एक प्राकृतिक अकोशिकीय आंतों मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए Decellularization क्रियाविधि

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Bioengineering
 

Summary

लेख चूहा आंत से एक अकोशिकीय मैट्रिक्स के उत्पादन के लिए एक कार्यप्रणाली का वर्णन करता है. आंतों scaffolds की व्युत्पत्ति कोशिका जीव विज्ञान और औषधि परीक्षण स्टेम, ऊतक इंजीनियरिंग में भविष्य अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है.

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Maghsoudlou, P., Totonelli, G., Loukogeorgakis, S. P., Eaton, S., De Coppi, P. A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix. J. Vis. Exp. (80), e50658, doi:10.3791/50658 (2013).

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Abstract

सफल ऊतक इंजीनियरिंग इन विट्रो में या विवो में उपयुक्त कोशिकाओं के साथ scaffolds के संयोजन शामिल है. Scaffolds, सिंथेटिक स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न या ऊतकों / अंगों से प्राप्त किया जा सकता है. उत्तरार्द्ध decellularization नामक तकनीक का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. Decellularization भौतिक, रासायनिक, और एंजाइमी तरीकों का एक संयोजन शामिल हो सकता है. इस तकनीक का लक्ष्य मूल ऊतक के स्थूल और सूक्ष्म वास्तुकला बनाए रखने whilst सभी सेलुलर निशान को दूर करने के लिए है.

आंतों के ऊतकों इंजीनियरिंग प्रकार अब तक देशी अंग की जटिल वास्तुकला को दोहराने नहीं है कि अपेक्षाकृत सरल scaffolds इस्तेमाल किया गया है. इस पत्र का ध्यान केंद्रित चूहा छोटी आंत के लिए एक कुशल decellularization तकनीक का वर्णन करने के लिए है. छोटी आंत के अलगाव एक संवहनी कनेक्शन के रखरखाव सुनिश्चित करने के लिए इतनी के रूप में वर्णन किया गया है. whil कोशिकाओं को दूर करने के लिए रासायनिक और एंजाइमी समाधान के संयोजनपाड़ की luminal पहलू में अंकुर-तहखाना अक्ष संरक्षण सेंट भी बाहर सेट है. अंत में, उपयुक्त विशेषताओं के लिए उत्पादन scaffolds के मूल्यांकन पर चर्चा की है.

Introduction

टिशू इंजीनियरिंग (ते) प्रतिरक्षादमन और अंग की कमी के मुद्दों को दरकिनार, अंग प्रत्यारोपण के लिए एक चिकित्सकीय विकल्प प्रदान करता है. ते हाल ही में इस तरह के वयस्कों 3,4 और बच्चों को 5 में दोनों मूत्राशय 1, मूत्रमार्ग 2 और श्वासनली, जैसे अंगों के प्रतिस्थापन के साथ, क्लिनिक में सफल अनुप्रयोगों पड़ा है.

एक ऊतक इंजीनियर अंग बिल्डिंग उपयुक्त कोशिकाओं के साथ एक चबूतरा का संयोजन जरूरी है. एक पाड़ स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न (जैसे कोलेजन) का उपयोग कर तैयार है और सिंथेटिक (जैसे पाली एल एसिड, PLGA) किया जा सकता सामग्री, या देशी अंगों और ऊतकों की decellularization द्वारा प्राप्त किया जा. आंतों ते के लिए इस प्रकार अब तक इस्तेमाल किया गया है कि scaffolds मुख्य रूप से 6-13 (पाली एल एसिड और पाली लैक्टिक एसिड) decellularized (छोटे आंतों submucosa) या कृत्रिम या तो कर दिया गया है. इन biomaterials, स्थूल और सूक्ष्म वास्तुकला दोनों में बहुत सरल हैं जोऊतक इंजीनियर आंत चिकित्सकीय अनुवाद किया जाना है, तो आदर्श नहीं हो सकता. आंत के लिए एक इष्टतम biomaterial के साथ सहायता luminal ओर मेजबान के रक्त की आपूर्ति, आंतों की दीवारों की परतों को प्रतिबिंबित करने के लिए विभिन्न गुणों के साथ एक tiered ट्यूबलर दीवार और एक अंकुर-तहखाना धुरी से जोड़ा जा सकता है कि एक जन्मजात संवहनी पेड़ होनी चाहिए उपकला स्टेम कोशिकाओं से repopulation.

Decellularization उनके मूल वास्तुकला 14 बनाए रखने के पूरे अंगों से कोशिकाओं को निकाल कर scaffolds उत्पादन एक उपन्यास पद्धति है. यह वे अंग की संरचना को दोहराने लेकिन यह भी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कि सहायता सेलुलर प्रसार और भेदभाव के भीतर एम्बेडेड रासायनिक संकेत होते ही नहीं, क्योंकि पहले से ही scaffolds मौजूदा करने के लिए बेहतर है. 2008 में एक शव का श्वासनली मरीज ​​की अपनी कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त, 14 decellularized, और एक युवक में मुख्य बाईं श्वसनी बदलने के लिए प्रत्यारोपित किया गया था 15, जिगर 16,17, और फेफड़ों 18-20 के लिए decellularized scaffolds के उत्पादन की सूचना दी है.

हम भी एक छोटी आंतों decellularized पाड़ 21 निर्माण करने के लिए एक ही पद्धति को ढाल लिया है. इस के साथ साथ वर्णित विधि के लक्ष्य को इस तरह के रक्त की आपूर्ति के रूप में मूल ऊतक, साथ ही आंतों लुमेन में अंकुर-तहखाना अक्ष के सूक्ष्म वास्तुकला के macroscopic विशेषताओं को बनाए रखने कि decellularized आंतों matrices का उत्पादन होता है. हम इस पद्धति अंततः decellularization की दक्षता में सुधार करने के लिए अन्य अंगों के लिए अपनाया जा सकता है.

Protocol

1. चूहा आंत का अलगाव

  1. 1% एंटीबायोटिक / कवकनाशी (सिग्मा, ब्रिटेन) (पीबीएस / एए) के साथ फॉस्फेट buffered खारा (सिग्मा, यूके) के एक 1 एल समाधान तैयार करें. दो ट्यूबों के साथ क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (Masterflex एल / एस चर गति) फिट. एक और 15 मिनट के लिए पीबीएस / ए.ए. द्वारा पीछा अधिकतम गति से 15 मिनट के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के ट्यूब के माध्यम से 70% इथेनॉल (EtOH) चलाएँ.
  2. सीओ 2 साँस लेना और (ब्रिटेन में, पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 के तहत गृह मंत्रालय के दिशा निर्देशों) स्थानीय पशु दिशा निर्देशों और अनुमोदन के अनुसार गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से लगभग 250-350 ग्राम वजन वयस्क Sprague-Dawley चूहों euthanize.
  3. उपयोग से पहले सर्जिकल उपकरणों आटोक्लेव. स्प्रे और EtOH 70% का उपयोग कर पशु का पेट पोंछ.
  4. एक स्पष्ट शल्य चिकित्सा क्षेत्र सुनिश्चित करने के लिए पेट पर एक xifo-जघन laparotomic चीरा प्रदर्शन करना.
  5. 70% EtOH के साथ स्प्रे एक कागज तौलिया पर पशु के सही पक्ष पर छोटी आंत अंतड़ी निकालना. Takबाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के ऊतक और विकृतीकरण के निर्जलीकरण से बचने के लिए लगातार पीबीएस / ए.ए. के साथ आंत गीला करने के लिए ई देखभाल.
  6. आंत की ओर महाधमनी से एक 90 डिग्री के कोण में उत्पन्न होने वाली बेहतर mesenteric धमनी (SMA) का पता लगा. महाधमनी से SMA भरिये और जल्दी से पोत की दीवार फाड़ से बचने के लिए सुई वापस लेने के लिए एक 27 जी प्रवेशनी प्रयोग करें. SMA में प्रवेशनी की प्लास्टिक ट्यूब अग्रिम और टांके (Vicryl 5/0) का उपयोग कर सुरक्षित.
  7. पीबीएस / ए.ए. के 1 मिलीग्राम इंजेक्शन द्वारा केन्युलेशन की पुष्टि करें. प्रवेशनी जारी करने के लिए इतनी के रूप में एसएमए को महाधमनी प्रॉक्सिमल और बाहर काटकर अलग कर देना करने के लिए वसंत कैंची का प्रयोग करें.
  8. बड़ी आंत बाहर विदारक जब मल के रिसाव से बचने के लिए, एक (सिल्क 5/0) सिवनी शेषान्त्रोण्डुकीय जंक्शन के समीपस्थ छोर पर गाँठ और अवग्रह बृहदान्त्र के बाहर अंत में एक जगह है. फिर दो समुद्री मील के बीच टर्मिनल ileum और पेट में कटौती और बड़ी आंत को हटा दें.
  9. Jejuno-ग्रहणी जंक्शन एक में आंत कटND यह पेट के साथ हो सकता है कोई संयोजी ऊतक कनेक्शन से आंत मुक्त.
  10. पीबीएस / ए.ए. के साथ एक पेट्री डिश में छोटी आंत स्थानांतरण. एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट (LSL प्रयोगशाला उपभोज्य) के साथ आंत के समीपस्थ खंड cannulate और टांके के साथ उसे सही जगह पर. यह एक 60 मिलीलीटर सिरिंज का Luer लोक (बी Plastipak) फिट होगा तो पिपेट काटें. आंतों लुमेन मल और मलबे को हटाने के लिए पीबीएस / ए.ए. की 60 मिलीलीटर के साथ 2x फ्लश.

2. Decellularization क्रियाविधि

  1. एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी को संवहनी प्रवेशनी कनेक्ट करें. इस से निपटने में आसानी संवहनी पेड़ पर तनाव को कम करने और ट्यूबिंग से बुलबुले को दूर करने के लिए अनुमति देगा.
  2. 0.6 मिलीग्राम / घंटा पर Masterflex एल / एस चर गति रोलर पंप के माध्यम से विआयनीकृत पानी (प्रतिरोधकता 18.2 MΩ / सेमी) चलने लगते हैं. कोई बुलबुले से पहले आंतों लुमेन पानी निकलने की टोंटी के साथ जोड़ने के लिए ट्यूबिंग भीतर मौजूद हैं सुनिश्चित करें. कुछ बुलबुले कदम से लुमेन के भीतर मौजूद हो सकता है1.9, decellularization प्रक्रिया ख़राब हो सकता है. पंप की गति भिन्न है और बाहर का अंत से बुलबुले बाहर निकलने सुनिश्चित करने के लिए सावधानी से संदंश के साथ ऊतक संभाल. उच्च गति संवहनी पेड़ को नुकसान पहुंचा सकता है क्योंकि इस प्रक्रिया समाप्त हो गया है जब तक संवहनी प्रवेशनी कनेक्ट न करें.
  3. Decellularization के निम्नलिखित कदम 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, के बाद से ठंडे कमरे के लिए तंत्र स्थानांतरण कम तापमान ऊतक अपघटन को कम करने, whilst कोशिकाओं को हटाने की अनुमति देता है. बह निकला समाधान एकत्रित करेगा कि एक कंटेनर में पेट्री डिश रखें. 0.6 मिलीग्राम / घंटा से कम 24 घंटे के लिए आंतों लुमेन और विआयनीकृत पानी के साथ संवहनी पेड़ (प्रतिरोधकता 18.2 MΩ / सेमी) दोनों छिड़कना. पहले घंटे के सभी कनेक्शन सुरक्षित हैं सुनिश्चित करने के लिए नियमित रूप से तंत्र की जांच के लिए, रिसाव कम है और कोई बुलबुले आंत के भीतर मौजूद हैं.
  4. विआयनीकृत पानी के साथ इलाज के 24 घंटे के बाद, कदम उठाए हैं क्योंकि बाकी ठंडे कमरे के बाहर decellularization तंत्र को स्थानांतरितकमरे के तापमान (आर टी) में किया जाता है.
  5. विआयनीकृत पानी में एक 4% समाधान के 300 मिलीलीटर तैयार करने के लिए सोडियम deoxycholate (सिग्मा, ब्रिटेन) वजन. यह एक मौखिक और आंख अड़चन है, के रूप में एक सक्शन हुड के अंतर्गत सोडियम deoxycholate वजन. समाधान स्पष्ट है जब तक एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं. समाधान के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जा सकता है.
  6. किसी भी बुलबुले को दूर और 0.6 4 घंटे के लिए मिलीलीटर / घंटा पर छिड़कना, कनेक्शन की जांच, सोडियम deoxycholate विआयनीकृत समाधान बदलें.
  7. सोडियम deoxycholate और DNase मैं के बीच बातचीत से बचने के लिए 30 मिनट के लिए पीबीएस / ए.ए. के साथ सोडियम deoxycholate कदम धोने के बाद.
  8. Deoxyribonuclease मैं (DNase मैं, सिग्मा) वजन और 1 एम सोडियम क्लोराइड, 7.4 पीएच में एक 2,000 केयू समाधान के 250 मिलीलीटर तैयार करते हैं. समाधान स्पष्ट है जब तक एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं. इस समाधान का उपयोग करने से पहले तुरंत तैयार रहना चाहिए और संग्रहीत नहीं किया जा सकता.
  9. 0.6 मिलीग्राम / घंटा की रफ्तार से आरटी पर 3 घंटे के लिए DNase मैं के साथ छिड़कना.
  10. DNase मैं कदम के बाद, हस्तांतरणएक टिशू कल्चर हुड में पाड़ और प्लेटें और उपकरणों को बदलने. यह सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने का सुझाव दिया है.
  11. Decellularization समाधान के सभी अवशेष को हटा रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए पीबीएस / ए.ए. के साथ धोएं. एक नया पेट्री डिश में पाड़ प्लेस और एक यूवी crosslinker (Spectroline, अमेरिका) के लिए स्थानांतरण. दो नसबंदी चक्र चलाते हैं. हर 3 दिन 5% पीबीएस / ए.ए. में दुकान और समाधान बदल जाते हैं.

Representative Results

सफल decellularization (चित्रा 1) पर, पाड़ देशी आंत से एक के जैसा एक macroscopic उपस्थिति होनी चाहिए, लेकिन पारदर्शी दीवारों (2A चित्रा) के साथ. स्थूल वास्तुकला के संरक्षण भी संवहनी पेड़ की प्रत्यक्षता से स्पष्ट हो जाना चाहिए. डाई SMA प्रवेशनी के माध्यम से इंजेक्ट किया जाता है, जब वह पाड़ भर में समान रूप से वितरित करने और केशिका पेड़ (चित्रा 2B) तक पहुंच जाना चाहिए. पाड़ परमाणु और cytoplasmic सामग्री, एक डीएनए मात्रा का ठहराव किट और सरल ऊतकीय विश्लेषण का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है कि कुछ से मुक्त होना चाहिए. Hematoxylin और eosin धुंधला (एच एंड ई) छोटे आंतों परतों (चित्रा 3) के संरक्षण whilst के परमाणु और cytoplasmic सामग्री की अनुपस्थिति का प्रदर्शन करना चाहिए. विशेष रूप से, luminal ओर विल्ली और तहखाने के रखरखाव स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) के बाद स्पष्ट किया जाना चाहिए. एकऐसे कोलेजन, elastin और glycosaminoglycans के रूप में बाह्य मैट्रिक्स घटकों का संरक्षण भी उम्मीद की जानी चाहिए. उदाहरण के लिए, पाड़ (3B चित्रा) में मैसन का Trichrome धुंधला प्रदर्शित करता बरकरार संयोजी ऊतक.

चित्रा 1
चित्रा 1. . Decellularization प्रक्रिया की प्रायोगिक योजना समय, पीबीएस / ए.ए.: एंटीबायोटिक कवकनाशी, NaDeoxy साथ फॉस्फेट बफर खारा: सोडियम deoxycholate, आरटी: कमरे के तापमान, DNase मैं: deoxyribonuclease-मैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. पाड़ macroscopiसी विशेषताओं. सफल decellularization निम्नलिखित चूहा छोटी आंत के macroscopic उपस्थिति (ए). रोसो काकरेज़ी रंग एसएमए के माध्यम से डाई का इंजेक्शन एक अक्षुण्ण संवहनी नेटवर्क (बी) को दर्शाता है, SMA: बेहतर mesenteric धमनी बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. . प्रोटोकॉल एच एंड ई (ए) और मीट्रिक टन (बी) धुंधला संयोजी ऊतक वास्तुकला के संरक्षण के साथ सेलुलर सामग्री के अभाव से संकेत मिलता है, एच एंड ई: hematoxylin और eosin, मीट्रिक टन: मैसन का trichrome. स्केल बार:. 100 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 4
चित्रा 4. . इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी पाड़ लुमेन में संरक्षित अंकुर-तहखाना वास्तुकला इंगित करता है, स्केल पट्टी:. 100 माइक्रोन बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

इस प्रयोग की स्थापना में सबसे कठिन कदम SMA के केन्युलेशन और स्थापना और बाँझपन का रखरखाव शामिल है. दीवार rupturing बिना कृन्तकों में SMA Cannulating कारण जहाज के आकार और स्थिति के लिए काफी मुश्किल हो सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक सीवन SMA में प्लास्टिक प्रवेशनी निर्देशन, distally महाधमनी खुद की केन्युलेशन, जिसके बाद पूर्व SMA मूल के समीपस्थ महाधमनी के आसपास रखा जा सकता है. Decellularization दौरान गरीब प्रवेशनी प्लेसमेंट और उच्च प्रवाह दरों का एक संयोजन नाड़ी का उपयोग खोने में परिणाम हो सकता है. बाँझपन छोटी आंत में मौजूद बैक्टीरिया वनस्पति की मात्रा के कारण एक प्रमुख मुद्दा है. फसल निम्नलिखित पीबीएस / ए.ए. के साथ वॉशिंग बहुत महत्वपूर्ण है, और fecal बात या मलबे के कोई संकेत लुमेन से हटा दिया जाना चाहिए. बाँझपन हासिल किया गया है अगर यूवी बंध्याकरण निम्नलिखित इनक्यूबेटर में DMEM के साथ एक बाज़ ट्यूब में पाड़ के एक हिस्से को रखकर एक संकेत किया जाना चाहिए. स्थिति मेंबैक्टीरियल उपनिवेशवाद का, मीडिया उसका रंग पीला लाल से बदल के साथ पीएच बदल जाएगा. इस के साथ सौदा करने के लिए, आगे यूवी चक्र पीबीएस एंटीबायोटिक / कवकनाशी के एक उच्च एकाग्रता को रोकने के साथ धोने के साथ ही सलाह दी जाती है.

संवहनी और शिरापरक दोनों का उपयोग के साथ एक पाड़ पाने के संभावित संशोधन अवर रग Cava (IVC) और साथ ही SMA cannulate के लिए किया जाएगा. शिरापरक और नाड़ी पक्षों से Decellularization सभी तीन समाधान के लिए रहकर प्रयास किया जाना चाहिए. सतत decellularization दोनों पक्षों पर सकारात्मक दबाव होने से केशिकाओं फट सकता है.

इन वर्षों में इन विट्रो और इन विवो 6,9,12 में अलग सेल पाड़ संयोजन का उपयोग आंतों ते में प्रयास के एक नंबर दिया गया है. काम के बहुमत कोलेजन प्रकार मैं 6,7,13,22 के साथ लेपित ट्यूबलर nonwoven 95% पीजीए-5% PLGA scaffolds का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. आंतों के साथ के बाद बोनेउपकला organoid इकाइयों (OUs) और चूहों की omentum में आरोपण की अवधि, वे तो tubularized किया जा सकता है पर बाहर और अंदर उपकला पर पेशी से अल्सर के रूप में. हालांकि, इन scaffolds के डिजाइन में porosity और सादगी ऐसी एक बायोरिएक्टर के रूप में इन विट्रो वातावरण में कृत्रिम आंत के बड़े टुकड़े की पीढ़ी के लिए अनुमति नहीं देता है. इसके अलावा अतिरिक्त प्राप्तकर्ता को जोड़ा जा सकता है कि एक जन्मजात संवहनी नेटवर्क की कमी के नैदानिक ​​अनुवाद के लिए इस पाड़ के उपयोग की सीमा. पीजीए-PLGA scaffolds के साथ प्रयोगों के अलावा, अन्य समूहों आंत्र पथ की कठिनता को दोहराने नहीं है, जो दोनों के कोलेजन या बहन scaffolds, का इस्तेमाल किया है. एसआईएस विशेष रूप से आंतों ऊतक इंजीनियरिंग की ही पिछली प्रकाशित पद्धति है और यांत्रिक स्थिरता प्रदान करने और नेतृत्व, whilst सेल के विकास को बढ़ावा देने के decellularized scaffolds की क्षमता का प्रदर्शन, 150 से अधिक चिकित्सा सेटिंग में इस्तेमाल किया गया हैकोई immunogenic प्रतिक्रिया रही है. हालांकि, उचित मैक्रो और माइक्रो आर्किटेक्चर की कमी, पेट ते प्रयोजनों 9-11,23 के लिए 'अपने प्रयोग में खराब परिणाम के लिए प्रेरित किया.

हम वर्णन किया है decellularization पद्धति का लाभ आंतों स्टेम सेल आला द्वारा repopulation के लिए एक उपयुक्त वातावरण का प्रतिनिधित्व करते हैं कि इस तरह के luminal तहखाना-अंकुर वास्तुकला के रूप में सूक्ष्म विशेषताओं के संरक्षण में शामिल हैं. Macroscopic पहलू में, एक श्रेणीबद्ध संवहनी नेटवर्क की उपस्थिति ते आंत 21 के सभी परत के लिए पोषक तत्वों और ऑक्सीजन के प्रावधान की अनुमति, प्राप्तकर्ता को अनुलग्नक सक्षम हो जाएगा. क्या अधिक है, ऐसे कोलेजन, elastin और glyocosaminoglycans रूप ईसीएम घटकों के रखरखाव यांत्रिक विशेषताओं के लिए बल्कि सेलुलर प्रसार और भेदभाव का निर्देशन न केवल एक महत्वपूर्ण भूमिका है. सबसे महत्वपूर्ण बात, decellularization पद्धति की क्षमता बड़ी में बढ़ाया जा करने के लिएएक ही विशेषताओं को बनाए रखने whilst आर ऊतकों ते के नैदानिक ​​अनुवाद के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता है.

एक संवहनी नेटवर्क के साथ एक प्राकृतिक आंतों मैट्रिक्स के विकास मेजबान से जोड़ा जा सकता है कि कृत्रिम आंत के बड़े भाग के निर्माण की अनुमति देता.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल के विकास के साथ उनकी मदद के लिए रिजनरेटिव मेडिसिन के जागो वन संस्थान धन्यवाद. हम ग्रेट Ormond स्ट्रीट अस्पताल दान से अनुदान द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं, फाउंडेशन Eugenio Litta (जिनेवा, स्विट्जरलैंड), चिकित्सा अनुसंधान परिषद, ब्रिटेन के लिए इंग्लैंड के सर्जन, स्पार्क्स बच्चों के मेडिकल चैरिटी, ब्रिटिश विदेश कार्यालय के रॉयल कॉलेज / अमरीका सेल सहयोग पुरस्कार और मित्तल रिसर्च फंड स्टेम. हम भी बाल स्वास्थ्य संस्थान में बाल चिकित्सा सर्जरी विभाग के लिए प्राप्त ऊतक इंजीनियरिंग प्रयोगशाला नवीनीकरण के अनुदान के लिए रॉयल सोसायटी / वोल्फसन फाउंडेशन को धन्यवाद देना चाहूंगा. पीडीसी और एसई ग्रेट Ormond स्ट्रीट अस्पताल बच्चों के दान के द्वारा समर्थित हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol solution, 70% in H20 Sigma 02877
Phosphate buffered saline tablets Sigma 79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) Sigma A5955
Sodium deoxycholate Sigma D6750 Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025

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References

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