一脱细胞方法对天然脱细胞基质肠的生产

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Summary

本文介绍了用于生产从大鼠小肠脱细胞基质的方法。肠道支架的推导是重要的组织工程未来的应用,干细胞生物学和药物测试。

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Maghsoudlou, P., Totonelli, G., Loukogeorgakis, S. P., Eaton, S., De Coppi, P. A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix. J. Vis. Exp. (80), e50658, doi:10.3791/50658 (2013).

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Abstract

成功的组织工程支架包括与适当的细胞在体外在体内的结合。支架可以是合成的,天然衍生的或从组织/器官中得到。后者使用的是所谓的脱细胞技术来获得。脱细胞可能涉及的物理,化学和酶相结合的方法。该技术的目标是消除所有蜂窝痕迹,同时保持原始组织的宏观和微观结构。

肠组织工程迄今已使用相对简单的支架不复制原生器官的复杂结构。本文的重点是描述对大鼠小肠一种有效的脱细胞技术。小肠的隔离,以保证血管连接的维护进行说明。化学和酶溶液的组合,以除去细胞whilST保留绒毛隐窝轴支架的管腔方面亦载。最后,制作支架的相应特性的评估进行了讨论。

Introduction

组织工程(TE)提供了一个治疗选择器官移植,绕过免疫抑制和器官短缺的问题。 TE最近有在临床的成功应用,具有替代器官,如膀胱1,尿道口2和气管,无论是在3,4成人和儿童5。

构建组织工程化器官需要一个支架与适当的细胞相结合。甲支架可以使用天然来源的( 胶原蛋白)进行制备和合成的( 例如,聚-L-羟基乙酸; PLGA)的材料,或由天然器官和组织的脱细胞来获得。已经使用的迄今为肠TE支架主要被任一脱细胞(小肠粘膜下层)或合成的(聚-L-羟基乙酸和聚乳酸)6-13。这些生物材料是很简单的在宏观和微观架构,可能不是很理想,如果组织工程小肠被临床换算。对于肠道的最佳生物材料应具有一种天生的血管树,可连接到主机的血液供应,分层管状壁具有不同的属性,以反映对肠壁的各层和绒毛隐窝轴线上的腔侧,以帮助用再增殖上皮干细胞。

脱细胞是从整个器官取出细胞,同时保持其原有的建筑14棚架产生了一种新的方法。这是优选的,以现有的支架,因为它们不仅复制该器官的结构,而且包含嵌入的细胞外基质(ECM),该辅助细胞的增殖和分化中的化学信号。在2008年一个尸体气管脱细胞14,播种与患者自身的细胞,并移植到更换主力左支气管的年轻人15,16,17肝和肺18-20。

我们还适于相同的方法,以产生一个小肠粘膜脱细胞的支架21。本文所描述的方法的目的是产生一个保持原有的组织,例如血液供应,以及绒毛隐窝轴在肠腔内的微观结构的宏观特征脱细胞的肠矩阵。我们相信,这种方法可能最终会采用其他器官,以提高脱细胞的效率。

Protocol

1。大鼠肠隔离

  1. 制备磷酸盐缓冲盐水(Sigma公司,英国)的1升溶液中含有1%抗生素/抗真菌剂(Sigma公司,英国)(PBS / AA)。适合蠕动泵(的Masterflex L / S变速)与两个管子。通过蠕动泵15分钟,在最大速度下的管中,然后PBS / AA另外15分钟运行70%乙醇(EtOH中)。
  2. 安乐死成年SD大鼠的CO 2吸入并根据当地动物的指引及批准(在英国,在动物(科学规程)行动1986年内政部指引)颈椎脱臼重约250-350克。
  3. 使用前高压灭菌的手术器械。喷雾和擦拭用70%乙醇的动物的腹部。
  4. 执行上腹部xifo-耻骨开腹切口,以保证术野清晰。
  5. 剔骨右侧动物的小肠到纸巾上喷以70%的乙醇。德ë护理连续润湿,用PBS / AA肠腔从而避免细胞外基质(ECM)的组织和变性的脱水。
  6. 定位肠系膜上动脉(SMA)在从朝向肠主动脉成90°角而产生。使用一个27G的套管从主动脉进入SMA和迅速退出针以避免撕裂容器的壁。推进套管的塑料管插入SMA和安全使用缝线(薇乔5/0)。
  7. 通过注入1ml的PBS / AA的确认插管。使用弹簧剪刀切开主动脉近端和远端向SMA以便释放插管。
  8. 避免粪便泄漏解剖出大肠时,放置在回盲结的近端1(丝5/0)缝合线结,一个在乙状结肠的远端。然后切两个结之间的回肠末端和结肠并取出大肠。
  9. 切开肠管在空肠 - 十二指肠交界处ND释放肠任何结缔组织连接,它可能与腹部。
  10. 转让在培养皿用PBS / AA小肠。导管插入肠的近端部分有一个塑料巴斯德吸管(LSL实验室消耗品),并用缝合线将其固定到位。切吸液管,因此将适合露儿乐60 ml注射器中(BD Plastipak)。冲洗肠腔用60毫升的PBS / AA的2倍,除去粪便和杂物。

2。脱细胞方法

  1. 血管插管连接到三通旋塞阀。这将缓解处理,尽量减少紧张局势血管树,并允许去除气泡从管子。
  2. 开始通过的Masterflex L / S变速滚轮泵为0.6毫升/小时运行去离子水(电阻率18.2MΩ/平方厘米)。确保无气泡与肠腔旋塞阀连接之前,内管存在。一些泡沫可能是从步骤管腔内本1.9,这可能会损害脱细胞过程。改变泵的速度和处理组织钳小心,以确保气泡出口的远端。直到这个过程结束,因为高转速可能会损坏血管树不要连接血管插管。
  3. 传送装置向冷室中,由于在4℃下进行脱细胞的接下来的步骤在较低温度时允许去除细胞的同时最大限度地减少组织分解。将培养皿在一个容器,将收集四溢的解决方案。 24小时为0.6毫升/小时灌注两肠腔和血管树,用去离子水(电阻率18.2MΩ/平方厘米)。对于第一个小时定期检查设备,以确保所有的连接牢固,漏电极小,无气泡是肠道内出现。
  4. 后,用去离子水治疗24小时,脱细胞移动设备中的冷室作为步骤外其余在室温(RT)下进行。
  5. 权衡脱氧胆酸钠(Sigma公司,英国)以制备300毫升在去离子水中的4%溶液。称取去氧胆酸钠吸气罩下,因为它是一种口服和眼睛有刺激性。混合使用涡旋直至溶液澄清。可将溶液保持在4℃下长达1个月。
  6. 改变去离子解决脱氧胆酸钠,请检查连接,消除任何气泡和灌注0.6毫升/小时4小时。
  7. 以下的脱氧胆酸钠步骤洗涤,用PBS / AA 30分钟,以避免脱氧胆酸钠和DNA酶-I之间的相互作用。
  8. 称出脱氧核糖核酸酶-I(DNA酶I,Sigma)和准备在1M氯化钠,pH值7.4加入250毫升一2000 KU溶液。混合使用涡旋直至溶液澄清。该溶液必须在使用前立即制备,并可以不被存储。
  9. 灌注用DNase-I为3小时,在室温下以0.6毫升/小时的速度。
  10. 随着DNA酶-I步,转移脚手架成组织培养罩和改变板和仪器。它建议使用无菌技术。
  11. 用PBS / AA 30分钟洗,以保证脱细胞解决方案的所有残余都被删除。将支架在一个新的培养皿中,并转移到一个UV交联剂(SPECTROLINE,美国)。运行两个灭菌循环。存放在5%的PBS / AA和更改解​​决方案每3天。

Representative Results

在成功脱细胞( 图1),该支架应该具有宏观外观类似于天然肠中的一个,但具有半透明的壁( 图2A)。宏观架构的保存也应该由血管树的通畅性是显而易见的。当染料是通过SMA插管注射,应该均匀地分布在整个支架和到达毛细管树( 图2B)。棚架的结构应该是免费的细胞核和细胞质材料,东西,可以使用DNA定量试剂盒和简单的组织学分析进行评估。苏木精伊红染色(H&E)应表现出缺乏的细胞核和细胞质物质,同时保留小肠层( 图3A)。特别是,在腔侧的绒毛和隐窝中的维护应明显下列扫描电子显微镜( 图4)。一保护细胞外基质组分如胶原,弹性蛋白和粘多糖的还应预期。例如,在所述支架( 图3B)马松三色染色显示完整的结缔组织。

图1
图1。实验计划时间表的脱细胞处理程序; PBS / AA:磷酸盐缓冲液与抗生素抗真菌,NaDeoxy:脱氧胆酸钠,RT:室温,DNA酶-I:脱氧核糖核酸酶-I 点击这里查看大图

图2
图2。脚手架macroscopiC特征。大鼠小肠下成功脱细胞肉眼外观(A)。注射罗索丽春红染过SMA的演示了一个完整的血管网(B)平均:肠系膜上动脉点击这里查看大图

图3
图3。 。组织学H&E(A)MT(B)染色表明缺乏与保存结缔组织结构的细胞物质,H&E:苏木精伊红,MT:Masson染色。比例尺:100微米点击这里查看大图图4
图4。 。电子显微镜扫描电子显微镜表示保留绒毛,隐窝结构的支架内腔;标尺:100微米点击这里查看大图

Discussion

设立这个实验最困难的步骤涉及SMA的插管,并建立和维持无菌的。 Cannulating在SMA在啮齿类动物中而不破裂的壁可以是由于容器的尺寸和位置相当困难的。可选地,缝合线可被置于围绕所述近端主动脉前向SMA原点,其次是主动脉本身远侧插管,指挥塑料插管插入SMA。在脱细胞可怜的导管放置和高流速的组合可能导致丢失的血管通路。不育是由于存在于小肠菌群的数量的一个重大问题。以下收获用PBS洗涤/ AA是非常重要的,并且排泄物或碎屑的任何迹象,必须从腔中移除。在falcon管中,用DMEM将所述支架的一部分在孵化以下紫外线消毒应是一个指标,如果不育已经实现。在该情况下,细菌定植,媒体将改变pH值与来自红的颜色转向黄色。为了解决这个问题,进一步紫外线周期,建议,以及用PBS洗涤含有高浓度的抗生素/抗真菌的。

一个可能的修改以获得既血管和静脉通路支架是将导管插入下腔静脉(IVC),以及对SMA。从静脉血管两侧脱细胞应间歇地尝试所有三种解决方案。连续脱细胞可以由具有在两侧的正压​​力脉冲串的毛细血管。

多年来已经出现了许多体外体内 6,9,12使用不同的细胞支架材料的组合在肠TE努力。大部分工作已经使用涂有胶原蛋白I型6,7,13,22管状非织造布95%的PGA-5%PLGA支架进行。下面播种肠上皮组织体单位(OU),并在一段植入到小鼠的网膜时,它们形成囊肿肌肉上,然后可以卷管内侧到外侧和上皮。然而,在这些支架的设计的孔隙率和简洁不允许用于在体外环境中,例如,一个生物反应器中的大颗人造肠的产生。此外,由于缺乏可连接到接收方的进一步的先天血管网的限制使用这种支架的临床平移。除了与PGA-PLGA支架的实验中,其它基团所用的胶原蛋白或SIS的支架,这两者不复制肠道的复杂性。 SIS尤其是肠组织工程的唯一一次公布的方法,并已应用于150多个医疗环境,展示脱细胞支架,以提供机械稳定性和促进细胞生长,而铅的能力ing到无免疫原性反应。然而,由于缺乏适当的宏观和微架构,导致了其“用于肠道TE的目的9-11,23效果差。

的脱细胞的方法,我们已经描述的优点包括微观特征,如管腔隐窝 - 绒毛体系结构表示为复育适当的环境中被肠干细胞小生境的保存。在宏观方面,一种分级的血管网的存在下,使附着到接收者,从而提供营养和氧气到TE-肠管21的所有层。更重要的是,细胞外基质组分如胶原,弹性蛋白和glyocosaminoglycans的维护不仅对机械特性,而且还指示细胞增殖和分化中起重要作用。最重要的是,脱细胞的方法的能力被放大到大Ř组织,同时保持相同的特性是用于TE的临床翻译的重要特征。

天然肠基质用血管网络的发展允许创建较大的人造肠,可连接到主机的段。

Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者感谢再生医学的维克森林大学的帮助与此协议的开发。我们从大奥蒙德街医院慈善助学金承认的支持,该基金会欧亨尼奥Litta的(瑞士日内瓦),医学研究理事会,英国皇家外科医学院英格兰,火花儿童医疗慈善机构,英国外交部对英国/美国干细胞协同合作奖和米塔尔研究基金。我们还要感谢英国皇家学会/沃尔夫森基金会在儿童健康研究所获得的小儿外科组织工程实验室整修补助金。 PDC和东南由大奥蒙德街医院儿童慈善活动的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol solution, 70% in H20 Sigma 02877
Phosphate buffered saline tablets Sigma 79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) Sigma A5955
Sodium deoxycholate Sigma D6750 Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025

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