नवजात और वयस्क केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र से संवर्धन Microglia

1Program in Neuroscience, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Sciences, Stony Brook University, 3Program in Molecular and Cellular Pharmacology, Stony Brook University
* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

हम नवजात मस्तिष्क प्रांतस्था और वयस्क रीढ़ की हड्डी से व्यवहार्य microglia की कुशल और त्वरित अलगाव / संस्कृति के लिए तरीकों की रूपरेखा. कोर्टिकल microglia के विच्छेदन और चढ़ाना प्रारंभिक विच्छेदन निम्नलिखित जगह ~ 10 दिनों लेने के बाद microglial फसल के साथ 90 मिनट के भीतर पूरा किया जा सकता है.

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Bronstein, R., Torres, L., Nissen, J. C., Tsirka, S. E. Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System. J. Vis. Exp. (78), e50647, doi:10.3791/50647 (2013).

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Abstract

Microglia जैसे, ऐसे सीएनएस विकास में परिपक्वता, एकाधिक काठिन्य, और रीढ़ की हड्डी में चोट के रूप में शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के निवासी मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह कर रहे हैं. Microglia सक्रिय और ऐसे एमएस या स्ट्रोक से उत्पन्न इस्कीमिक मस्तिष्क आघात में देखा axonal नुकसान के रूप में neuronal चोट या उत्तेजना, द्वारा कार्रवाई करने के लिए भर्ती किया जा सकता है. सीएनएस के इन असुरक्षित सदस्यों को भी गैर रोग परिस्थितियों में synaptic plasticity में भूमिकाओं के लिए लगा रहे हैं. हम इस तरह के अन्य सीएनएस प्रकार की कोशिकाओं और सेल संस्कृति मलबे की उपस्थिति के रूप में confounding चर, जबकि कम से कम व्यवहार्य सेल नंबर को अधिकतम करने के उद्देश्य से कर रहे हैं कि नवजात और वयस्क ऊतकों से संवर्धन microglia के लिए प्रोटोकॉल को रोजगार. हम पूरी प्रक्रिया को संभव और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाता है जो बड़े और आसानी से discernable सीएनएस घटकों (जैसे प्रांतस्था, रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों) का उपयोग. वयस्क कोशिका का उपयोगकई विकृतियों मुख्य रूप से प्रसव के बाद रीढ़ की हड्डी को प्रभावित अध्ययन के रूप में है, नवजात मस्तिष्क microglia के उपयोग के लिए एक उपयुक्त विकल्प है. ये संस्कृति सिस्टम भी सीधे या तो रोकना या microglial सक्रियण को बढ़ावा देने सकता है कि यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए उपयोगी होते हैं. Microglial सक्रियण वयस्क सीएनएस में रोग के परिणामों को आकार कर सकते हैं, नवजात और वयस्क microglia सुसंस्कृत और अध्ययन किया जा सकता है जिसमें इन विट्रो प्रणालियों में जाने की जरूरत है.

Introduction

Microglia सबसे निकट संरचना और समारोह 1 में परिधीय मैक्रोफेज जैसी सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे हैं. यह हाल ही में प्रसव के बाद microglial कोशिकाओं आदिम माइलॉयड progenitors से निकाले जाते हैं और प्रसव के बाद hematopoietic पूर्वज वयस्क मस्तिष्क 2 में microglia के स्रोत रहे हैं कि पिछले धारणा upending, embryogenesis के आठवें दिन पहले उत्पन्न कर रहे हैं कि प्रदर्शन किया गया है. वे कई न्यूरोलॉजिकल रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और जल्दी समर्थक भड़काऊ या विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स 3 रिहा द्वारा संक्रमण या चोट का जवाब कर सकते हैं. इस प्रकार microglia रोग प्रगति को प्रभावित करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है कि सीएनएस में एक स्टैंडअलोन इकाई धरना. अलग करने के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों और संस्कृति नवजात या वयस्क microglial कोशिकाओं का विकास भविष्य के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है.

Microglia मस्तिष्क विकृतियों की एक संख्या में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों में माने जाते हैं. हाल ही में, rolतों हिप्पोकैम्पस 1, 4 की दांतेदार गाइरस से microglia phagocytose अतिरिक्त तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज के रूप में सामान्य मस्तिष्क के विकास और समारोह में कोशिकाओं के लिए उभर रहे हैं. Microglia भी ऐसे एमएस के रूप में रीढ़ की हड्डी को प्रभावित करने वाले कई न्यूरोलॉजिकल शर्तों, न्यूरोपैथिक दर्द, और रीढ़ की हड्डी में चोट 5-7 न्यूनाधिक कर सकते हैं. स्पाइनल कॉर्ड microglia स्थानीय वातावरण में मतभेद की वजह से शायद सक्रियण संकेतों 8, 9, के जवाब में मस्तिष्क microglia की तुलना में अलग तरह से प्रतिक्रिया. इस प्रकार संस्कृति के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक उचित स्थापना और रीढ़ की हड्डी microglia के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है. नवजात microglia IFN-γ या TNF-एक 10,11 कुछ बीमारियों के संदर्भ में microglia के अध्ययन करने के लिए वयस्क कोशिकाओं का उपयोग करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला आगे. के साथ इन विट्रो उत्तेजना में बाद वयस्क कोशिकाओं की तुलना में समर्थक भड़काऊ साइटोकाइन नाइट्रिक ऑक्साइड का काफी अधिक उत्पादन

हम घन को प्रयोगशाला में रोजगार प्रोटोकॉलLTURE नवजात microglia सेल संस्कृति फ्लास्क 12 की सतह से microglia को दूर करने के प्रयास में मिश्रित glial संस्कृतियों के झटकों का उपयोग जो हाल के तरीकों का एक संस्करण है. हम भी पहले भौंकना, एट अल 13 द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल पर आधारित वयस्क माउस रीढ़ की हड्डी से संस्कृति microglia के लिए एक विधि का वर्णन है. यह पद्धति अन्य उपलब्ध प्रोटोकॉल के 14 की तुलना में संस्कृति वयस्क कोशिकाओं को एक तेज रास्ता प्रदान करता है. परिणामस्वरूप तैयारी 70% microglia है, शेष प्रतिशत astrocytes की रचना की है. हमारी संस्कृति की पवित्रता प्रकाशित अन्य तरीकों के 13 की तुलना में कम है, इस संस्कृति प्रणाली मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी को प्रभावित और कहा कि रोगों के अध्ययन के लिए विभिन्न सक्रिय उत्तेजनाओं के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए संस्कृति जवाब में microglial की खोज के लिए उपयोगी है एक मजबूत जिसमें भड़काऊ प्रतिक्रिया एक मुख्य विशेषता है.

वर्णित सभी प्रोटोकॉल पथरीले ब्रुक विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया हैty IACUC.

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Protocol

1. विच्छेदन (0 दिन)

  1. हाइपोथर्मिया के साथ P0-2 माउस पिल्ले को संज्ञाहरण प्रेरित. ऊतक कीटाणुरहित 70% इथेनॉल में भिगो Kimwipe साथ पिल्ले का सिर साफ कर लें.
  2. 10 सेमी संस्कृति प्लेट प्रति 4 पिल्ले का उपयोग कर, कैंची की एक जोड़ी के साथ सिर निकालें. बर्फ ठंड हांक बफर युक्त एक पेट्री डिश में सिर रखें.
  3. आँख कुर्सियां ​​के माध्यम से घुमावदार संदंश का उपयोग सिर एंकर और ध्यान से सीधे microforceps साथ खोपड़ी को कवर त्वचा को हटा दें.
  4. नहीं पंचर या क्षति cortices के लिए सतर्कता का उपयोग कर, सीधे microforceps साथ कपाल हड्डियों निकालें. सबसे प्रभावी तरीका है इस क्षेत्र को त्याग दिया जाएगा, के रूप में सिर के आधार पर स्थित है जो सेरिबैलम, के पास शुरू हटाने शुरू हो रहा है.
  5. एक छोटा सा रंग के साथ मस्तिष्क निकालें, और बर्फ ठंड हांक बफर युक्त एक ताजा पेट्री डिश में (4) दिमाग जगह है.
  6. पर इस बात से सभी कदम microforceps उपयोग और एक disse के तहत प्रदर्शन कर रहे हैंction माइक्रोस्कोप. मस्तिष्क के उदर पक्ष पर शुरू, सेरिबैलम धारण करके ऊतक लंगर और मध्यमस्तिष्क के दोनों तरफ दो छोटे चीरों बनाने. Cortices के इस क्षेत्र में मध्यमस्तिष्क को कवर के रूप में, ऊतक के माध्यम से सभी तरह से कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  7. धीरे दो cortices से एक टुकड़ा में मध्यमस्तिष्क और सेरिबैलम तंग. दो cortices के एक अवतल आकृति फार्म चाहिए.
  8. आगे विच्छेदन के लिए ऊपर औसत दर्जे का पक्ष के साथ दो cortices और पूरबी एक एकल प्रांतस्था अलग करें. हिप्पोकैम्पस निरीक्षण करने के लिए मुश्किल हो सकता है, लेकिन यह प्रांतस्था के अंत बताया पर एक छोटी सी गांठ के रूप में प्रकट होता है जो घ्राण बल्ब के सामने स्थित है.
  9. एक वर्धमान के आकार की है जो हिप्पोकैम्पस, निकालें. पृष्ठीय पक्ष देखने के लिए प्रांतस्था पर पलटें.
  10. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में घ्राण बल्ब का उपयोग करना, सभी तानिका और प्रांतस्था से घ्राण बल्ब ही हटा दें.
  11. विच्छेदित cortices के कर्नल की 14 मिलीलीटर के साथ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखा जाना चाहिएबर्फ पर घ हांक बफर खारा.

2. सेल संस्कृति दिवस (0)

  1. 37 डिग्री सेल्सियस से कम 3 घंटे के लिए autoclaved पानी में पतला पाली डी लाइसिन (पीडीएल) की 5 ग्राम / मिलीलीटर के साथ पूर्व कोट 10 सेमी टिशू कल्चर व्यंजन
  2. Autoclaved पानी के साथ एक बार पीडीएल, और धोने प्लेटें महाप्राण. 20 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड में यूवी के तहत सूखी थाली. यह कदम विच्छेदन की प्रक्रिया के लिए बस से पहले किया जाना चाहिए.
  3. 4 दिमाग प्रत्येक से cortices युक्त ट्यूब से aspirate हांक बफर, 1x trypsin / EDTA समाधान के 4 मिलीलीटर लागू, डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए 37 में P1000 टिप, और जगह ट्यूबों के साथ ऊतक triturate.
  4. Enzymatic पाचन, मिश्रण, बंद करो और 5 मिनट के लिए 1.5k rpm पर सामग्री नीचे स्पिन करने के लिए ट्यूब प्रति पूरी microglial मीडिया के 4 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. तैरनेवाला Aspirate और पूरा मीडिया के 4 मिलीलीटर के साथ धोने दोहराएँ. एक 40 माइक्रो के माध्यम से 10 पूर्ण microglial मीडिया की मिलीलीटर (10% FBS के साथ DMEM, 1% सोडियम पाइरूवेट, 0.08% gentamycin), और फिल्टर में Resuspend कोशिकाओंएन जाल सेल झरनी.
  6. 37 पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में एक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट और जगह में 10 मिलीलीटर प्रति 8 cortices के घनत्व पर प्लेट डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (वयस्क Microglia प्रोटोकॉल देखें).

(3 दिन)

  1. पूरा microglial मीडिया के साथ सभी सेल संस्कृति बर्तन में मीडिया बदलें.

(10 दिन)

  1. 60 मिमी की 400 microliters के 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट की मध्यम और 10-15 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आर टी) पर सेते में HBSS (microglia अलग करने के लिए) में lidocaine जोड़ें.
  2. थाली से मीडिया / सेल निलंबन लीजिए, और हांक बफर के साथ एक बार थाली धो लो. शेष microglia ठीक करने के लिए धोने बफर लीजिए.
  3. 50 माइक्रोन का या एक 1/100 कमजोर पड़ने पर एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल निलंबन के लिए 5 मिमी EDTA (8.0 पीएच) जोड़ें.
  4. 5 मिनट के लिए 1000 XG (1500 rpm) में सेल निलंबन स्पिन और 1% FBS के साथ 1 मिलीलीटर DMEM में फिर से निलंबित.
  5. (व्यवहार्य सेल संख्या की गणना वयस्क एम आई के अनुसारcroglia 3.1/3.2) और वांछित प्रयोगात्मक घनत्व में टिशू कल्चर प्लेटों में विभाजित कोशिकाओं. लगभग 1x10 6 microglia 4 दिमाग से cortices युक्त एक 10 सेमी की थाली से काटा जाता है. Immunofluorescence के लिए, 18 मिमी coverslip प्रति 2.5x10 4 कोशिकाओं के घनत्व की सिफारिश की है.
  6. Microglial कोशिकाओं के लिए कम से कम 24 घंटे के लिए पूरी तरह से उपयोग करने से पहले उनके डालियां फैला, आराम की स्थिति में लौटने की अनुमति दें.

प्रोटोकॉल पाठ: (वयस्क Microglia)

1. ऊतक संग्रह

  1. 37 पर 3 घंटे के लिए पाली डी लाइसिन (पीडीएल) के साथ कोट टिशू कल्चर प्लेटें डिग्री सेल्सियस या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस Autoclaved पानी के साथ एक बार उपयोग करने के तुरंत पहले प्लेट धो लें.
  2. सीओ 2 asphyxiation और इच्छामृत्यु पूरा हो गया है कि पता लगाने के द्वारा माउस euthanize. 70% इथेनॉल के साथ रीढ़ की हड्डी क्षेत्र को साफ करें.
  3. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग रीढ़ की हड्डी के शीर्ष पर त्वचा में कटौती, तो इस क्षेत्र T1 से टी 12 के लिए रीढ़ की हड्डी को काटने के लिए आगे बढ़ें. कटौतीरीढ़ की हड्डी के पक्षों के शेष मांसपेशी बंद.
  4. धीरे धीरे आप धीरे अपनी उंगलियों के साथ रीढ़ की हड्डी पकड़ के रूप में microscissors के उपयोग कर कशेरुकाओं कटौती. ऊतक बहुत नरम है के रूप में पंचर रीढ़ की हड्डी के लिए सावधान नहीं रहो. धीरे धीरे microforceps उपयोग कर रीढ़ की हड्डी निकाल सकते हैं.
  5. बर्फ ठंड HBSS युक्त एक पेट्री डिश में डूब रीढ़ की हड्डी. एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग microforceps का उपयोग कर सभी दृश्य तानिका हटाने
  6. कई टुकड़े उत्पन्न करने के लिए काफी छोटा आड़ा खंडों में रीढ़ की हड्डी में कटौती. टुकड़े की मोटाई कुशल पाचन को सुविधाजनक बनाने के क्रम में 2 मिमी से अधिक नहीं होना चाहिए. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड HBSS युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए रीढ़ की हड्डी के टुकड़े स्थानांतरण. पाचन कदम जब तक बर्फ पर ट्यूब रखें.

2. ऊतक का पाचन

  1. रीढ़ की हड्डी के ऊतकों से युक्त 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से HBSS महाप्राण. ऊतक के किसी भी टुकड़ा महाप्राण के प्रति सावधान रहें.
  2. Trypsin (2 का 1 मिलीलीटर जोड़ें.5 ग्राम / एल विकिरणित सुअर का trypsin और HBSS में 0.2 ग्राम / एल EDTA) और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  3. पाचन trypsin हटाने और enzymatic पाचन को रोकने के लिए सीरम होता है जो प्राथमिक microglia के माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ने रोकने के लिए.
  4. Pipet ऊपर और नीचे के ऊतकों को बेदखल करने के लिए. एक 40 सुक्ष्ममापी सेल झरनी का उपयोग करते हुए सेल निलंबन फ़िल्टर.

3. सेल गिनती और चढ़ाना

  1. सेल निलंबन और DAPI समाधान के बराबर मात्रा मिलाई.
  2. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना.
  3. 5 7x10 5 कोशिकाओं / पीडीएल में लिपटे 35 x 10 मिमी व्यंजन में मिलीग्राम के बीच एक घनत्व प्लेट. कोशिकाओं 35 x 10 मिमी व्यंजन की तुलना में एक छोटे क्षेत्र है जो 12 अच्छी तरह प्लेटें में सुसंस्कृत थे, तब भी जब एक कम घनत्व पर चढ़ाना सेल के विकास को रोका.

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Representative Results

आराम और सक्रिय microglial कोशिकाओं का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. microglia चढ़ाना के बाद 24 घंटे कल्पना (चित्रा 1 क) और डालियां फैला (आराम) आकारिकी प्रदर्शन कर रहे थे. भड़काना अभिकर्मक के संपर्क में, कोशिकाओं के रूप में microglial आकारिकी में परिवर्तन में बैक्टीरियल lipopolysaccharide (LPS) परिणाम (चित्रा 1 बी) सक्रिय हो जाते हैं.

चढ़ाना के लिए कोशिकाओं की गिनती का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. सेल मलबे की उपस्थिति के कारण, DAPI Fluoromount (बजाय Trypan ब्लू के) सेल निलंबन के एक बराबर मात्रा में जोड़ा और 4 में वर्णित के रूप में गिनती सेल, 13 के लिए एक hemocytometer में रखा गया था. DAPI सकारात्मक कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कल्पना कर रहे थे. वर्तमान कोशिकाओं (चित्रा 2) के एक सटीक गणना में मदद की उज्ज्वल क्षेत्र सेटिंग का उपयोग करें. 5 7x10 के आसपास की कोशिकाओं माउस रीढ़ की हड्डी की प्रति प्राप्त किया गया.

सामग्री "> कोशिकाओं पीडीएल में लिपटे 35 x 10 मिमी टिशू कल्चर बर्तन में चढ़ाया गया. हम कोशिकाओं पालन / प्लेटें लेपित थे जब तक विकसित नहीं किया पीडीएल के साथ कि कोटिंग, एक महत्वपूर्ण कदम था. Microglia पूरी तरह से संस्कृति की थाली के लिए देते हैं बाद लगभग संस्कृति में दो दिन (चित्रा 3). microglia / बृहतभक्षककोशिका प्रमोटर सीएसएफ-1R के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP, इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया था जो MacGreen चूहों की रीढ़ की हड्डी,.

चित्रा 1
चित्रा 1. संस्कृति में दो दिनों के बाद नवजात microglia के प्रतिनिधि छवि. Microglia p0 C57/BL6 माउस पिल्ले से सुसंस्कृत, और 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर uncoated coverslips पर चढ़ाया गया. एक पर लौट आए हैं कि एक, ग. इलाज microglia आराम, डालियां फैला राज्य, ख, घ . Microglia 4 घंटे के लिए 100 एनजी / एमएल LPS के साथ इलाज किया गया और एक सक्रिय, अमीबाभ आकार दिखा, उज्ज्वल क्षेत्र छवियों के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि Iba1 (हरा, एक मैक्रोफेज / microglia कोशिका की सतह प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक मार्कर) कोशिकाओं कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, समग्र सेल आबादी दिखा. DAPI Fluoromount नाभिक कल्पना और संस्कृति की पवित्रता का संकेत किया गया था.

चित्रा 2
चित्रा 2. सेल गिनती. DAPI Fluoromount सेल निलंबन के एक बराबर मात्रा के साथ मिलाया जाता है और एक hemocytometer में रखा गया था. हम brightfield और प्रतिदीप्ति सेटिंग DAPI सकारात्मक कोशिकाओं कल्पना और एक सटीक सेल गिनती के लिए hemocytometer ग्रिड संयुक्त.

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चित्रा 3. संस्कृति में दो दिनों के बाद वयस्क रीढ़ की हड्डी microglia की छवियों प्रतिनिधि. एक. एक MacGreen माउस की रीढ़ की हड्डी संस्कृति प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया था. कोशिकाओं 7x10 5 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर एक पीडीएल में लिपटे 35 x 10 मिमी टिशू कल्चर पकवान में चढ़ाया गया. ख. रीढ़ की हड्डी microglia के उज्ज्वल क्षेत्र छवि संस्कृति में दो दिनों के बाद. Microglia (नीले तीर) और astrocytes (लाल तीर) दिखाए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

Microglia सीएनएस सामान्य कामकाज के साथ ही विभिन्न विकृतियों को भड़काऊ प्रतिक्रियाओं मिलाना. Microglia द्वारा कार्यात्मक synaptic remodeling के सामान्य मस्तिष्क समस्थिति 15 के रखरखाव में शामिल किया गया है. तंत्रिकाजन्य झरना के दौरान वे हिप्पोकैम्पस 4, 16 की दांतेदार गाइरस से तंत्रिका कोशिकाओं पूर्वज की निकासी में भाग लेते हैं. इसलिए, यह microglia कई असतत कार्य किया है जो भर में विकास और वयस्कता के विशाल कटी हुई घास को कवर किया जाएगा जो नवजात और वयस्क microglia, अध्ययन करने के लिए एक संस्कृति में जो प्रणाली विकसित करने के लिए आवश्यक है. हम वयस्क रीढ़ की हड्डी और नवजात मस्तिष्क से संस्कृति microglia के लिए एक त्वरित और कारगर तरीका बताया है. हम 70% astrocytes के मिलकर शेष प्रतिशत के साथ microglia, और 100% आ नवजात microglial preps की पवित्रता थे कि वयस्क में सेल तैयारी प्राप्त करने में सक्षम थे.

भूमिका था देखते हुएटी astrocytes microglia 17-19 की सक्रियता राज्य को विनियमित करने में, यह संस्कृति की पवित्रता को बेहतर बनाने के लिए संस्कृति स्थिति अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है है. DAPI Fluoromount के एक बराबर मात्रा के साथ सेल निलंबन के संयोजन एक सटीक सेल गिनती के लिए अनुमति देता है, यह इस पद्धति का उपयोग अन्य प्रकार की कोशिकाओं से microglia भेद करने के लिए संभव नहीं है. वयस्क microglial तैयारी की शुद्धता में सुधार करने के लिए, GFP-लेपित Dynabeads जिसका माइलॉयड कोशिकाओं पहले से ही व्यक्त GFP 20 MacGreen चूहों से प्राप्त सेल निलंबन के साथ incubated किया जा सकता है. एक अन्य सुझाव थाली करने के लिए पहले से astrocytic लगाव 13 को रोकने के लिए पीडीएल के साथ लेपित नहीं किया गया है कि संस्कृति बर्तन में मिश्रित सेल निलंबन होगा. हालांकि, हम वे पहले से हमारे हाथ में नवजात और वयस्क कोशिकाओं दोनों पर लागू होता है, जो लेपित किया गया है जब तक कि कोई कोशिकाओं की थाली पर विकसित हो पाया है.

Isol के लिए विधियों का वर्णन कई प्रोटोकॉलया तो चूहे या माउस मस्तिष्क के ऊतकों से समझना और प्राथमिक microglia की चढ़ाना microglia अलग है और इस तरह नीचे की ओर प्रयोगों 12 के लिए एक शुद्ध जनसंख्या प्राप्त करने के लिए मिश्रित glial संस्कृतियों के झटकों का उपयोग. हमारे प्रोटोकॉल मिलाते कदम को छोड़कर में सबसे काफ़ी अलग है, और बदले ठीक titrated संवर्धन शर्तों के माध्यम से एक microglial केवल जनसंख्या की शोधन पर केंद्रित थी. हमारे अनुभव में, microglia हटाने के लिए मिश्रित glial संस्कृतियों मिलाते प्रभावी है, लेकिन एक महत्वपूर्ण खामी है - हिल microglia एक पूरा आराम आकारिकी 12 पर लौटने के लिए कई दिन लग तथ्य यह है कि. यह सक्रिय microglia एक काफी अलग साइटोकाइन प्रोफाइल 21 यह देखते हुए कि समस्याग्रस्त किया जा सकता है. हमारे प्रोटोकॉल, शुद्ध microglia प्राप्त करने के लिए थोड़ा समय लग रहा है, जबकि भर में एक आराम की स्थिति में कोशिकाओं को बनाए रखता है. अगले पैराग्राफ में चर्चा वयस्क प्रस्तुत करने के साथ, हमारे विधि की एक खामी एक possi हैअर्थात् अन्य प्रकार की कोशिकाओं, astrocytes के छोटे संदूषण की साख.

संवर्धन वयस्क microglia के लिए हमारी तकनीक तरीकों preexisting से काफी भिन्न होता है. कई प्रोटोकॉल घनत्व ढाल centrifugation (Percoll) के रूप में एक शुद्ध microglial आबादी 22 प्राप्त करने के लिए प्रवाह cytometry के उपयोग के उपयोग के लिए कहते हैं. वयस्क रीढ़ की हड्डी से एक स्थिर microglial संस्कृति बनाने के हमारे तरीके में हम पालन करने के शोधकर्ता के लिए एक काफी कम समय लगता है और जटिल प्रोटोकॉल के लिए बनाता है जो या तो तकनीक का उपयोग नहीं करते. वयस्क microglial तैयारी के विशाल बहुमत के मस्तिष्क के ऊतकों से आते हैं, रीढ़ की हड्डी में एक ही प्रकार की कोशिकाओं से मिलकर बना है - और इसलिए हमारे प्रोटोकॉल पहले से वर्णित विधि 22 के लिए एक निष्पक्ष तुलना प्रस्तुत करता है. हमारे प्रोटोकॉल में एक tradeoff के astrocytic origi की ज्यादातर जा रहा है कोशिकाओं का शेष अंश के साथ, 70% microglia से मिलकर, एक से थोड़ा कम शुद्ध microglial तैयारी हैएन. इस विसंगति संभवतः ऐसे चुंबकीय मोतियों को संयुग्मित आईबीए -1 और F4/80 रूप microglial वंश की बहुत विशेष सेल प्रकार मार्कर का उपयोग कर अधिक शुद्ध microglia के अलगाव की एक अतिरिक्त कदम का उपयोग कर दूर किया जा सकता है.

यह सामान्य विकास में microglia के लिए एक भूमिका के बारे में सवालों के जवाब देने के साथ ही प्रभावित करने विकृतियों के लिए एक ठोस दृष्टिकोण है, जबकि रीढ़ की हड्डी नवजात मस्तिष्क से कोशिकाओं का उपयोग किया गया है, और प्रभावित करने वाले मस्तिष्क संबंधी बीमारियों में microglia की भूमिका का आकलन है कि अधिकांश अध्ययन मस्तिष्क विशेष रूप से, हम एक और अधिक विशिष्ट विधि वयस्क रीढ़ की हड्डी में microglia समारोह का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया जा सकता था कि लगा. हमारी नवजात की विधि के रूप में अच्छी तरह से निश्चित रोग की स्थिति में के रूप में मस्तिष्क के सामान्य कामकाज के बारे में ज्यादातर सवालों के जवाब के लिए एक बहुत ही कारगर तरीका है, और वयस्क विधि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता दिए गए इस तरह के अध्ययन के लिए नवजात कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक अच्छा विकल्प हैएस नवजात microglia और वयस्क कोशिकाओं के बीच और मस्तिष्क से microglia और रीढ़ की हड्डी में 6-9 के बीच. वर्णित दोनों तरीकों से प्राप्त microglia इन विट्रो में भी सह संस्कृति अध्ययन (हमारी प्रयोगशाला में न्यूरॉन्स या oligodendrocytes साथ हम मुख्य रूप से संस्कृति उन) के लिए उपयुक्त हैं कि मेल अन्य प्रकार की कोशिकाओं पर microglia के प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से सक्रिय करने के लिए नवजात और वयस्क microglial प्रतिक्रिया उत्तेजनाओं.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम उनकी सलाह और उपयोगी टिप्पणी के लिए Tsirka प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम JCN को आरबी, एक NSF-3MT IGERT और लेफ्टिनेंट को एक टर्नर निबंध फैलोशिप, और NSF-3MT IGERT करने, 12PRE12060489 सेट करने R01NS42168 द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA, 5mM Invitrogen 15567-028
Lidocaine, 60mM Sigma L-5647
Trypan Blue Sigma T8154
Trypsin/EDTA Cellgro 25-052-CI
DMEM, 1X Cellgro 10-017
Sodium Pyruvate Cellgro 25-000-Cl
Gentamycin Sulfate Biowittaker 17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish Falcon 353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml Dilute 1:20
HBSS, 1X Cellgro 20-023-CV

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References

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
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