Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

1Program in Neuroscience, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Sciences, Stony Brook University, 3Program in Molecular and Cellular Pharmacology, Stony Brook University
* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Biz neonatal serebral korteks ve yetişkin omurilik canlı mikroglia verimli ve hızlı izolasyon / kültür yöntemleri özetlemektedir. Kortikal mikrogliya diseksiyonu ve kaplama ilk diseksiyonu sonrasında yer ~ 10 gün alarak sonraki mikrogliyal hasat ile, 90 dakika içinde yapılabilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bronstein, R., Torres, L., Nissen, J. C., Tsirka, S. E. Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System. J. Vis. Exp. (78), e50647, doi:10.3791/50647 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mikroglia gibi, bu MSS gelişiminde olgunlaşma, multipl skleroz ve spinal kord yaralanması gibi fizyolojik ve patolojik süreçlerde kritik önemli rolleri olan, merkezi sinir sistemi (MSS) yerleşik makrofaj benzeri hücreler ve. Mikroglia aktif ve MS veya inme kaynaklanan iskemik beyin travması görüldüğü aksonal hasar nöronal yaralanma veya stimülasyon, harekete için işe edilebilir. MSS Bu bağışıklık üyeleri de patolojik olmayan koşullarda sinaptik plastisite rol olduğu düşünülmektedir. Biz diğer merkezi sinir sistemi hücre tipleri ve hücre kültürü enkaz varlığı olarak karıştırıcı değişkenler, en aza indirirken canlı hücre sayıları en üst düzeye çıkarmak amaçlanmıştır yenidoğan ve yetişkin dokulardan kültür mikrogliya için protokolleri kullanır. Biz tüm süreci uygulanabilir ve tekrarlanabilir hale getirir büyük ve kolayca ayırt MSS bileşenleri (örneğin korteks, spinal kord segmentleri), kullanmaktadır. Yetişkin hücrenin kullanımınıbirçok patolojiler özellikle doğum sonrası omurilik etkiler okudu olarak s, neonatal beyin mikroglia kullanımına uygun bir alternatiftir. Bu kültür sistemleri de doğrudan ya da inhibe etmek veya mikrogliyal aktivasyonun teşvik edebilir bileşiklerin etkisini test etmek için yararlıdır. Mikrogliyal aktivasyonun, yetişkin merkezi sinir sisteminde hastalıkların sonuçları şekil bu yana, neonatal ve yetişkin mikroglia kültürlenir ve incelenmiştir edilebileceği in vitro sistemler için bir ihtiyaç vardır.

Introduction

Mikroglia en yakın yapı ve fonksiyon 1 periferik makrofaj benzeri MSS, yerleşik bağışıklık hücreleri bulunmaktadır. Son zamanlarda doğum sonrası mikroglial hücreleri ilkel myeloid öncü hücrelerden elde ve doğum sonrası hematopoetik ataları yetişkin beyin 2 mikroglia kaynağı olduğu önceki kavramı upending, embriyogenez sekizinci gün önce oluşturulan olduğu gösterilmiştir. Onlar çeşitli nörolojik hastalıklarda önemli rol oynayan ve hızlı bir şekilde pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler 3 bırakarak enfeksiyon veya yaralanma yanıt verebilir. Böylece mikroglia hastalığın ilerlemesini etkileyecek manipüle edilebilir MSS bağımsız bir birim kapsayacak. Izole etmek için sağlam ve üretken kültür ve yenidoğan veya yetişkin mikroglial hücreleri geliştirme ileri çalışmalar için önemlidir.

Mikroglia beyin patolojilerinin bir dizi kritik oyuncu olduğu bilinmektedir. Daha yakın zamanda, roles hipokampus 1, 4 dentat girus gelen mikroglia fagosite aşırı nöral progenitör hücrelerin normal beyin gelişimi ve işlevi hücreleri için ortaya çıkmaktadır. Mikroglia da MS gibi omurilik etkileyen çeşitli nörolojik koşulları, nöropatik ağrı, ve spinal kord yaralanması 5-7 modüle olabilir. Omurilik mikroglia yerel ortamda farklılıklar nedeniyle muhtemelen aktivasyon sinyalleri 8, 9, yanıt olarak beyin mikrogliya göre farklı şekilde etkiler. Bu nedenle in vitro kültür sisteminde uygun bir tesis ve omurilik mikroglia incelemek için önemlidir. Yenidoğan mikroglia, IFN-γ, TNF-a ya da 10,11 bazı hastalıkların bağlamında mikroglia incelemek için yetişkin hücrelerin kullanımı ihtiyacını daha vurgulayarak. Ile in vitro stimülasyondan sonra yetişkin hücrelere kıyasla, pro-inflamatuar sitokin, nitrik oksit önemli ölçüde daha fazla üretmek

Biz cu laboratuarda istihdam protokolüLTURE yenidoğan mikroglia hücre kültürü şişesi 12 yüzeyinden mikrogliya kaldırmak için bir çaba karışık glial kültürlerin sallayarak kullanmak en yeni tekniklerin bir çeşididir. Ayrıca, ilk Yip ve ark 13 ile tarif edilen bir protokole göre yetişkin fare omurilik kültürüne mikroglia için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, mevcut diğer protokolleri 14 ile karşılaştırıldığında kültür yetişkin hücrelere daha hızlı bir yol sağlar. Sonuçta elde edilen müstahzarlarda% 70 mikroglia olan, geri kalan yüzde astrositler oluşmaktadır. Bizim kültür saflığının başka yayınlanmış yöntemler 13 kıyasla daha düşük olmasına rağmen, bu kültür sisteminde özellikle omuriliği ve hastalıkların çalışması için çeşitli aktive edici uyaran hem de kültür yanıt olarak mikroglial keşfetmek için yararlı olan güçlü bir hangi inflamatuvar yanıt bir ana özelliğidir.

Açıklanan tüm protokoller Stony Brook üniversite tarafından onaylanmıştırty IACUC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Diseksiyon (Gün 0)

  1. Hipotermi ile p0-2 fare yavrular için anestezi neden. Doku dezenfekte% 70 etanol batırılmış bir Kimwipe ile yavrular başkanları silin.
  2. 10 cm kültür plaka başına 4 yavrular kullanarak, bir makas ile kafaları çıkarın. Buz Hank tampon içeren bir petri başkanları yerleştirin.
  3. Göz çukurları ile kavisli bir forseps kullanarak kafaları demir ve dikkatli bir şekilde düz microforceps ile kafatası kaplayan deri kaldırmak.
  4. Değil delinme veya hasar korteks için dikkatli kullanarak, düz microforceps ile kafatası kemikleri çıkarın. En etkili bir şekilde bu bölgede atılır olarak, başın tabanında yer alır beyincik, yanından başlayıp kaldırma başlamak etmektir.
  5. Küçük bir spatula ile beyin çıkarın ve buz Hank tampon içeren yeni bir petri (4) beyin yerleştirin.
  6. Bu noktadan itibaren tüm adımları microforceps kullanmak ve bir disse altında gerçekleştirilirction mikroskop. Beynin ventral tarafında başlayarak, beyincik tutarak doku demir ve orta beyin her iki tarafında iki küçük kesiler yapmak. Korteks bu bölgede orta beyin kapak olarak, doku üzerinden tüm yol kesmek için dikkat edin.
  7. Yavaşça iki korteks gelen tek parça halinde orta beyin ve beyincik kızdırmak. İki korteks içbükey bir şekil oluşturmalıdır.
  8. Daha fazla diseksiyon için medial yüzü iki korteks ve yönlendirmek tek korteks ayırın. Hipokampus gözlemlemek için zor olabilir, ama korteksin sivri ucunda küçük bir nodül olarak görünen koku ampul karşısında yer almaktadır.
  9. Bir hilal şekli vardır hipokampus, çıkarın. Sırt tarafında görmek için korteks ters çevirin.
  10. Bir başlangıç ​​noktası olarak koku ampul kullanarak, tüm zarları ve korteksten koku ampul kendisini kaldırmak.
  11. Parçalara korteks col 14 ml 'si ile 15 ml konik tüp içine yerleştirilmelidirbuz üzerinde d Hank tamponlu tuzlu.

2. Hücre Kültürü (gün 0)

  1. 37 ° C'de 3 saat boyunca otoklava su içinde seyreltildi poli-D-lizin (PDL) 5 ug / ml 'si ile ön kat 10 cm doku kültür tabaklarında
  2. Otoklava su ile bir kez PDL ve yıkama plakaları aspire. 20 dakika boyunca doku kültürü kaputu UV altında kuru plakası. Bu adım, diseksiyon işlemi hemen önce yapılmalıdır.
  3. 4 Brain her birinden korteks içeren tüpler aspire Hank tampon 1x tripsin / EDTA çözeltisi, 4 ml uygulamak ° C inkübatör 15 dakika boyunca 37 P1000 ucu ve yerine borular ile doku çiğnemek.
  4. Enzimatik sindirim, mix, durdurmak ve 5 dakika boyunca 1.5K rpm içeriğini aşağı dönmeye tüp başına tam mikrogliyal medya 4 ml ekleyin.
  5. Süpernatant aspire ve eksiksiz bir medya 4 ml yıkama tekrarlayın. 40 mikro 10 ile tam bir ortam mikroglial ml (% 10 FBS DMEM,% 1 sodyum piruvat,% 0.08 gentamisin), ve filtre hücrelerin tekrarn örgü hücre süzgecinden.
  6. 37, bir doku kültürü inkübatöründe 10 cm doku kültürü plakası ve yerine 10 ml başına 8 korteks yoğunluğunda Plaka ° C ve% 5 CO2 (Yetişkin Mikroglia protokolü bakınız).

(Gün 3)

  1. Tam mikrogliyal medya ile tüm hücre kültürü yemekleri ortamı değiştirin.

(Gün 10)

  1. 60 mM 400 mikrolitre 10 cm doku kültürü plakaları, orta ve 10-15 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe HBSS (mikroglia ayırmak için), lidokain ekleyin.
  2. Plakadan medya / hücre süspansiyonu toplayın ve Hank tamponu ile bir kez plaka yıkayın. Kalan mikroglia kurtarmak için yıkama tamponu toplayın.
  3. 50 uM veya bir 1/100 dilüsyon nihai bir konsantrasyona hücre süspansiyonu 5 mM EDTA (pH 8.0) ilave edilir.
  4. 5 dakika boyunca 1000 xg (1500 rpm) hücre süspansiyonu aşağı Spin ve% 1 FBS ile 1 ml DMEM yeniden askıya.
  5. (Canlı hücre sayısını Yetişkin Mi görecroglia 3.1/3.2) ve istenen deney yoğunluğunda doku kültürü plakaları halinde bölünmüş hücreleri. Yaklaşık 1x10 6 mikrogliya 4 beyninden korteks içeren 10 cm plaka hasat edilir. Immünofloresans için, 18 mm lamel başına 2.5x10 4 hücre yoğunluğunda tavsiye edilir.
  6. Mikroglial hücreleri için en az 24 saat tam kullanmadan önce kendi dallanmış, dinlenme durumuna geri dönmek için izin verin.

Protokol Yazı: (Yetişkin Mikroglia)

1. Doku Toplama

  1. 37 °, 3 saat boyunca poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın doku kültürü plakaları ° C ya da gece boyunca 4 ° C'de Otoklava bir kez su ile kullanılmadan hemen önce plakalar, yıkama.
  2. CO 2 boğulma ve ötenazi eksiksiz olduğunu tespit tarafından fare Euthanize. % 70 etanol ile omurilik alanı temizleyin.
  3. Bir makas kullanarak omurilik üstüne deri kesilir, sonra bölge T1 T12 için omurilik kesip geçin. Kesmekomurilik tarafın kalan kas kapalı.
  4. Yavaş yavaş hafifçe parmak uçlarınızla omurilik tutmak olarak microscissors kullanarak vertebra kesti. Doku çok yumuşak olduğu gibi delinme omurilik için dikkatli olun. Yavaş yavaş microforceps kullanarak omurilik ayıklayın.
  5. Buz HBSS içeren bir petri Batmak omurilik. Bir ışık mikroskobu kullanarak microforceps kullanan tüm görünür zarları çıkarın
  6. Çeşitli parçaları üretmek için küçük çapraz bölümler halinde omurilik kesin. Parçaları kalınlığı etkin sindirim kolaylaştırmak için 2 mm'den fazla olmamalıdır. 1 ml buz gibi soğuk HBSS içeren 15 ml konik bir tüp omurilik parçaları aktarın. Sindirim adım kadar buz üzerinde tüp tutun.

2. Doku sindirimi

  1. Omurilik dokusu içeren 15 ml konik tüp HBSS aspire. Doku herhangi bir parça aspire için dikkatli olun.
  2. Tripsin (2 1 ml ilave edilir.5 g / L, ışınlanmış domuz tripsin ve HBSS içinde 0.2 g / L EDTA) ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  3. Sindirim tripsin çıkarın ve enzimatik sindirim durdurmak için serum içeren birincil mikroglia orta 3 ml ekleyin durdurmak için.
  4. Pipet yukarı ve aşağı doku çıkarmak için. 40 mikron hücre süzgecinden kullanılarak hücre süspansiyonu filtre.

3. Hücre Sayım ve Kaplama

  1. Hücre süspansiyonu ve DAPI çözeltisinin eşit bir hacmi karıştırın.
  2. Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
  3. 5-7x10 5 hücre / PDL kaplı 35 x 10 mm yemekleri ml arasında bir yoğunlukta plaka. Hücreler 35 x 10 mm tabaklar ile karşılaştırıldığında daha küçük bir alana sahip 12 oyuklu plakalar içinde kültürlendi bile daha düşük bir yoğunlukta Kaplama hücre büyümesini engellemiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dinlenme ve aktive mikroglial hücreleri bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroglia kaplama sonra 24 saat görüntülendi (Şekil 1a) ve dallanmış (dinlenme) morfoloji gösterirler edildi. Astar reaktif maruz kalmak, hücreler olarak mikrogliyal morfolojisi değişiklikler bakteriyel lipopolisakkarid (LPS) sonuçları (Şekil 1b) aktif olur.

Kaplama için hücre sayımı bir örnek Şekil 2'de gösterilmiştir. Hücre artıkları varlığı nedeniyle, DAPI Fluoromount (yerine Tripan Blue) hücre süspansiyonu, eşit hacimde eklenmiştir ve 4 de tarif edildiği gibi hücre sayımı, 13 hemasitometre yerleştirildi. DAPI pozitif hücrelerinin floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Mevcut hücreleri (Şekil 2) doğru bir sayım kolaylaştırdı parlak saha ayar kullanımı. 5 7x10 civarında hücreleri fare omurilik başına elde edilmiştir.

içerik "> Hücreler PDL kaplı 35 x 10 mm doku kültürü yemekleri kaplanmıştır. Biz hücre bağlı / plakaları kaplı olmadıkları sürece büyümeye vermedi gibi PDL ile bu kaplama, önemli bir adım oldu. Mikroglia tamamen kültür levhasına bağlanmalıdır sonra yaklaşık kültür iki gün (Şekil 3). mikroglia / makrofaj promotörü CSF-1R kontrol altında GFP ifade, bu deney için kullanıldı MacGreen farenin arasında omuriliğe.

Şekil 1
Şekil 1. Kültür içinde iki günden sonra yenidoğan mikroglia temsili görüntüsü. Mikroglia p0 C57/BL6 fare yavrular kültüre edildi ve 2.5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir yoğunlukta kaplanmamış lamelleri kaplanmıştır. Bir döndü a, c. Tedavi edilmeyen mikroglia dinlenme, dallanmış devlet, b, d . Mikroglia, 4 saat boyunca 100 ng / ml LPS ile muamele edilmiş ve bir aktive, amoeboid şeklini göstermektedir; parlak bir alan görüntüler için kullanılan süre Iba1 (yeşil, bir makrofaj / mikroglia hücre yüzey proteini için özel bir belirteç) hücreleri görselleştirmek için kullanılmıştır, genel hücre popülasyonlarının göstermektedir. DAPI Fluoromount çekirdekleri görselleştirmek ve kültür saflığı belirtmek için kullanılmıştır.

Şekil 2,
Şekil 2. Hücre sayımı. DAPI Fluoromount hücre süspansiyonu eşit bir hacmi ile karıştırılır ve bir hemasitometre yerleştirildi. Biz aydınlık ve floresan ayar DAPI pozitif hücreleri görselleştirmek için ve doğru bir hücre sayımı için hemasitometre kılavuz birleştirilir.

"Fo: src =" / "src =" / files/ftp_upload/50647/50647fig3.jpg "/ files/ftp_upload/50647/50647fig3highres.jpg>
Şekil 3,. Kültüründe iki gün sonra yetişkin omurilik mikroglia Temsilcisi görüntüleri. a. bir MacGreen fare omurilik kültür işlemi için kullanılmıştır. Hücreler 5 7x10 hücre / ml 'lik bir yoğunlukta bir PDL kaplı 35 x 10 mm doku kültürü çanağı içinde kaplandı. B. Omurilik mikroglia parlak saha dosyasını kültür iki gün sonra. Mikroglia (mavi oklar) ve astrositler (kırmızı oklar) gösterilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroglia MSS normal işleyişi yanı sıra çeşitli patolojiler için inflamatuar yanıtları modüle. Mikroglia tarafından fonksiyonel sinaptik yeniden normal beyin dengesinin 15 bakım sorumlu tutulmuştur. Nörojenik kaskad sırasında, hipokampus 4, 16 dentat girus gelen nöral progenitör hücrelerin boşluk katılmak. Bu nedenle, mikrogliya birden fazla ayrı işlevlere sahip olan boyunca gelişim ve yetişkinlik büyük tarama alanı kapsayacak yenidoğan ve yetişkin mikroglia, çalışma hangi bir kültür sistemi geliştirmek için gereklidir. Biz yetişkin omurilik ve neonatal beyin kültüre mikrogliya için hızlı ve etkili bir yöntem ana hatlarıyla. Biz% 70 astrositlerin oluşan geri kalan yüzde ile mikroglia ve% 100 yaklaşan yenidoğan mikrogliyal preparatlarıyla saflığı olan yetişkin hücre hazırlıkları elde başardık.

Rolü göz önüne alındığında, that astrositler mikroglia 17-19 aktivasyon durumuna düzenlenmesinde, bu kültür saflığını geliştirmek için kültür koşulları optimize etmek için önemli olan adres. DAPI Fluoromount bir eşit hacmi ile hücre süspansiyonu birleştiren doğru bir hücre sayımı için olanak sağlasa da, bu yöntem ile diğer hücre tiplerinden mikroglia ayırt etmek mümkün değildir. Yetişkin mikroglial preparatın saflığı iyileştirmek için, GFP kaplı Dynabeads olan miyeloid hücrelerin önceden GFP ifade 20 MacGreen farenin türetilen hücre süspansiyonu ile inkübe edilebilir. Başka bir öneri levhasına önceden astrositik eki 13 bilmek PDL kaplanmış edilmemiştir kültür kapları içinde karma hücre süspansiyonu olacaktır. Ancak, daha önce elimizde yenidoğan ve yetişkin hücreleri hem de uygulanabilir olan, kaplanmış sürece hiçbir hücre plaka üzerinde büyümeye bulduk.

Isol için yöntemleri tarif eden pek çok farklı protokolya fare ya da fare beyin dokusundan tirme ve primer mikroglia kaplama mikroglia ayırmak ve böylece aşağı deneyler 12 için saf nüfus elde etmek için karışık glial kültürlerin sallayarak kullanmaktadır. Bizim protokol sallayarak adım hariç en belirgin farklılık, ve bunun yerine tam titre kültür koşulları ile bir mikrogliyal-sadece nüfusun arıtma odaklanan. Bizim tecrübelerimize göre, mikrogliya kaldırmak için karışık glial kültür sallayarak etkilidir, ama önemli bir dezavantajı var - sarsılmış mikrogliya tam bir dinlenme morfolojisi 12 dönmek için birçok gün sürebilir gerçeği. Bu aktif mikroglia oldukça farklı sitokin profili 21 olması göz önüne alındığında sorunlu olabilir. Bizim protokol, saf mikrogliya elde etmek için biraz daha uzun alırken, boyunca bir dinlenme durumunda hücreleri korur. Bir sonraki paragrafta ele yetişkin hazırlık olduğu gibi, bizim yöntemin bir dezavantajı bir Possi olanyani diğer hücre tipleri, astrositlerde küçük kirlenme çıkarak.

Kültür yetişkin mikroglia için bizim teknik yöntemler önceden var olan önemli ölçüde değişir. Birçok protokol, yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye (Percoll) yanı sıra saf mikroglial nüfus 22 elde etmek için akış sitometrisinin kullanım kullanımını gerektirir. Yetişkin omurilikten istikrarlı bir mikrogliyal kültür yaratma Geliştirilen yöntemde biz takip etmek araştırmacı için daha az zaman alıcı ve karmaşık protokol için yapar ya tekniği, kullanmıyoruz. Yetişkin mikroglial preparatların büyük çoğunluğu beyin dokusundan gelir iken, omurilik, aynı hücre tipleri arasında oluşur - ve bu nedenle protokol daha önce tarif edilen yöntemler 22 adil bir karşılaştırma sunulur. Protokolde bir dengede astrositik çoğunlukla uydu alıcısı olan hücrelerin geri kalan kısmı ile,% 70 mikroglia oluşan, biraz daha az saf mikroglial hazırlanmasıdırn. Bu tutarsızlık, potansiyel olarak bu tür manyetik boncuk ile konjuge Gözler-1 ve F4/80 olarak mikroglial soyunun çok özel bir hücre tipi belirteçleri kullanarak daha fazla saf mikroglia tecrit ilave bir aşama kullanılarak aşılabilir.

Bu normal gelişimi mikroglia için bir rol ile ilgili sorulara cevap olarak etkileyen patolojilerin için sağlam bir yaklaşım ise, omurilik neonatal beyin hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir edilmiş ve etkileyen nörolojik hastalıklarda mikroglia rolünü değerlendirmek çalışmaların çoğu beyin özellikle, biz daha özel bir yöntem yetişkin omurilikte mikrogliya fonksiyonunu incelemek için kurulacak zorunda hissettim. Bizim neonatal yöntemi de bazı patolojik durumlarda olduğu gibi beynin normal işleyişini ilgili en sorulara cevap için çok etkili bir yoldur, ve yetişkin yöntemi immünolojik cevap olarak değişkenlik verilen bu tür çalışmalar için yenidoğan hücrelerin kullanımı için iyi bir alternatiftirs yenidoğan mikroglia ve yetişkin hücreleri arasında ve beyin mikroglia ve omurilik 6-9 arasında. Metod elde edilen mikroglia in vitro da ko-kültür çalışmaları (laboratuarımızda nöronlar veya oligodendrosit ile öncelikle kültür onlar) için uygun bu adresi diğer hücre türleri mikroglia etkisi hem de aktive için yenidoğan ve yetişkin mikrogliyal yanıt uyaranlara.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Biz onların tavsiye ve yararlı yorumlar için Tsirka laboratuar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma JCN RB, bir NSF-3MT IGERT ve LT için bir Turner Tez dostluk ve NSF-3MT IGERT için, 12PRE12060489 SET R01NS42168 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA, 5mM Invitrogen 15567-028
Lidocaine, 60mM Sigma L-5647
Trypan Blue Sigma T8154
Trypsin/EDTA Cellgro 25-052-CI
DMEM, 1X Cellgro 10-017
Sodium Pyruvate Cellgro 25-000-Cl
Gentamycin Sulfate Biowittaker 17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish Falcon 353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml Dilute 1:20
HBSS, 1X Cellgro 20-023-CV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
  2. Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
  3. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
  4. Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
  6. Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. 383087 (2011).
  7. Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
  8. Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
  9. Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
  10. Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
  11. Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
  12. Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
  13. Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
  14. Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
  15. Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
  16. Tremblay, M. -È, Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
  17. DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer's disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
  18. Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
  19. Min, K. -J., Yang, M. -S., Kim, S. -U., Jou, I., Joe, E. -H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
  20. Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
  21. Ekdahl, C. Microglial activation - tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
  22. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics