의를내는, 휴식 상태로 돌아갑니다 수 있습니다.

프로토콜 텍스트 (성인 소교 세포)

1. 조직 컬렉션

  1. 37 3 시간 동안 폴리-D-라이신 (PDL)과 코트 조직 배양 플레이트 ° C 또는 하룻​​밤에 ° C. 멸균 물을 한 번 사용하기 직전에 접시를 씻으십시오.
  2. CO 2 질식 및 안락사가 완료되었음을 확인할하여 마우스를 안락사. 70 % 에탄올로 척수 영역을 청소합니다.
  3. 가위를 사용하면 척수의 위쪽에 피부를 잘라 한 후 지역 T1에서 T12로 척수를 잘라 진행합니다. 절단척수의 양쪽의 나머지 근육 해제.
  4. 천천히 부드럽게 손가락으로 척수를 누르고있는 microscissors를 사용하여 척추를 잘라. 조직이 매우 소프트로 구멍 척수하지 않도록주의해야합니다. 천천히 microforceps을 사용하여 척수 압축을 풉니 다.
  5. 얼음처럼 차가운 HBSS를 포함하는 배양 접시에있는 잠수함 척수를. 광학 현미경을 사용하여 microforceps을 사용하여 모든 눈에 보이는 수막을 제거
  6. 여러 단편을 생성 할 정도로 작은 횡단 세그먼트로 척수를 잘라. 조각의 두께는 효율적인 소화를 촉진하기 위해 2mm 이하이어야한다. 1 ML 얼음처럼 차가운 HBSS를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 척수 조각을 전송합니다. 소화 단계까지 얼음에 튜브를 유지합니다.

2. 조직의 소화

  1. 척수 조직을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에서 HBSS를 대기음. 조직의 조각을 대기음하지 않도록주의하십시오.
  2. 트립신 (2 1 ML을 추가합니다.5g / L 조사 돼지의 트립신과 HBSS 0.2 g / L EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))과는 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
  3. 소화 트립신을 제거하고 소화 효소를 중단하는 혈청이 포함 기본 미세 아교 세포 배지 3 ㎖를 추가 중지합니다.
  4. 피펫 아래 조직을 쫓아합니다. 40 μm의 셀 스트레이너를 사용하여 세포 현탁액을 필터링합니다.

3. 셀 카운트 및 도금

  1. 세포 현탁액 및 DAPI 용액의 같은 양을 섞는다.
  2. 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
  3. 5 7X10 5 세포 / PDL-코팅 35 X 10mm 요리 ML 사이의 밀도 접시. 세포는 35 X 10mm 요리에 비해 작은 영역을 가지고 12 잘 접시에서 배양 한 경우에도 낮은 밀도에서 도금 세포의 성장을 방해.

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Representative Results

휴식 및 활성화 미세 아교 세포의 예는 그림 1에 표시됩니다. 미세 아교 세포는 도금 후 24 시간을 시각화 (그림 1a)과를내는 (휴식) 형태를 전시 하였다. 프라이밍 시약에 노출되면 세포와 같은 아교 형태의 변화 그람 음성 세균의 세포벽 성분 인 lipopolysaccharide (LPS) 결과 (그림 1b)가 활성화 될.

도금 세포를 계산의 예는 그림 2에 표시됩니다. 세포 파편의 존재로 인해, DAPI Fluoromount은 (대신 판 블루)의 세포 현탁액의 동일한 볼륨에 추가 및 4에 설명 된대로 계산 셀 13 혈구에 배치되었다. DAPI 양성 세포는 형광 현미경을 사용하여 시각화 하였다. 현재 셀 (그림 2)의 정확한 수를 촉진 시야 설정에 사용합니다. 5 7X10 주위 세포는 마우스의 척수 당 하였다.

내용은 "> 세포는 PDL-코팅 35 X 10mm 조직 문화 요리에 도금되었다. 우리는 세포 부착 / 플레이트 코팅 하였다 않으면 성장하지 않았다로 PDL와 그 코팅, 중요한 단계 발견했다. 소교 세포가 완전히 배양 용기에 부착 후 약 문화 이틀 (그림 3). 미세 아교 세포 / 대 식세포 프로 CSF-1R의 통제하에 표현 GFP는이 실험에 사용 된 MacGreen 쥐의 척수.

그림 1
그림 1. 문화의 두 일 후에 신생아 미세 아교 세포의 대표 이미지. 소교 세포는 P0 C57/BL6 마우스 새끼에서 배양하고, 2.5 × 10 5 세포 / ㎖의 농도로 코팅 coverslips는 도금 한되었다. 돌아왔다, C. 처리되지 않은 미세 아교 세포 휴식,를내는 상태, B, D . 미세 아교 세포는 4 시간 동안 100 NG / ML LPS로 처리 및 활성화, 아메바 모양을 보여, 시야 이미지에 사용되는 동안 Iba1가 (녹색, 대 식세포 / 미세 아교 세포 표면 단백질에 대한 특정 마커) 세포를 시각화하는 데 사용되었다가, 전체 세포 인구를 보여줍니다. DAPI Fluoromount은 핵을 시각화하고 문화의 순도를 표시하는 데 사용되었다.

그림 2
그림 2. 셀 계산. DAPI Fluoromount 세포 현탁액의 동일한 볼륨과 혼합 혈구에 배치했다. 우리는 시야 및 형광 설정 DAPI 양성 세포를 시각화하고 정확한 세포 수의 혈구 그리드를 결합했다.

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그림 3. 문화의 두 일 후에 성인 척추 미세 아교 세포의 대표 이미지. . MacGreen 마우스의 척수 문화 절차를 사용 하였다. 세포는 7X10 5 세포 / ㎖의 농도로 PDL-코팅 35 X 10mm 조직 배양 접시에 도금 하였다. B는. 척수 미세 아교 세포의 시야 이미지는 문화 이틀. 미세 아교 세포 (파란색 화살표)와 성상 세포는 (빨간색 화살표) 표시됩니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

미세 아교 세포는 중추 신경계에게 정상적인 기능뿐만 아니라 다양한 병리에 염증 반응을 조절. 미세 아교 세포에 의하여 기능적인 시냅스 리모델링 정상적인 뇌의 항상성 (15)의 유지 보수에 연루되어있다. 신경성 놓기 동안 그들은 해마 4, 16 이가있는 이랑의 신경 전구 세포의 정리에 참여할 수 있습니다. 따라서, 미세 아교 세포가 여러 개별 기능을 갖고 걸쳐 개발 및 성인의 광대 한 넓은 길을 다룰 것이다 신생아와 성인 미세 아교를 공부하는 문화 시스템을 개발하는 것이 필요하다. 우리는 성인 척수 및 신생아 뇌 문화 미세 아교 세포에 신속하고 효율적인 방법을 설명했다. 우리는 70 % 성상 세포로 구성된 나머지 비율이 미세 아교 세포와 100 %에 접근 신생아 미세 아교 조제품의 순도했다 어른 세포의 준비를 얻을 수 있었다.

역할 그쪽으로 주어진T는 성상 세포는 미세 아교 17-19의 활성화 상태를 조절, 그것은 문화의 순도를 향상시키기 위해 배양 조건을 최적화하는 것이 중요했다. DAPI Fluoromount의 동일한 볼륨 세포 현탁액을 결합하여 정확한 세포 수에 대한 수 있지만,이 방법을 사용하여 다른 세포 유형에서 미세 아교 세포를 구별 할 수 없습니다. 성인 미세 아교 준비의 순도를 향상시키기 위해 GFP 코팅 Dynabeads 누구의 골수 세포가 이미 표현 GFP 20 MacGreen 생쥐에서 파생 된 세포 현탁액 배양 할 수 있습니다. 또 다른 제안은 판에 이전 성상 첨부에게 13을 방지하기 위해 PDL 코팅되지 않은 배양 접시에있는 혼합 세포 현탁액 될 것이다. 그러나, 우리는 이전에 우리 손에 신생아와 성인 세포 모두에 적용 할 수있는 코팅되지 않는 한 어떤 세포가 접시에 성장할 것으로 나타났습니다.

ISOL하는 방법을 설명하는 많은 프로토콜어느 쥐 또는 마우스 뇌 조직에서 ATION 및 기본 미세 아교 세포의 도금 미세 아교를 분리함으로써 하류 실험 12 정제 인구를 얻기 위해 혼합 된 아교 문화를 흔들어 사용한다. 우리 프로토콜은 진동 단계를 제외한 대부분의 눈에 띄게 다르다, 대신 정확하게 적정 배양 조건을 통해 미세 아교 만 인구의 정화에 집중. 우리의 경험에서 미세 아교를 제거하기 위해 혼합 된 아교 문화를 흔드는 것이 효과적이지만, 한 가지 중요한 단점을 가지고 - 흔들어 미세 아교 세포는 완전한 휴식 형태 12로 돌아가려면 며칠이 걸릴 있다는 사실. 이 활성화 된 미세 아교 세포는 상당히 다른 사이토 카인 프로필 21을 가지고 주어진 문제가 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은, 순수한 미세 아교를 얻기 위해 약간 더하면서, 내내 휴식 상태로 세포를 유지합니다. 다음 단락에서 논의 된 성인 준비와 마찬가지로, 우리의 방법 중 하나 단점은 possi입니다즉 다른 세포 유형, 성상 세포의 작은 오염 bility.

배양 성인 미세 아교 세포에 대한 우리의 기술 방법을 기존과 상당히 다릅니다. 대부분의 프로토콜은 밀도 기울기 원심 분리 (Percoll)뿐만 아니라 순수 미세 아교 인구 22를 얻기 위해 유동 세포 계측법의 사용의 사용을 요구한다. 성인 척수에서 안정적인 미세 아교 문화를 만드는 우리의 방법에서 우리는 따라야하는 연구자에 대한 상당히 적은 시간이 소요되는 복잡한 프로토콜하게하거나 기술을 사용하지 않습니다. 성인 미세 아교 준비의 대부분은 뇌 조직에서 온 있지만, 척수는 같은 종류의 세포로 구성되어 있습니다 - 따라서 우리의 프로토콜은 앞에서 설명한 방법 22 공정한 비교를 제공합니다. 우리의 프로토콜에서 하나의 단점은 성상 교세포 origi의 대부분이되는 세포의 나머지 부분과, 70 %의 미세 아교 세포로 구성된 약간 덜 순수한 미세 아교 준비하다N. 이 차이는 잠재적으로 자석 구슬을 결합 이바-1과 F4/80로 미세 아교 혈통의 아주 특정한 세포 유형 마커를 사용하여보다 순수한 미세 아교 세포의 분리의 추가 단계를 사용하여 극복 할 수있다.

이는 정상적인 발전에 미세 아교 세포의 역할에 대한 질문에 대답뿐만 아니라 영향을 미치는 병리위한 견고한 접근하는 동안 척수 신생아 뇌 세포를 사용하여 수행하고, 한 영향을 미치는 신경 질환에서 미세 아교 세포의 역할을 평가 대부분의 연구 뇌 구체적으로, 우리는 더 구체적인 방법은 성인 척수에있는 미세 아교 세포의 기능을 연구하기 위해 설립해야한다는 것을 느꼈다. 우리 신생아 방법뿐만 아니라 특정 병적 인 조건에서와 같이 뇌의 정상적인 기능에 관한 대부분의 질문에 대답하기 위해 매우 효율적인 방법이며, 성인 방법은 면역 반응의 다양성 부여 등의 연구를위한 신생아 세포의 사용에 대한 좋은 대안입니다의 신생아 미세 아교 세포와 성인 세포 사이 뇌에서 미세 아교 세포와 척수 6-9 사이. 설명 두 방법에서 얻어진 미세 아교 세포는 체외에서 또한 공동 문화 연구 (우리 실험실에서 신경 세포 나 희소 돌기 아교 세포와 우리가 주로 문화를)에 해당하는 주소를 다른 세포 유형에 대한 미세 아교 세포의 효과뿐만 아니라 활성화에 신생아와 성인 아교 응답 자극.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없어.

Acknowledgments

우리는 그들의 조언과 도움 의견을 Tsirka 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 JCN에 RB, NSF-3MT IGERT와 LT에 터너 논문 교제와 NSF-3MT IGERT로 12PRE12060489을 설정하려면 R01NS42168에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA, 5mM Invitrogen 15567-028
Lidocaine, 60mM Sigma L-5647
Trypan Blue Sigma T8154
Trypsin/EDTA Cellgro 25-052-CI
DMEM, 1X Cellgro 10-017
Sodium Pyruvate Cellgro 25-000-Cl
Gentamycin Sulfate Biowittaker 17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish Falcon 353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml Dilute 1:20
HBSS, 1X Cellgro 20-023-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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