कई ट्यूमर मार्कर का लक्ष्य निर्धारण के लिए polymalic एसिड आधारित नैनो बायोपॉलिमर्स: निजीकृत चिकित्सा के लिए एक अवसर?

1Nanomedicine Research Center, Department of Neurosurgery, Cedars-Sinai Medical Center
Published 6/13/2014
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Chemistry
 

Summary

Polymalic एसिड पर आधारित एक नैनो दवा का एक उदाहरण के कैंसर के लिए लागू है कि व्यक्तिगत दवा के तर्कसंगत डिजाइन की ओर से प्रस्तुत किया है. यह एक नग्न माउस में HER2 पॉजिटिव मानव स्तन कैंसर के इलाज के लिए एक नैनो दवा का संश्लेषण का वर्णन करता है.

Cite this Article

Copy Citation

Ljubimova, J. Y., Ding, H., Portilla-Arias, J., Patil, R., Gangalum, P. R., Chesnokova, A., et al. Polymalic Acid-based Nano Biopolymers for Targeting of Multiple Tumor Markers: An Opportunity for Personalized Medicine?. J. Vis. Exp. (88), e50668, doi:10.3791/50668 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

कैंसर के जीनोम (जैव प्रौद्योगिकी और कैंसर जीनोम एटलस के लिए राष्ट्रीय केन्द्र) सुलझाया गया है जब बाद जीनोमिक युग में, कैंसर के भविष्य के उपचार अक्सर एक ही ट्यूमर 1-4 भीतर ट्यूमर के आनुवंशिक विविधता के लिए खाते में जाएगा. जैव सूचना विज्ञान और महंगा, तेजी से नहीं डीएनए अनुक्रमण की अनुमति देता है एक व्यक्तिगत स्तर 2,4,5 पर घातक जीन / परिवर्तन के अधिग्रहण. जीन की पहचान कर लेने के बाद, रोगियों घातक जीन 6 की उनकी अभिव्यक्ति को संशोधित करने या चुप्पी के लिए व्यक्तिगत दवा के साथ इलाज किया जाएगा. कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित और इन कोशिकाओं में दवाएं वितरित करने की आवश्यकता polyfunctional वितरण प्रणाली के लिए कहता है. जाहिर है, नैनो दवाओं इस आवश्यकता को 7 से मिल सकते हैं.

खोजों में से एक बढ़ती लहर में नैनोकणों chemotherapeutic दवाओं, प्रोटीन और / या कैंसर कोशिकाओं के लिए आनुवंशिक रूप से सक्रिय सामग्री के पेलोड को लाने के लिए उपयुक्त साबित किया है. हालांकि, प्रतिकूल प्रभाव विज्ञापन रहनाकपड़े पहने. Biodegradability की अनुपस्थिति से संबंधित उनमें से एक की बीमारियों को भड़काने की संभावना के साथ स्वस्थ ऊतकों और अंगों में सामग्री के बयान का कारण बन सकता है. बयान को कम करने के लिए, हम गैर विषैले और गैर immunogenic polymalic माइक्रोबियल मूल की है जो एसिड, और एच 2 हे और सीओ 2 से 8 biodegradable की शुरुआत की. हम नैनो दवा का एक सब में एक सहसंयोजक प्रकार synthesize करने बहुलक का उपयोग करें. यह ऐसी Temozolomide, डॉक्सोरूबिसिन, या antisense oligonucleotides और परिस्त्राव, ऊतक लक्ष्य endosomolytic वितरण की सेवा कार्य समूहों के रूप में रासायनिक जुड़ी chemotherapeutics होता है. वे जिससे उनके पूर्ण दवा गतिविधि regenerating, लक्षित ट्यूमर सेल में पहुंचे जब दवाओं आंतरिक रूप से नैनो मंच से चिपके रहते हैं.

हम बहुलक नैनो मंच की माइक्रोबियल उत्पादन की विधि, इसकी शुद्धि, और कैंसर के लिए Trastuzumab (Herceptin) शामिल हैं एक नैनो दवा की रासायनिक संश्लेषण का वर्णनHER2 overproduction के निषेध के लिए लक्ष्य निर्धारण और एक antisense oligonucleotide नग्न चूहों पर xenogeneic मानव HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के लिए नैनो दवा को लागू करने में, हम कैंसर के इलाज की उच्च क्षमता प्रदर्शित करता है. polymalic एसिड नैनो दवाओं के लिए यहाँ पेश ट्यूमर लक्ष्यीकरण और जीन मुंह बंद करने के सिद्धांतों के कैंसर के अन्य मामलों के उपचार में लागू किया जा सकता है.

Protocol

सभी प्रयोगों vivo में प्रदर्शन किया और IACUC प्रोटोकॉल के साथ पूर्ण अनुसार कर रहे हैं शल्य चिकित्सा और nonsurgical प्रक्रियाओं सहित सरकारी पशु नियमों का पालन.

Polymalic एसिड की 1. Bioproduction

  1. अगर पर spherules से एक बीज संस्कृति बढ़ो और इनक्यूबेटर और बेसल संस्कृति के माध्यम 8,9 कहा थर्मामीटरों एक 25 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर 100 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से plasmodia हस्तांतरण.
  2. Sporulation से बचने के क्रम में प्रकाश का बहिष्कार तहत गुरुत्वाकर्षण पैक 500 मिलीलीटर सूक्ष्म plasmodia की एक राशि का उत्पादन.
  3. 10 एल बायोरिएक्टर पोत में 8 एल बेसल मध्यम में निलंबित 80 ग्राम 3 Caco तैयार करें. घुड़सवार प्रतिक्रिया पोत में 500 मिलीलीटर पैक सूक्ष्म plasmodia स्थानांतरण और 25 डिग्री सेल्सियस, फ़िल्टर्ड हवा और एक खंड दोषी द्वारा 150 आरपीएम सरगर्मी से 10 एल / मिनट के प्रवाह में 75 घंटे के लिए बायोप्रोसैस अनुमति देते हैं.
  4. संस्कृति शोरबा पीएमएलए के उत्पादन के अंत का संकेत पीएच 4.8 है जब बर्खास्त और टी द्वारा पीएमएलए सामग्री उपायवह / फे (तृतीय) परख hydroxamate.
  5. 17 डिग्री सेल्सियस तक शोरबा शांत और कोशिकाओं गंभीरता से व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. 4 डिग्री सेल्सियस तक कूल और, 7.5 पीएच को समायोजित 2 एम NaOH का उपयोग करें. (5 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच के साथ equilibrated मोटे अनाज DEAE,) शीर्ष पर दिशा नीचे में DEAE सेलूलोज़ के 1.5 एल से भरा एक स्तंभ के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पम्प.
  7. ऊपर से नीचे तक दिशा बदलने के बाद 0.3 एम NaCl युक्त बफर के 3 कॉलम के साथ धोएं और 0.7 एम NaCl की उपस्थिति में पीएमएलए elute
  8. 0.1 एम 2 CaCl को समायोजित करने और 80% बर्फ ठंड इथेनॉल के साथ पीएमएलए कैल्शियम तलछट. , 50 केडीए बफर और नमक के अभाव में पानी का उपयोग करें - 300 केडीए, 50 - 80 - केडीए, और 10 से 80 के पीएमएलए कैल्शियम में Sephadex G25 अधिक fractionate.
  9. एक Amberlite आईआर 120H + स्तंभ पर प्रत्येक अंश गुजरती हैं, और तुरंत lyophilization के लिए तरल नाइट्रोजन में प्रवाह के माध्यम से polymalic एसिड फ्रीज.
  10. शुष्क एसीटोन में भंग. छानने के बाद, विलायक हटानेशून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर शुष्क हवा धारा, lyophilize और दुकान में

2. Polymalic एसिड आधारित नैनो दवा का संश्लेषण

  1. निर्जल एसीटोन के 1 मिलीग्राम और 2 मिलीलीटर डाइमिथाइल formamide (DMF) में 1 mmol एन hydroxysuccinimide और 1 mmol dicyclohexyl carbodimide में पीएमएलए एच के 116 मिलीग्राम (1 mmol malyl यूनिट) के मिश्रण से पीएमएलए (पी) के carboxyl समूहों को सक्रिय करें. 3 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर हलचल. एमपीईजी 5000 राष्ट्रीय राजमार्ग 2 0.05 mmol triethylamine (चाय) के बाद 1 मिलीलीटर DMF में (malyl इकाइयों के 0.05 मोल%) की 0.05 mmol जोड़ें.
  2. बुद्धिमान DMF 0.4 mmol leucine एथिल एस्टर (Loet) (malyl इकाइयों के 40 mol%), में भंग बूंद जोड़ें 0.1 mmol 2-thiol-1-ethylamine (2 विदेश मंत्रालय) (malyl इकाइयों के 10 mol%) और 0.5 mmol चाय, सभी DMF में भंग. बाद इसके अलावा, 1 घंटा की अनुमति और प्रतिक्रिया (पतली परत क्रोमैटोग्राफी, टीएलसी) ninhydrin नकारात्मक प्रतिक्रिया पूरा करने के लिए जाँच करें.
  3. फॉस्फेट बफर खारा (30 मिनट, पीएच 6.8) के साथ सहज हाइड्रोलिसिस से बचे हुए एनएचएस एस्टर को दूर करते हैं. पीडी अधिक फीका बनाना-10 स्तंभ, lyophilization से एक सफेद पाउडर के रूप में "preconjugate" प्राप्त करते हैं. शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर सूखी
  4. 100 मिमी सोडियम फास्फेट, 150 मिमी NaCl, पीएच 5.5 से 4.5 मिलीलीटर में 30 मिलीग्राम एंटीबॉडी (एमएबी, IgG2a-κ) भंग.
  5. 5 मिमी Tris (2 carboxy एथिल) 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए phosphine हाइड्रोक्लोराइड साथ डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने और पी.डी. 10 स्तंभ से अधिक शुद्ध.
  6. एक ही बफर के 2 मिलीलीटर में मल खूंटी 3400-मल को भंग करने और 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में कम एमएबी जोड़ने और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात हलचल Vivaspin 20, अपवर्जन 30 केडी से अधिक 2.5 मिलीलीटर ध्यान लगाओ, और Sephadex G75 से अधिक शुद्ध. सेकंड HPLC से अधिक उत्पाद सत्यापित करें और photometrically 280 एनएम तरंगदैर्ध्य मात्रा को मापने.
  7. मल खूंटी मल एमएबी संलग्न करने के लिए "preconjugate" पी / खूंटी 5000 (5%) / Loet (40%) / एमएबी (0.2%) / 2 विदेश मंत्रालय (10%) प्राप्त करने thiols. , ऊपर बफर पीएच 5.5 में 50 मिलीग्राम (पी / एमपीईजी 5000 / LOEt/2-MEA) को 200 nmol एमएबी खूंटी 3400-मल के 5 एमएल मिश्रण से यह मत करो sulfhy की एकाग्रता को समायोजित2 मिमी dryl और 3 घंटा (98% उपज) के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. Solubilize 3'-एच 2 एन AON DMF / पीबीएस में परीक्षण ninhydrin (1:1 वी / वी) DMF / मेथनॉल (में (पीएच 7.2) और के साथ प्रतिक्रिया एन succinimidyl-3 (2 pyridyldithio) propionate (SPDP) ) और फिर पानी और lyophilize में, मेथनॉल में Sephadex-LH20 अधिक AON-पीडीपी शुद्ध.
  9. डाइसल्फ़ाइड विनिमय प्रतिक्रिया समाप्त होने तक रातोंरात ऊपर तैयार मल खूंटी 3400-मल एमएबी-preconjugate साथ 5.5 पीएच बफर में 800 nmol सक्रिय AONs सेते हैं.
  10. शामिल फ्लोरोसेंट एलेक्सा Fluor 680-maleimide बहुलक-2-विदेश मंत्रालय एसएच साथ thioether बनाने. 3 pyridyldithio-propionate (पीडीपी) के साथ अतिरिक्त sulfhydryls ब्लॉक और Sephadex G75 से अधिक शुद्ध. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर या आगे उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर तस्वीर.

3. Assays और गुण

  1. सेकंड HPLC विश्लेषण से 4 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर पवित्रता और स्थिरता पीबीएस में और सीरम के लिए परीक्षण प्रदर्शन. Molec रूप polystyrene सल्फ़ोनेट का प्रयोग करेंular भार मानकों. नैनो आकार के वितरण और जीटा क्षमता को मापने. वाणिज्यिक प्रणालियों का उपयोग करें.
  2. 320 μl नमूना के लिए 10% की 160 μl (w / v) hydroxylammonium क्लोराइड और 10% की 160 μl NaOH (w / v) जोड़ें. 10-15 मिनट के बाद, (w / v) फे (तृतीय) सीएल 3 से 12% में 5% की 160 μl के साथ मिक्स (v / v) एचसीएल और hydroxamate / फे की 540 पढ़ा (तृतीय). पीएमएलए 1 मिलीग्राम / एमएल पीएमएलए 2.5 ए 540 से मेल खाती संभालने की गणना.
  3. 110 डिग्री सेल्सियस पर 2 एम एचसीएल में रात भर नैनो दवा Hydrolyze और नमूने के संदर्भ के साथ उलट चरण क्रोमैटोग्राफी पर परख मेलिक एसिड सेब का तेज़ाब मानकों के साथ नुकीला. 100 मिमी dithiothreitol साथ नैनो दवा फोड़ना और morpholino AON मानकों के खिलाफ मात्रात्मक उलट चरण HPLC द्वारा morpholino-AON उपाय.
  4. दरार के बिना नैनो दवा ले लो और एक प्रोटीन परख किट का उपयोग एंटीबॉडी उपाय. अमोनियम ferrothiocyanate साथ अपनी प्रतिक्रिया अनुमति देकर एमपीईजी यों तो क्लोरोफॉर्म के साथ निकालने और 510 एनएम तरंगदैर्ध्य 10 पर absorbance पढ़ा
  5. अच्छी तरह से एंटीबॉडी गतिविधि और संधान के परीक्षण के प्रति नैनो दवा (1-10 ग्राम एमएबी) के 5 μl के साथ एलिसा प्रदर्शन करना. थाली में लिपटे एंटीजन और peroxidase युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में, क्रमश: 0.5 माइक्रोग्राम / अच्छी तरह transferrin रिसेप्टर और HER2 का प्रयोग करें.
  6. (उदाहरण तालिका 1 और 2 टेबल देखें) मेलिक एसिड (100%) के संबंध में AON, एमपीईजी और MAB के लिए हासिल% की गणना और डिजाइन द्वारा इरादा% के साथ तुलना करें.

4. इन विट्रो में परीक्षण

  1. (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -5 - - (3 carboxymethoxyphenyl) -2 - (4 sulfophenyl पीले अभिकर्मक [3 को कम करने के लिए उनकी गतिविधियों से समय के साथ जीवित कोशिकाओं सुसंस्कृत कैंसर की कोशिकाओं और उपाय के साथ नैनो दवा सेते )-2H-tetrazolium, भीतरी नमक] (एमटीएस) एक नीले रंग के लिए और एक प्रकाशमापी साथ रिश्तेदार absorbance पढ़ा. किट आपूर्तिकर्ता द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करें.
  2. इन विट्रो या पश्चिमी सोख्ता के लिए पूर्व vivo में सेल के अर्क तैयार करें. ठंडा निकासी B उपयोगएसडीएस और protease अवरोध कॉकटेल होता है कि uffer. एसडीएस polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन को कम करने से अलग प्रोटीन.
  3. नमूना निष्कर्षों में ब्याज की प्रोटीन के लिए पश्चिमी सोख्ता करो. Alkaline फॉस्फेट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का प्रयोग करें.
  4. प्रतिदीप्ति लेबलिंग का उपयोग सेल तेज और नैनो दवा बहुलक मंच, Aon और endosomes की सह स्थानीयकरण प्रदर्शित करने के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का प्रयोग करें. प्रतिदीप्ति लेबल के रूप में AONs नैनो संयुग्म मंच और Lissamine करने एलेक्सा Fluor 680 देते हैं. लेबल अणुओं का वितरण कल्पना करने के लिए एक माइक्रोस्कोप 5X वर्णक्रमीय स्कैनर और रहने वाले कैंसर कोशिकाओं का प्रयोग करें
  5. दाग endosome Styryl लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ झिल्ली और endosome colocalization या रिहाई प्रदर्शित करता है.

5. में vivo परीक्षण

  1. मानव HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के माउस मॉडल (सीआर (एमसीआर) Foxnnm नग्न माउस टीएसी) तैयार करें. गोली रिहा एक 0.72 मिलीग्राम 17β-estradiol डालें (90 दिनों में जारी) हैubcutaneously प्रत्येक माउस की गर्दन में.
  2. फिर subcutaneously सही दिशा में 1 10 x 7 बीटी-474 ट्यूमर कोशिकाओं इंजेक्षन और ट्यूमर बढ़ता है.
  3. ट्यूमर पूंछ नस में प्रत्येक एंटीबॉडी के 2.5 मिलीग्राम / किग्रा AON और / या 4.5 मिलीग्राम / किग्रा युक्त 150 μl नैनो संयुग्म इंजेक्शन द्वारा आकार में 120 मिमी 3 रहे हैं जब इलाज शुरू. उपचार के लिए, प्रति सप्ताह दो बार पूरी तरह से छह बार इंजेक्षन.
  4. दो बार कमजोर नली का व्यास के साथ ट्यूमर के आकार को मापने और सूत्र (लम्बाई x गहराई x चौड़ाई) एक्स (π / 6) का उपयोग मात्रा की गणना. 2 सप्ताह अंतिम इंजेक्शन के बाद और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद Ketamine और Dexmedetomidine का एक समाधान के साथ बेहोश करने के बाद जानवरों euthanize.
  5. शब्द के भागों मूल्यांकन के लिए एच ई के साथ ट्यूमर और दाग वर्गों को अलग.
  6. एक पशु पैमाने पर दवा वितरण का आकलन करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करें. 24 और 48 घंटे में एलेक्सा Fluor 680 लेबल नैनो दवा और छवि इंजेक्षन.
  7. पशु euthanize और Fluor का पता लगानेपृथक और perfused ट्यूमर और अंगों में escence.

Representative Results

HER2 रिसेप्टर अभिव्यक्ति मुंह बंद करने और HER2 संकेतन 12 को अवरुद्ध करके मानव HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर का निषेध

रणनीति

मानव स्तन कैंसर के विभिन्न रूपों के अलावा, HER2 पॉजिटिव ट्यूमर सबसे खराब नैदानिक ​​परिणाम है. हम नग्न माउस मॉडल में मानव HER2-overexpressing स्तन कैंसर के सफल इलाज मौजूद है. रणनीति रिसेप्टर की HER2 mRNA के आश्रित संश्लेषण (चित्रा 1) रोकने के लिए Herceptin और HER2 विशेष AON रोजगार HER2 संकेतन मार्ग की तत्काल मुंह बंद दोनों में सक्रिय नैनो दवा शामिल है. Herceptin और विरोधी HER2 AON होता है जो नेतृत्व नैनो संयुग्म, एक साथ Herceptin या AON या तो से रहित हैं, जो दो नियंत्रण के साथ 3 चित्र में दिखाया गया है. प्रमुख यौगिक अपरोक्ष transcytosis द्वारा सक्रिय परिस्त्राव प्राप्त करने के लिए विरोधी MsTfRmAb निहितऊ ट्यूमर जहाजों की टीएफआर endothelial के लिए बाध्य. ट्यूमर में बहुत कम तेज एंटीबॉडी के अभाव में नोट किया गया था और ट्यूमर निर्भर EPR प्रभाव 13 के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. एलेक्सा Fluor 680 युक्त नैनो conjugates के फ्लोरोसेंट संस्करणों इमेजिंग अध्ययन के लिए संश्लेषित किया गया.

चित्रा 1
. HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर की कोशिकाओं में AON वितरण और ट्यूमर के विकास निषेध की चित्रा 1 तंत्र ऊपरी बाएँ कोने:. नैनो संयुग्म चित्रा 3 से रूपांतरित किया. निचले बाएँ कोने: सतह पर टीएफआर व्यक्त माउस ट्यूमर वाहिकाओं. नैनो दवा रिसेप्टर को बांधता है और transcytosis से ट्यूमर में प्रवेश करती है. इसके अलावा, ट्यूमर के लिए उपयोग के कुछ डिग्री ट्यूमर में निर्भर बढ़ाया तेज और retenti भाग लेने कि अव्यवस्थित endothelial परतों के माध्यम से संभव है(EPR) 13. अगला, nanodrug मानव कैंसर कोशिकाओं पर व्यक्त HER2 को बांधता है और जल्दी endosomes में internalizes. बाइंडिंग भी ब्लॉक HER2 मार्ग संकेत. Endosomes की परिपक्वता और उनके अम्लीकरण के बाद, नैनो दवा की endosome भागने तंत्र सक्रिय है. Nanodrug कोशिका द्रव्य में प्रवेश डाइसल्फ़ाइड स्पेसर का reductive दरार से नैनो मंच से जारी है और HER2 संश्लेषण अवरुद्ध HER2 mRNA के लिए बांधता है. संश्लेषण के अवरुद्ध HER2 संकेतन के अवरुद्ध फैली और ट्यूमर के विकास निषेध लाती है.

Polymalic एसिड मंच की माइक्रोबियल उत्पादन

नैनो संयुग्म मंच, polymalic एसिड (पीएमएलए), सुसंस्कृत Physarum polycephalum की microplasmodia और प्रोटोकॉल में वर्णित और चित्रा 2 में दर्शाया के रूप में शोरबा से शुद्ध द्वारा तैयार की गई थी. उत्पादन और शोधन चिकनी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य थे. यह ऑन करने के लिए महत्वपूर्ण था rol समय, पीएच और बहुलक का सहज दरार से बचने के लिए तापमान. सावधान धोने और DEAE स्तंभ की क्षालन डीएनए, कार्बोहाइड्रेट, जहर और रंगीन सामग्री हटाने के लिए आदेश में सिफारिश की है. चरम पवित्रता निर्जल एसीटोन में भंग और अघुलनशील सामग्री हटाने के बाद प्राप्त हुई थी. उत्पादित पीएमएलए की कुल राशि प्रति अभियान 5 ± 1 ग्राम था. 1.5 ± 0.5 ग्राम की मात्रा अत्यधिक 10 एल बायोरिएक्टर का उपयोग करते समय 80,000-100,000 reproducibly प्राप्त किया गया डब्ल्यू एम के PMPLA शुद्ध किया. सेक्टर HPLC क्षालन प्रोफाइल के सममित थे. संख्या वितरण के अनुसार गतिशील प्रकाश बिखरने विश्लेषण 8 ± 1 एनएम के एक hydrodynamic व्यास को इसी एक भी शिखर और PDI की एक polydispersity सूचकांक = 0.10 ± 0.02, ग्रहण गोलाकार कण के लिए साधन सॉफ्टवेयर द्वारा गणना संकेत दिया. जीटा संभावित था -22 ± 2 एम वी (पीएच 7.5).

/ 50668/50668fig2highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 2. उत्पादन और (ली एट अल. 9 से अनुकूलित) Physarum polycephalum की सुसंस्कृत सूक्ष्म plasmodia से polymalic एसिड की शुद्धि. Polymalic एसिड (पीएमएलए) एक बायोरिएक्टर में Physarum polycephalum की plasmodia से उत्पादन और आयनों एक्सचेंजर (DEAE) पर बंधन से संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से इकट्ठा किया जाता है. eluent कैल्शियम नमक के रूप में इथेनॉल उपजी है. कैल्शियम नमक का समाधान Sephadex-G25 मेगावॉट से अधिक-fractionated हैं. पीएमएलए युक्त भिन्न Amberlite आईआर 120H + पर एसिड में सीए नमक से परिवर्तित कर रहे हैं. मुफ्त पीएमएलए अंत में सूखी सफेद पाउडर उपज के लिए lyophilized है.

नेतृत्व नैनो संयुग्म के रासायनिक संश्लेषण

पी / एमपीईजी 5000 (5%) / Loet (40%) / AON (2.5%) / Herceptin (0.2%) / एक NTI-MsTfRmAb (0.2%)

नेतृत्व नैनो दवा की और दो ​​अग्रदूत नैनो conjugates के योजनाबद्ध संरचनाओं अंजीर ure 3 में दिखाया गया. व्यापारियों AON HER2 या प्रतिरक्षी Herceptin या तो कमी करने के लिए डिजाइन किए गए थे, जबकि सीसा, सभी घटक शामिल हैं. AON और mAbs इसके अलावा, यौगिकों प्लाज्मा प्रोटीन के लिए बाध्य कम करने के लिए, पॉलीथीन ग्लाइकोल, एमपीईजी 5000 निहित, एंजाइमी दरार से (समास में) जाली का, endothelial प्रणाली (आरईएस), और गिरावट के माध्यम से निकासी. antisense अनुक्रम 5'-cat-GGT-GCT-सीएसी-टी जी सी-GGC-टीसीसी-GGC -3 'HER2 mRNA करने के लिए पूरक था और ध्यान से HER2 अवरुद्ध करने की दिशा में उच्च विशिष्टता प्राप्त करने के लिए कई HER2 व्यक्त सेल लाइनों पर इन विट्रो में परीक्षण किया गया है संश्लेषण और बंद लक्ष्य प्रभाव नहीं दिखा.

8/50668fig3highres.jpg "चौड़ाई =" 500 "/>
चित्रा 3. नैनो मानव HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के इलाज के लिए conjugates. प्रमुख नैनो दवा (शीर्ष संरचना) दो दवाओं (Herceptin, Aon HER2) शामिल हैं. संस्करण 2 और 3 दवाओं का केवल एक ही होते हैं. मानव HER2-overexpressing ट्यूमर कोशिकाओं में 1 और 2 के तेज Herceptin के बंधन से प्रबंधित किया जाता है. Herceptin शामिल नहीं है जो नैनो संयुग्म 3,, मानव कोशिकाओं द्वारा endosome तेज के लिए विरोधी HuTfRmAb प्राप्त किया. एलेक्सा Fluor 680 के साथ संयुग्मन इमेजिंग प्रयोजनों के लिए वैकल्पिक था. लाल पट्टी नैनो संयुग्म मंच पीएमएलए / Loet (40%) का प्रतिनिधित्व करता है. % इंगित ligand (nanodrug = 100% में मेलिक एसिड अवशेषों की कुल राशि) के बंधन में खपत मेलिक एसिड के अवशेष के अंश को इंगित करता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. नैनो की रासायनिक संश्लेषणconjugates पी / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin ऊपर से नीचे तक. लटकन carboxylates (रासायनिक सक्रियण) के पीएमएलए-N-हाइड्रोक्सी succinimidyl एस्टर (पीएमएलए-एनएचएस) के संश्लेषण. 2-mercapto-1-aminoethan (2 विदेश मंत्रालय) के साथ एमाइड गठन के द्वारा एनएचएस की रिप्लेसमेंट, मिथाइल खूंटी 5000-amine (एमपीईजी 5000 राष्ट्रीय राजमार्ग 2), trileucine (एल एल एल) या leucine ethylester (Loet). यह "preconjugate" cleavable डाइसल्फ़ाइड बांड के गठन से thioether गठन और AON द्वारा एमएबी-मल खूंटी मल देता है. बचे हुए 2-विदेश मंत्रालय amidoethyl-dithio-propionic एसिड के गठन छाया हुआ है. एक एकल एमएबी की ही लगाव दिखाया गया है. एकाधिक अनुलग्नकों mAbs के मिश्रण का उपयोग करके कामयाब रहे. प्रतिशत% विभिन्न ligands (मुक्त पीएमएलए के लिए 100%) करने के लिए बाध्य carboxylates के भागों को दर्शाता है.

अंजीर ure 4 में उल्लिखित के रूप में नैनो conjugates संश्लेषित किया गया. नेतृत्व की गणना की आणविक भारसंयुग्म 719,000 था. संश्लेषण की कुल उपज मेलिक एसिड सामग्री के संबंध में 45 ± 5% थी. 100 केडीए पीएमएलए मंच की 862 malyl इकाइयों (= 100%) की औसत पर, 40% Loet, 5% एमपीईजी, 2% AON 2%, 0.2% Herceptin और 0.2% विरोधी MsTfR एमएबी किया. प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए राशि पीएमएलए मंच के अणु प्रति 1.7 अणुओं के एक औसत करने के लिए corresponded. % बनाया गया है और समूह विश्लेषण द्वारा सत्यापित% ± 5% के भीतर ही थे. एक उदाहरण के डिजाइन से सामग्री के साथ तुलना से पता चलता है सेब का तेज़ाब, Aon, एमएबी और एमपीईजी 5000 और 2 तालिका में की प्रयोगात्मक सामग्री की गणना के लिए 1 टेबल में दी गई मामला है. धारा 3 के तहत मानदंडों के अनुसार उच्च शुद्धता उच्च प्रतिक्रिया पैदावार और आकार अपवर्जन द्वारा कुशल जुदाई (जैसे एमएबी मुक्त और MAB-nanoconjugate सेकंड HPLC पर 1 मिनट से अलग होती है), और विलायकों में चयनात्मक घुलनशीलता के आधार पर हासिल की थी. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की गतिविधि थी नैनो दवा संश्लेषण भर में बनाए रखा जाना दिखाया गया है, और यह एंटीबॉडी के दो प्रकार एक ही बहुलक मंच पर इकट्ठे हुए थे कि पुष्टि की गई. असामान्य एलिसा प्रयोग के परिणाम अंजीर ure 5 में दिखाया गया है. सामान्य में, मैलिक एसिड, Aon, प्रोटीन, खूंटी के लिए मात्रात्मक समूह के विश्लेषण के लिए और एलिसा के लिए assays की सूचना संश्लेषण के मामले में न केवल विभिन्न कर्मियों और इंस्ट्रूमेंटेशन द्वारा किए गए जब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उपज, मजबूत थे, लेकिन यह भी विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जब अन्य संश्लेषित Nanoconjugates की.

तालिका 1
मैलिक एसिड सामग्री के संदर्भ में nanodrug रचना की तालिका 1. गणना.

668table2.jpg "चौड़ाई =" 600 "/>
बनाया गया संरचना के साथ प्रयोगात्मक नैनो दवा रचना की तालिका 2. तुलना करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. एलिसा रासायनिक संश्लेषण के बाद, और विभिन्न एंटीबॉडी के बंधन, कई के प्रदर्शन के लिए एंटीबॉडी आत्मीयता की माप के लिए. नैनो दवा एंटीबॉडी एमएबी क्रमशः एंटीजन ए और बी, के खिलाफ (ए) और प्रतिरक्षी एमएबी (बी) शामिल हैं. एलिसा प्लेटें प्रतिजन (ए) के साथ लेपित हैं. मुफ्त एमएबी (ए), नि एमएबी (बी), और नैनो दवा एलिसा प्लेटों को लागू कर रहे हैं. केवल एमएबी (ए) प्रतिजन (ए) के लिए बाध्य है, जबकि धोने के बाद, एंटीबॉडी, एमएबी (ए) या एमएबी (बी) के लिए या तो विशिष्ट माध्यमिक peroxidase युग्मित एंटीबॉडी के साथ जांच की जाती है. यह मुफ़्त और नैनो दवा एमएबी (ए) के साथ संयुग्मित, और परोक्ष रूप से एक ही नैनो दवा अणु की एमएबी (बी) संयुग्मित, लेकिन मुक्त एमएबी (बी) नहीं देखा गया है कि, थाली पर रखा जाता है. एकाग्रता निर्भरता रासायनिक विकार एंटीबॉडी गतिविधि को प्रभावित नहीं किया यह दर्शाता है कि नि: शुल्क और संयुग्मित एमएबी (ए) के लिए तुलनीय बंधन समानताएं दिखाता है. इसके अलावा, एक ही भौतिक इकाई (नैनो मंच) एंटीबॉडी एमएबी (बी) का पता लगाने में परिणामों पर एमएबी (ए) के साथ एमएबी (बी) के सह बंधाव. यहाँ दिखाए गए प्रयोगात्मक परिणामों विरोधी मानव TfRmAb (ए) और विरोधी माउस TfRmAb (बी) को देखें. इसी तरह के परिणाम इस तरह के विरोधी MsTfR एमएबी और विरोधी HER2 एमएबी (Herceptin) के रूप में परीक्षण अन्य प्रतिरक्षी जोड़े, के लिए दिखाया गया है.

भौतिक जांच hydrodynamic व्यास संकेत 22.1 ± पी / एमपीईजी (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0.2%) / विरोधी MsTfRmAb (0.2%) (सीसा, दो के लिए 2.3 एनएम दवा संस्करण), 20.1 ± पी / एमपीईजी (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / विरोधी MsTfRmAb (0.2%) / विरोधी HuTfRmAb (0.2%) (AON दवा संस्करण) के लिए 2.4 एनएम , और 15.1 ± पी / एमपीईजी (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0.2%) (Herceptin दवा संस्करण) के लिए 1.2 एनएम. पीएच 7 में जीटा क्षमता.5 इस क्रम -5.2 ± 0.4 एम वी, -5.7 ± 0.6 एम वी, और -4.1 ± 0.4 एम वी में थे. यह नैनो conjugates के मापा hydrodynamic व्यास मुक्त घटकों के लिए मापा व्यास की additivity का पालन नहीं किया है कि उल्लेख किया जाना चाहिए.

ट्यूमर कोशिका झिल्ली के माध्यम से नैनो दवा का वितरण और 0 घंटा और 3 आर के बाद cytoplasm में रिलीज

endosome तेज द्वारा कोशिका झिल्ली के माध्यम से नैनो दवा का वितरण अंजीर ure 6 में दिखाया गया है 0 घंटे और 3 घंटे के बाद. प्रतिदीप्ति लेबल (हरा एलेक्सा Fluor 680,) नैनो दवा मंच करने के लिए और (लाल Lissamine,) AON से जुड़े होते हैं. उनके superposition डी एंड एल और एक साथ पैनल जी एंड ओ में लेबल endosomes (नीला) के प्रतिदीप्ति साथ पैनल में दिखाया गया है पियर्सन की सहसंबंध गुणांक (आर (R) मंच / endosomes की सह स्थानीयकरण, Aon / endosomes, 0 घंटे और 3 घंटे के लिए मंच / AON. टी के बारे में छवियों से गणना की गई हैउन्होंने 3 घंटा छवि कोशिका द्रव्य में glutathione निर्भर डाइसल्फ़ाइड दरार से नैनो दवा से AON के cytoplasm और हदबंदी में endosomes से रिहाई का संकेत दिया.

चित्रा 6
चित्रा 6. (डिंग एट अल. 11 से अनुकूलित) लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा नैनो संयुग्म तेज के लिए confocal माइक्रोस्कोपी. कोशिकाओं डबल बहुलक मंच पर और Lissamine AON से जुड़ी (लाल) के साथ एलेक्सा Fluor 680 (हरा) के साथ चिह्नित किया गया था, जो नैनो दवा के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए incubated रहे थे. इसके अलावा, endosomes FM1-43 (नीला) के साथ दाग रहे थे. स्थानीयकरण 0 घंटा (ए) और 3 घंटा (बी) ऊष्मायन के बाद दिखाया गया है. पैनलों ए, एबी, और बी, अकेले नैनो संयुग्म fluorophores द्वारा आईजे शो धुंधला हो जाना, औरए, सीडी और बी, के.एल. में उनके सह स्थानीयकरण. इसके अतिरिक्त, endosomes की धुंधला पैनल ए, ई और बी, मी और नैनो संयुग्म और endosomesin पैनल ए, के colocalization में दिखाया गया है FG और बी, नहीं. संबंधित पैनल के लिए पैनलों ए, एच एंड बी, पी शो चरण विपरीत. (सी) पियर्सन की सहसंबंध मंच endosomes, AON-endosomes, 0 घंटे और 3 घंटे के लिए गणना की मंच AON की colocalization के लिए आर (R) coefficients. क्लिक करें यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

इन विट्रो में और vivo में मानव स्तन कैंसर का निषेध

कॉम में HER2 overexpressing सेल लाइन बीटी-474 के इन विट्रो विकास निषेध मेंकम व्यक्त सेल लाइन एमडीए MB-231 के साथ parison अंजीर ure 7 में दिखाया गया है. निषेध की डिग्री नेतृत्व नैनो संयुग्म पी / एमपीईजी / Loet / AON HER2 / Herceptin / विरोधी MsTfRmAb द्वारा क्रमश: 50% और 30%,, है. अन्य यौगिकों से निषेध एमडीए MB-231 कोशिकाओं के लिए की तुलना में बीटी-474 के लिए कम लेकिन अधिक है. बीटी 474 सेल लाइन xenogeneic स्तन कैंसर माउस के उपचार के लिए चुना गया था.

चित्रा 7
चित्रा 7. HER2 बीटी 474 स्तन कैंसर की कोशिकाओं overexpressing और कम HER2 बीटी 474 स्तन कैंसर कोशिका लाइन overexpressing के लिए विकास निषेध की. तुलना (Inoue एट अल. 12 से अनुकूलित) एमडीए MB-231 कोशिकाओं (व्यक्त की इन विट्रो विकास निषेध बाएं) और HER2 के कम व्यक्त स्तन कैंसर कोशिका लाइन एमडीए MB-231 (दाएं). टीएफआर (ओं) विरोधी MsTfRm अर्थएबी और टीएफआर (हू / एमएस) विरोधी HuTfRmAb और विरोधी MsTfRmAb अर्थ. नेतृत्व नैनो दवा, पी / एमपीईजी / Loet / AON HER2 / Herceptin / टीएफआर (सुश्री), और Herceptin या AON HER2 या तो विहीन नैनो दवाओं पीबीएस, Herceptin और AON HER2 के साथ तुलना की जाती है. Herceptin के अभाव में, विरोधी MsTfRmAb ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा endosome तेज प्रदान करने के लिए संयुग्मित किया गया था. सांद्रता एंटीबॉडी, Aon HER2, 4 माइक्रोन endoporter (AON के आवेदन) के संबंध में 4 माइक्रोन के संबंध में 40 माइक्रोग्राम / एमएल थे. महत्व * से चिह्नित, पी <0.05: **, पी <0.02: ***, पी <0.003 पीबीएस के साथ तुलना में.

8 चित्रा में vivo में उपचार के परिणाम मानव स्तन कैंसर overexpressing बीटी 474 HER2 असर चूहों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. ग्रोथ केवल पीबीएस (चित्र ure 8) के साथ इलाज नियंत्रण की तुलना में Herceptin और HER2 विशेष AON युक्त नेतृत्व nanodrug द्वारा> 95% से हिचकते हैं. निषेधअकेले Herceptin, पी / एमपीईजी / Loet / Herceptin या पी / एमपीईजी / Loet / AON / विरोधी MsTfRmAb / विरोधी HuTfRmAb साथ 60% या उससे कम था. ट्यूमर के अर्क के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण HER2 संश्लेषण और AKT phosphorylation दोनों के निषेध से पता चला है, लेकिन कुल AKT का परिवर्तन और गृह व्यवस्था एंजाइम कोई GAPDH. PARP apoptosis का एक बढ़ा स्तर के साथ पत्राचार में cleaved किया गया था. उपचार, और ट्यूमर प्रतिगमन illustrating एच एंड ई के साथ दाग ऊतक वर्गों के बाद ट्यूमर की तस्वीर अंजीर ure 9 में दिखाया गया.

8 चित्रा
(Inoue एट अल. 12 से अनुकूलित) नेतृत्व और अग्रदूत नैनो दवाओं के साथ इलाज के दौरान 8 चित्रा. ट्यूमर के आकार और प्रोटीन. विभिन्न उपचार (दिन 42, पूरी तरह से 8 इंजेक्शन के लिए 21 दिन) के लिए एक. ट्यूमर के आकार. सलाखों के मानक से संकेत मिलता हैमाध्य से विचलन. विरोधी HER2 AON और Herceptin साथ संयुग्मित नेतृत्व अकेले Herceptin या एक दवा युक्त नैनो conjugates. बी या तो बेहतर था. HER2, phosphorylated AKT, कुल AKT, PARB की अभिव्यक्ति पर विभिन्न उपचार के प्रभाव, cleaved PARB और GAPDH पश्चिमी सोख्ता द्वारा दिखाए जाते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

9 चित्रा
नग्न चूहों पर HER2 पॉजिटिव बीटी 474 मानव स्तन कैंसर का आंकड़ा 9. उपचार (Ionue एट अल. 12 से अनुकूलित) ऊतक वर्गों में. ट्यूमर प्रतिगमन और परिगलन / apoptosis. ऊपरी: ट्यूमर (लाल तीर) का संकोचन. ट्यूमर के विकास (नीले तीर) का समर्थन करने के लिए एस्ट्रोजन गोली का संकेत है. लोवआर: ट्यूमर वर्गों के Hematoxilin और Eosine (एच एंड ई) धुंधला हो जाना. Proliferating ट्यूमर ट्यूमर कोशिकाओं के घने पैकिंग द्वारा दिखाया गया है. परिगलित ऊतक ट्यूमर कोशिकाओं का सफाया कर दिया गया है, जहां देखा जाता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

एक biodegradable प्राकृतिक बहुलक से नैनो दवाओं की तैयारी के लिए प्रयोगात्मक मार्ग व्यक्तिगत दवा के संश्लेषण में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रस्तुत किया है. विवरण नैनो दवा संश्लेषण के लिए एक बहुमुखी मंच है जो polymalic एसिड, नियंत्रित उत्पादन और शोधन के साथ शुरू होता है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीकों का प्रयोग, बहुलक उच्च आणविक वजन के साथ और दवा संश्लेषण के लिए उपयुक्त चरम पवित्रता में प्राप्त की है. संश्लेषण कुशलता HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के इलाज के लिए दिखाया गया है कि एक नैनो दवा के लिए वर्णित है. विवरण कैंसर के उपचार के लिए सबसे अन्य नैनो दवाओं के syntheses में अनुवाद किया जा सकता है. लक्ष्य निर्धारण इस तरह HER2 प्रोटीन या कुशलता से भली भाँति है कि किसी भी अन्य ट्यूमर मार्कर के रूप में एक ट्यूमर विशिष्ट प्रतिजन कि बाँध जैसे Herceptin के रूप में एंटीबॉडी शामिल है. नैनो दवा कुशलतापूर्वक Tre के तहत कैंसर के विकास को बाधित करेगा कि antisense oligonucleotides और रसायन - चिकित्सा की एक चयन उद्धारatment. उदाहरण में, Herceptin HER2 और साथ विशिष्ट antisense oligonucleotide annealing के लिए बाध्य HER2 कोडिंग mRNA HER2 संकेतन और HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर की गंभीर कमी की निरंतर अवरुद्ध में हुई. ट्यूमर लक्ष्यीकरण और antisense oligonucleotides द्वारा जीन अभिव्यक्ति के निषेध के मूल सिद्धांत के आधार पर हम करने की तारीख कई अन्य नैनो दवाओं और सफलतापूर्वक हिचकते preclinical मानव glioblastoma और ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर 11,14-18 संश्लेषित है.

सिंथेटिक काम Physarum polycephalum ("कीचड़ ढालना" परिवार की एक प्रजाति) की संस्कृति सतह पर तैरनेवाला से polymalic एसिड है जो अत्यधिक शुद्ध नैनो दवा मंच की तैयारी के साथ शुरू होता है. तैयारी कई एंटीबॉडी, पेप्टाइड्स, oligonucleotides और सक्रिय दवा वितरण और ट्यूमर के विकास निषेध में कार्यरत अन्य अणुओं की कुर्की की अनुमति सिद्धांत रूप में, बहुलक का उच्च आणविक भार पर जोर देती है. Followiनियंत्रित संवर्धन और शुद्धि एनजी, उम्मीद के मुताबिक पैदावार में बहुलक की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणवत्ता का उत्पादन किया गया है. बहुलक किसी भी समय के लिए सुविधाजनक परिस्थितियों में संग्रहीत किया जाता है.

बहुलक लटकन carboxylates का रासायनिक सक्रियण के साथ शुरुआत पीएमएलए नैनो conjugates के संश्लेषण कुछ सिंथेटिक चरणों में किया जाता है. कदम के बीच में, संश्लेषण वैकल्पिक रूप से मध्यवर्ती की मनमानी मात्रा की तैयारी की अनुमति होल्ड पर रखा जा सकता है और इस तरह स्केलिंग अप में इस्तेमाल किया जा सकता है. संश्लेषण की प्रगति टीएलसी और सेकंड HPLC द्वारा पीछा किया जाता है, और नैनो दवा की संरचना और गतिविधि दोनों समूह विशेष मात्रात्मक रासायनिक assays, एलिसा, और शारीरिक माप की एक किस्म के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. हमारा अनुभव इन syntheses उत्कृष्ट पैदावार और पवित्रता के साथ आसानी से और reproducibly प्रगति किया गया है. पीई में जरूरत के रूप में एंटीबॉडी और antisense oligonucleotides की विशिष्टता का चयन करके नैनो दवा के किसी भी संस्करण कृपापूर्वक संश्लेषित हैदवा rsonalized.

मानव HER2 पॉजिटिव स्तन कैंसर के सफल इलाज के तौर तरीकों माउस कैंसर मॉडलों की तैयारी, नैनो दवाओं, इमेजिंग, और ट्यूमर के विकास के विश्लेषण के लिए आवेदन की वैध प्रतिनिधि हैं. इन विट्रो व्यवहार्यता परीक्षण के परिणाम सेल लाइन और पशु प्रयोग में इस्तेमाल किए जाने की अग्रणी दवा का चयन करने में उपयोगी होते हैं. में vivo Xenogen इमेजिंग नैनो दवा वास्तव में ट्यूमर में कर दिया है कि पुष्टि की. पश्चिमी सोख्ता के परिणाम कुछ प्रोटीन का स्तर कैंसर के इलाज के दौरान भविष्यवाणी फैशन में जवाब दिया कि क्या पता चलता है. ट्यूमर के आकार का मापन यानी निषेध, मंदी या प्रतिगमन के बारे में उपचार की सफलता के बारे में बताते हैं. वर्णित उदाहरण predictability, reproducibility और उल्लेखनीय विषाक्तता के अभाव के एक उच्च स्तर का संकेत अन्य polymalic एसिड आधारित नैनो दवाओं के साथ हमारे अनुभव को दर्शाता है. विषाक्तता और कई टी की प्रभावकारिता पर हाल के परिणामट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर के इलाज के लिए argeted polymalic एसिड conjugates इस धारणा 18 के मजबूत समर्थन में हैं. ट्यूमर बीचवाला में परिस्त्राव द्वारा endothelial बाधा, endosome तेज से ट्यूमर कोशिका झिल्ली, और leucine ethylester या trileucine समूहों की कार्रवाई से endosome झिल्ली विघटन: एक प्रमुख विशेषता हमारी नैनो दवा जैव बाधाओं घुसना करने में सक्षम है. परिस्त्राव और endosome तेज मज़बूती से नैनो दवा से जुड़ी विशिष्ट एंटीबॉडी से पूरा कर रहे हैं. विरोधी माउस transferrin रिसेप्टर एंटीबॉडी रिसेप्टर सबसे ट्यूमर वाहिका पर overexpressed है, शायद इसलिए क्योंकि transcytosis से ट्यूमर में कुशल तांता मध्यस्थता करता है. एक अलग एंटीबॉडी विशेष रूप से प्राप्तकर्ता ट्यूमर सेल में नैनो दवा के निर्देशन में एक ही नैनो संयुग्म अणु कार्यों पर संलग्न. दोनों एंटीबॉडी की उपस्थिति, transcytosis के लिए एक और endosome तेज के लिए एक दूसरे के इष्टतम कार्य के लिए आवश्यक है. एम के मात्रात्मक विश्लेषणalic एसिड और एंटीबॉडी अत्यधिक नैनो दवा के इष्टतम संरचना को नियंत्रित करने के क्रम में सिफारिश की है. अंत में यह सब में एक सहसंयोजक नैनो दवा प्राप्तकर्ता ट्यूमर कोशिका में मेजबान वाहिका संरचना के माध्यम से रास्ते में रासायनिक संलग्न प्रपत्र में दवा बचाता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. वे लक्षित साइट पर नैनो संयुग्म मंच से दरार से मुक्त दवाओं के रूप में पुनर्गठित कर रहे हैं जब तक रासायनिक लगाव (prodrugs) सबसे दवाओं निष्क्रिय बना देता है. पुनर्सक्रियन साधन वितरण और हानिकारक साइड इफेक्ट पैदा करने के लिए एक न्यूनतम मौका दौरान सुरक्षा के एक उच्च डिग्री प्रदान करता है क्योंकि यह महत्वपूर्ण है. बहुमुखी प्रतिभा, क्षमता और सुरक्षा अच्छा व्यक्तिगत दवा के अपरिहार्य गुण हैं.

Disclosures

लेखकों जूलिया वाई Ljubimova, कीथ एल काले, और Eggehard चिल्लाई Arrogene प्रौद्योगिकी इंक के शेयरधारकों हैं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) Sigma-Aldrich 30078-25G
4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories, Burlingame, CA
90-Day release 17β-estradiol pellet  Innovative Research of America
Alexa Fluor 680 C2 maleimide Invitrogen A20344
Amberlite IR 120H Sigma-Aldrich 6428
Antifoam Y-30 Emulsion Sigam-Aldrich A5758
Anti-laminin-411 chain mAbs Santa Cruz SC-59980
Anti-pAkt mAb Cell Signalling 9271S
Anti-PARB mAb BD Biosciences 556494
Anti-von Willebrand Factor antibody  Abcam AB6994
Bacto Yeast Extract Bacto, Dickinson/Sparks, MD 212720
Beta-actin Cell Signalling 3700
BT-474  ATCC HTB-20
Calcium Carbonate Alfa Aesar 36337
Cell Proliferation Assay kit Promega, Madison, WI, USA PR-G3580
Centriplus 100  Millipore 4414
Dicyclohexylcarbodimide Fluka 36650
DMEM Sigma-Aldrich D5796
Eosin Cardinal Health S7439-4
Galardin (MMP-inhibitors)  Santa Cruz SC-994
GAPDH Cell Signalling  2118
Hematoxilin Cardinal Health S7439-3
Hemin from porcine Sigma-Aldrich 51280
Herceptin Genentech 15534
Herceptin (Western blotting) Cell Signalling 2165S
IgG2a-kappa murine malignoma Sigma M77695X5m
Immun-Star AP Substrate Pack Biorad 170-5012
Immun-StarTM AP Substrate Pack  Biorad 170-5012
LAL Reagent water  Lonza, MD W50-1000
Laminin-411 mAbs Abcam
Leucine ethyl ester (LOEt) Sigma-Aldrich 61850-10G-F
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests Cambrex BioScience N384
Lissamin-Morpholino AON Gene Tools Custom made
L-malic acid  Sigma-Aldrich M6413
Malate dehydrogenase  Sigma-Aldrich M2634
Mal-PEG-Mal Laysan mal-PEG-mal-3400
Matrigel BD Biosciences 354248
Milk, nonfat powdered  Proteomics M203-10G
Morpholino oligonucleotides  GeneTools custom made
mPEG5000 Lysan mPEG-NH2-5000
N-hydroxysuccinimde (NHS)  ACROS Organics 15727100
Ninhydrin Merck 1.06762.0100
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm  Invitrogen LC2001
Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) Invitrogen LC3675
Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm Taconic
PBS pH 7.2 10x Gibco 10010-49
PBS pH 7.2 1x Gibco 70013
PD-10 desalting columns GE Healthcare 17-0851
Physarum polycephalum M3CVII ATCC 204388
Pierce BCA protein assay  Thermo Scientific 23225
Protease inhibitor cocktail Roche 1.18362E+11
Protein Detector ELISA Kit KPL 54-62-18
Sephadex G-25 superfine GE Healthcare 17-0031
Sephadex G-75  GE Healthcare 17-0050
Sephadex-LH20  GE Healthcare 17-0090
SKBR-3  ATCC HTB-30
SPDP Proteochem  C1116
Streamline-DEAE GE Healthcare 17-0994
Styryl Red FM 1-43  Life Technologies  T-3163
TBS 10x Bio-Rad 170-6435
TCEP Sigma-Aldrich C4706-2G
TLC, silica coated aluminia sheets Merck, Darmstadt, DE 60F254
Trileucine (LLL) Bachem H-3915
Triton X-114  Sigma-Aldrich X114
Tween®20  Sigma-Aldrich P1379
Vivaspin 20  VWR 14005-302
DAPI Vector Laboratories, Burlingame, CA
Dexmedetomidine Pfizer
Atipamezole Pfizer
Carprofen Pfizer
Betadine Foster and Smith, Wisconsin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
  2. Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
  3. Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
  4. Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
  5. Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
  6. Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. (2013).
  7. Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
  8. Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
  9. Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
  10. Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
  11. Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
  12. Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
  13. Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
  14. Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
  15. Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
  16. Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
  17. Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
  18. Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats