Farmakologisk Induksjon av epidermal Melanin og beskyttelse mot solbrenthet i en humanisert Mouse Model

Published 9/07/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Epidermal melanin er indusert av lokal applikasjon av forskolin i en murine modell av lyshudet UV-sensitive menneske. Farmakologisk manipulering av cAMP-nivåer i huden og epidermal mørkere sterkt beskytter mot UV-mediert betennelse (solbrenthet) målt ved den minste erytematøs dose (MED) assay.

Cite this Article

Copy Citation

Amaro-Ortiz, A., Vanover, J. C., Scott, T. L., D'Orazio, J. A. Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (79), e50670, doi:10.3791/50670 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rettferdighets av hud, UV-følsomheten og risiko hudkreft all korrelerer med den fysiologiske funksjon av melanocortin en reseptor, en G s-koblet signale protein som finnes på overflaten av melanocytter. MC1R stimulerer adenylyl cyclase og cAMP-produksjon, som i sin tur opp-regulerer melanocytt produksjonen av melanin i hud. For å studere mekanismer som MC1R signale beskytter huden mot UV-skader, er avhengig denne studien på en musemodell med "humanisert hud" basert på epidermal uttrykk for stamcellefaktor (SCF). K14-SCF transgene mus beholde melanocyttene i Epidermis og derfor har evne til å avsette melanin i epidermis. I denne dyremodell, villtype MC1R gir stor robust avsetning av svarte eumelanin pigment og en UV-beskyttet fenotype. I kontrast, K14-SCF dyr med defekt MC1R signale evne utviser en rød / blonde pigmentering, svært lite eumelanin i huden ogen UV-sensitive fenotype. Resonnement som eumelanin deponering kan bli forsterket av aktuelle agenter som etterligner MC1R signalering, fant vi at direkte bruk av forskolin ekstrakt på huden til MC1R-defekt lyshudet mus resulterte i robust eumelanin induksjon og UV-beskyttelse 1. Her beskriver vi metoden for å utarbeide og bruke en forskolin holdig naturlig rot ekstrakt til K14-SCF lyshudet mus og rapportere en metode for å måle UV-følsomhet ved å bestemme minimal erytematøst dose (MED). Ved hjelp av denne dyremodell, er det mulig å studere hvordan epidermal cAMP induksjon og melanization av huden påvirke fysiologiske respons på UV-eksponering.

Introduction

Forekomsten av føflekkreft, den mest dødelige formen for hudkreft, har økt dramatisk de siste tiårene i USA, særlig blant lyshudet personer. Sterk molekylære og epidemiologiske bevis impliserer UV-stråling som en viktig utløsende miljøfaktor 2-5. Økt UV-stråling i form av soleksponering og Solseng bruk er sannsynlig å være ansvarlig for mye av økningen i melanom forekomst 6-7. Melanom risikoen synes særlig knyttet til solforbrenning 8, særlig de tidlig i livet 9-10. Risiko for solbrenthet er knyttet ikke bare til dose og intensiteten av UV-stråling, men også av nedarvede faktorer som påvirker kutan reaksjon på UV-stråling. Pigment i huden er en av de viktigste determinantene for UV-følsomheten, risiko for solbrenthet og kreftrisiko. Melanom forekommer omtrent tjue ganger oftere i lys-skinned personer sammenlignet med mørkhudet individuals 11-13.

Melanin, et pigment produsert av melanocytter i epidermis, er den viktigste determinant av hudfarge. Melanin kommer i to hoved varianter: (1) eumelanin, en mørkebrun / sort pigment effektiv til å absorbere energien av UV-stråling, og (2) Pheomelanin, et rødaktig / blonde pigment mindre effektivt for å forhindre inntrengning av UV fotoner inn i huden. Hudfarge, UV-følsomhet og føflekkreft risiko er i stor grad bestemt av epidermal eumelanin innhold 14-15. Jo mer eumelanin i epidermis, kan de mindre UV fotoner trenge inn i huden. På grunn av lave medfødte nivåer av eumelanin, lyshudet individer er mye mer utsatt for akutte og kroniske effekter av UV-stråling 16-18.

Pigment i huden, melanom risiko og evnen til "tan" etter UV-eksponering all korrelerer med signale evne melanocortin-reseptor 1 (MC1R), en G s-koblet syv transmembrane surface reseptor på melanocyttene 19-22. Når MC1R binder kognatreseptoren høyaffinitets ligand, α-melanocyte stimulerende hormon (α-MSH), er aktivering av adenylat cyclase og fremstilling av den andre budbringer cAMP 23.. Den normale fysiologiske responsen til huden etter UV eksponering inneholder epidermal produksjon av α-MSH ved keratinocytter 24-29. Vi og andre hypotese at keratinocyte-avledet α-MSH binder seg til MC1R på epidermal melanocytter, initiere nedstrøms produksjon av cAMP andre messenger gjennom aktivering av adenylyl cyclase 30. cAMP nivåer styre mange aspekter av melanocyte differensiering, inkludert overlevelses trasé, DNA-reparasjon og pigmentsyntesen. MC1R signalering og cAMP klart indusere pigmentenzymnivåer og eumelanin produksjon. Når MC1R signale er intakt og melanocyttisk cAMP-nivåer er robust, er eumelanin produsert og huden mørkere. Imidlertid, hvis MC1R signale er defekt, ogcytoplasmatiske cAMP nivået fortsatt lavt, er pheomelanin produsert istedenfor en. Eumelanin syntese kan stimuleres farmakologisk av agenter som øker cAMP nivåer 1,14,31-35.

Siden MC1R protein er en viktig regulator av melanom risiko hos mennesker 36-46, vi er interessert i mekanismer som MC1R beskytter melanocytter mot UV-indusert karsinogenese. Som et fundament for våre studier, genererte vi en transgen MC1R-variant murine modell på en ren C57BL / 6 genetisk bakgrunn en. I denne modellen, stamcellefaktor (SCF) blir konstitutivt uttrykt i de basale epidermis og epidermale interfollicular melanocytter beholdes i huden gjennom hele livet 47, i motsetning til den ikke-transgene mus der melanocytter lokalisere til dermis i hårsekkene. Med den K14-Scf transgenet inkorporert, blir epidermis pigmentert med den bestemte melanin pigmentene karakteristisk for pigmentetstamme av dyr en. K14-SCF mus på C57BL / 6 genetisk bakgrunn med villtype MC1R signale har jet-svart hud preget av svært høye nivåer av eumelanin pigment. Ikke overraskende har disse dyrene er sterkt UV-bestandig. I kontrast, genetisk matchet K14-SCF C57BL / 6 dyr som er bærere en mutant inaktive MC1R har nesten ingen eumelanin i overhuden. I stedet, disse "forlengelse" dyr (MC1R e / e) har en fair hudfarge forårsaket av deponering av pheomelanin pigment (figur 1A) og er mye mer UV-sensitive 48-49.

Farmakologiske forbindelser med kjemiske egenskaper som tillater gjennomtrengning inn i huden har vist seg å være kraftige indusere eumelanin i forlengelsen (MC1R e / e) K14-Scf dyremodell ved direkte manipulering av cAMP-nivåene i epidermale melanocytter i huden. Melanin oppregulering i denne modellen har vært reported av adenylat cyclase aktivering 1, så vel som fosfodiesterase 4 inhibering 35.. I denne artikkelen viser vi forberedelse og lokal applikasjon av forskolin i forlengelse (MC1R e / e) K14-SCF dyr som modell lyshudet UV-sensitive menneske. Vi viser at to ganger daglig påføring av medikamentet fremmer akselerert melanization, at huden mørkere skyldes epidermal avsetning av melanin pigment og det induserte epidermal melanin beskytter mot UV-indusert solbrent ved måling av "minimal erytematøs dose" (MED) 48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av Forskolin for lokal administrasjon fra en Crude Root Extract av Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Plant

  1. Protokoller for murine eksperimenter fulgt retningslinjene for etisk opptreden i stell og bruk av dyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Kentucky (Protokoll # 00768M2004). Roten ekstrakt består ved 40% vekt / volum i en standard dermatologiske base av 70% etanol, 30% propylenglykol.
  2. Vei 200 g rå forskolin rot ekstrakt og overføre den til et begerglass. For at 500 ml av en 40% (vekt / volum) løsning, resuspendere 200 g rå forskolin rot ekstrakt ved å legge til de fleste, men ikke alle av volumet av kjøretøyet (70% etanol, 30% propylenglykol) og bringe løsningen på omtrent 450 ml.
  3. Omrør i en time ved romtemperatur. Løsningen vil være noe tyktflytende og kan kreve manuell agitasjon til "løfte" pakke inn i løsningen førat rørestav er i stand til å ta over.
  4. Etter en time med omrøring, helles blandingen inn i en gradert sylinder og bringe volumet til 500 ml ved hjelp av kjøretøy som er blitt brukt til å "skylle" begerglasset som ble anvendt til omrøring av oppslemmingen (for å maksimere utvinningen av forskolin fra begerglasset) .
  5. Overfør oppslemmingen til 50 ml polypropylen sentrifugerør. Sentrifuge (1500 x g, romtemperatur, 15 minutter) under anvendelse av en bordsentrifuge. På dette tidspunkt, vil det uoppløselige materialet være relativt komprimert, slik at den overliggende væske for å være lett helles av.
  6. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 mikrometer celluloseacetat-membran for å fjerne eventuell gjenværende uløselig materiale fra ekstrakten. Vi benytter en flasketoppsystem som er utformet for cellekultur, sammen med bruk av forfilter som følger med enheten for å forhindre for tidlig gjentetting av membranen fra uoppløselige komponenter i rot ekstrakt. Ved å lage store mengder av ekstraktet, filtrerer omtrent 100 ml om gangen, endring av forfilteret betlom hver ekstra volum.
  7. Ved lagring i romtemperatur, opprettholder ekstrakt biologiske aktiviteten opp i inntil ett år.

2. Utarbeidelse av C57Bl / 6 K14-Scf Mus for Aktuelt Behandlinger

  1. Fjern rygg pels fra dyrene ved elektrisk klipping. Kort bedøve dyrene med inhalasjon isofluran å lette avskjæring av rygg pels med elektriske sakser utstyrt med en 0,25 mm kirurgisk forberedende hode (Fisher Scientific). Helst bare bruke én type anestesi (f.eks ketamin / xylazin) for å minimere risikoen for bedøvelse overdose. Den mettet innånding kammeret bærer yrkesmessig risiko når det brukes utenfor en avtrekkshette og leverer ukjente mengder bedøvelse for dyr. Ideelt en presisjonsfordamper skal brukes.
  2. For å fjerne rester av hår stubbene, behandle dyrene med et kjemisk hårfjerningskrem. Administrer anestesi til dyret med en ip-injeksjon av ketamin 40 mg / kg xylazin og 4 mg / kg Når dyrene er tilstrekkelig bedøvet (som bedømmes av tå klype), bruke en fingertupp-størrelse mengde Hårfjerningskrem til skåret rygg huden ved hjelp av en hansker finger. Gni kremen inn i huden i 30-60 sekunder eller inntil hårene kan tydelig sees i fløten etter hvert som den beveges rundt. La kremen på bare for det minimum av tid som kreves for hårfjerning som langvarig eksponering fører til kjemisk forbrenning av huden, epidermal sammenbrudd og død fra tap av epidermal integritet.
  3. Tørk dorsal huden med vann-gjennomvåt gasbind pads gjentatte ganger til all kremen er fjernet. Tørre dyr ved hjelp av myke papirhåndklær, og tillate dem å komme seg i en varm bortgjemt sted (f.eks rene bur plassert på en oppvarming pad). Fjerne håret dyrene en etter en, og følge nøye med gjennom hele prosedyren.

Tre. Aktuelt Administrasjon av Forskolin eller kjøretøykontroll

  1. Dyr skal behandles, ett om gangen. Kort bedøve med inhalererd isofluran ved å plassere musen på toppen av en form montert nylon luft-gjennomtrengelig filteret under som har blitt plassert en isoflurane mettet tørkepapir i en isoflurane mettet lokk klar glasskrukke i et avtrekksskap. Eksponer medier isofluran i en tilstrekkelig tid for å undertrykke frivillige muskulære bevegelser, men for å bevare spontan respirasjon (vanligvis 10-20 sek.) Leaving dyret i isofluran for lang vil resultere i undertrykkelse av luftveiene og død. Det er bedre å feile på siden av "går lyset", og at du må eksponere musen kort til mer isoflurane snarere enn å over-eksponere dyret til stoffet og risiko død.
  2. Ta dyret fra isofluran kammeret og legg på en ren absorberende benk pad.
  3. Ved hjelp av en 1000 mL mikropipette utstyrt med en disponibel polypropylen tips, utarbeide 400 mL av 40% olje forskolin ekstrakt (kjøretøykontroll dyr vil motta 70% etanol, 30% propylenglykol alene).
  4. Overfør ekstrakt påryggen på dyret ved å dryppe den inn i huden, og deretter, ved hjelp av på siden av pipettespissen, smøre ekstraktet over rygghuden inntil alt huden har blitt dekket. Det er ingen grunn til å utslette huden etter påføring.
  5. Returner musen til buret sitt, og nøye observere før den gjenoppretter fra anestesi.
  6. For at ikke-pigment cAMP effekter ikke skal forvirre UV følsomhet eksperimenter, avvikle alle aktuelle behandlinger to dager før UV-eksponering (pigment effekten varer i flere dager utover sist aktuell behandling).

4. Hudfarge Måling av reflekterende Fargemetrikk

  1. Kort bedøve mus med inhalert isofluran (se ovenfor).
  2. Kalibrere en Minolta fargemåler ved å plassere den bærbare hodet på den standardiserte hvit overflate som følger med colorimeter.
  3. Plasser måle portable hodet av colorimeter flukt med rygghuden på dyret å sikre at en cm 2. runde perforertee er fullstendig trykket inn i huden. Ta minst tre separate målinger på forskjellige områder av dorsal hud.
  4. Beregn gjennomsnitts L * poengsum ± SD per dyr og per behandlingsgruppe. Reflekterende kolorimetri kan gjøres når som helst i forsøket.

5. Bestemmelse av UV-følsomhet ved beregning av "Minimal Erytematøst Dose" (MED)

  1. Bruk dyr som har blitt forbehandlet med enten vehikkel eller forskolin som beskrevet ovenfor. Bedøve dyrene med intraperitoneal injeksjon av en standard blanding av ketamin og xylazin (se ovenfor).
  2. Forbered et stykke UV-okklusiv tape for MED testing. For å generere hull i tapen, bruk en kraftig hullemaskin med en 1 cm 2 sirkulær cutout (Tall 2A og B). Etter å ha hull av en definert størrelse, og symmetrisk arrangement i båndet letter gjenkjenning av endringer i huden etter bestråling. Over hvert hull i tapen, påfør en liten, men lett avtagbar brikke av tape som kan fjernes ved definerte tider under UV-eksponering for å tillate administrasjon av forskjellige UV-doser.
  3. Når dyrene er tilstrekkelig bedøvet, plassere tape på framsiden. Eye smøremiddel bør alltid brukes under narkose.
  4. Slå på UV kilde som består av to Westinghouse F15T8UV-B lamper med en topp produksjon på 313 nm og en rekke 280-370 nm. La lampen likevekt til en konstant UV-utgang som måles av en UV-fotometer med en UVB-sensor (vanligvis tar et par minutter for lampene å varme opp).
  5. På grunnlag av UV-overføringshastigheten målt ved UV-fotometer, beregne UV-eksponeringstiden for hver ønsket dose. For eksempel vår lampens UVB utgangs tiltak 2,4 mW / cm 2. Derfor, for å administrere 5 kJ / m 2, vil huden må være eksponert for 208 sekunder (som er 3 min og 28 sek) av UVB-stråling, som beregnet under:
    upload/50670/50670eq1.jpg "/>
  6. Plasser bedøvede dyr (hver med okklusiv tape på plass) ventral overflaten ned for å sikre jevn UV-eksponering. For administrasjon av de valgte doser av UV-stråling, sekvensielt fjerne de små okklusive bånd som dekker hullene for å eksponere en 2 cm områder av huden på de korrekte doser av stråling. Derfor, ved bruk av den ovennevnte eksempel, hvis 40 kJ / m 2 er den største dose i eksperimentet, og dyret ville være under lampen i 27 min og 47 sek, og total huden på 40 kJ / m 2 betingelse ville ikke ha noen liggende tape hele tiden. Imidlertid vil båndet ligger over 5 kJ / m 2 tilstand bli fjernet når det er 208 sek igjen i eksponeringen. Timing av tape fjerning bør gjøres slik at hver tilstand slutter samtidig.
  7. Etter UV-eksponering, løsner tapen fra rygghuden forsiktig, tar seg ikke å rive huden med plutselige eller altfor kraftfulle bevegelser. Plasser dyrene i en varm rolig sted å tillategjenvinning fra anestesi.
  8. Overvåk mus i 24-48 timer for å lete etter diskrete områder av erytem (rødhet) eller ødem (svelling) svarende til de anatomiske områder som utsettes for den spesifikke dose av UV-bestråling. Dokumentere hud funn fotografisk.
  9. MED verdi svarer til den minste dose av UV som forårsaker inflammasjon som definert av erytem og / eller ødem av hele utsettes kretsen av huden. Merk at pigmentering av huden kan utfordre fastsettelse av MED, derimot, erytem og ødem kan fortsatt generelt være nøyaktig vurdert, delvis takket være den definert form av åpningene i båndet under UV-eksponering.

6. Statistisk analyse

Analysere data mellom kohorter av mus ved en vei ANOVA med Bonferroni post test (Graf Pad PRISM). P-verdier <0,05 anses statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C57BL / 6 mus ble generert på eumelanotic, pheomelanotic eller amelanotisk bakgrunn som omfatter K14-Scf transgenet som beskrevet (figur 1A). Årskull av lyshudet forlengelse (MC1R e / e, Tyr + / +) ble mus behandlet lokalt med to ganger daglige doser av enten bil (70% etanol, 30% propylenglykol) eller 40% olje Coleus forskohlii rot ekstrakt (80 mikrometer per dose) for 5 dager (Figur 2b). Effekter av aktuelle behandlinger på epidermal pigmentering ble bestemt både ved visuell inspeksjon og ved reflekterende kolorimetri (Figur 1B). Bruk av rot ekstrakt ble assosiert med robuste epidermal mørkere i K14-Scf transgen bakgrunn, men ikke i genetisk-matchet ikke-transgene dyr. Vi tolker disse resultatene å indikere at interfollicular epidermal melanocytter må være tilstede for at farmakologisk indusert melanin som skal deponeres i epidermis. Selv om roten-ekstrakt er dypt farget på grunn av tilstedeværelsen av plante fytokjemikalier foruten forskolin, kan skin mørkere ikke utelukkende på grunn av en farging virkning av stoffet, som ikke-transgene dyr som ikke klarer å utvise av hudfarge med roten ekstrakt (figur 1B). Når anvendt i et to ganger daglig måte kan melanizing effekter av ovenfra tilført forskolin bemerkes i så lite som 2 dager, selv om maksimal mørkere blir realisert etter flere dager (figur 1C). Grad av melanization er doseavhengig, slik som vist ved Fontana-Masson melanin farging av dorsal hud seksjoner behandlet med forskjellige konsentrasjoner av medikamentet (fig. 1D).

Deretter ble effekten av topisk-påført forskolin on UV følsomhet bestemmes ved MED testing i forlengelsen mus (MC1R e / e, Tyr + / +) som beskrevet ovenfor (figurene 2 A og B). MED besluttsomhet ble sammenlignet mellom aniMals behandlet med en akselerert behandling (to ganger om dagen administrasjon for 5 dager, 10 totalt doser) versus en standard tilnærming (én gang daglig i 15 dager, 15 totalt doser). Ikke-transgene mus ble inkludert for å kontrollere for ikke-melanin legemiddeleffekter. Begge behandlinger resulterte i tilsvarende mengder hud mørkere i forskolin-behandlet K14-SCF dyr. Spesielt L * (reflekterende kolorimetri hvit-svart skala) verdier for forskolin-eksponerte dyrene var 31,9 ± 1,8 og 31,1 ± 1,6 for akselerert program kontra standard program, henholdsvis. Det var ingen åpenbare toksiske effekter fra forskolin eksponering i noen av behandlingsgruppene, og dermed konkluderte vi med at akselerert forskolin administrasjon (to ganger om dagen for 10 totaldoser, 80 mikrometer per dose) fremmet trygg melanization av rygghuden så effektivt som det brukt tidligere (en gang om dagen for 15 totaldoser, 80 mikrometer per dose).

Forskolin-indusert epidermal melanization resulterte idyp UV-beskyttelse som bedømmes av MED (Tall 2C-D). Dermed mens bety MED for K14-SCF forlengelse mus behandlet for to ganger for 5 dager med bilen var 5,0 ± 0,0 kJ / m 2, gjennomsnittlig MED for kohorter behandlet med lokal forskolin var> 30,0 ± 0,0 kJ / m 2 (Tall 2 A og C). Faktisk kan en dose på 30,0 kJ / m 2 var tilstrekkelig til å generere erytem i dette forsøk. Ved hjelp av standard forskolin dosering (en gang om dagen for 15 totaldoser, 80 mikrometer per dose), fant vi at gjennomsnittlig MED for K14-SCF forlengelse mus behandlet med forskolin var 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (figur 2 B, D). Viktigere, gjorde forskolin forbehandling ikke påvirke MED av dyr ute av stand melanization, enten på grunn av mangel på K14-SCF-medierte epidermal melanocytter (Tall 2C, D) eller på grunn av tyrosinase mangel (figur 2E). Siden Forskolin søknader var disfortsatt to dager før UV-eksponering og ble ikke videreført etter UV-eksponering, konkluderer vi at ikke-pigmentary cAMP effekter ikke spille en rolle i MED resultater. Snarere dataene tyder på at epidermal melanization var mekanismen som forskolin indusert UV-beskyttelse i denne modellen.

Figur 1
Figur 1. Lokalbehandling av forskolin fremmer huden mørkere i lyshudet forlengelse (MC1R e / e) mus. (A) Fotografier av C57BL / 6 dyr brukt i denne studien. Planter er genetisk tilpasset unntatt ved melanocortin 1-reseptoren (MC1R) og tyrosinase (Tyr) loci. Merk at pigmentering er eumelanotic (sort) når MC1R er funksjonell, men pheomelanotic (blondish) når MC1R er defekt, slik tilfellet er medforlengelse (MC1R e / e) mutant. Epidermal pigmentering avhenger oppbevaring av interfollicular epidermal melanocyttene i huden ved K14-Scf transgenet, og kan lett bli sett i ørene. (B) Fotografier av forlengelse (MC1R e / e) K14-Scf eller ikke-transgene dyr behandlet med 400 ul av kontroll over kjøretøyet (70% etanol 30% propyl-glykol) eller 40% w / v (80 uM) forskolin påført to ganger daglig på det barberte rygghuden i 5 dager, totalt 10 anvendelser. Hudfarge målinger av reflekterende kolorimetri ble utført for hver gruppe. Reflekterende kolorimetri resultatene rapporteres som gjennomsnitt (± SD) reflektometri enheter på L * (svart-hvitt) farge aksen. Merk at lokal administrasjon av forskolin forårsaket robust hud mørkere i K14-SCF transgene dyr, men ikke i ikke-transgene mus. (C) Tid kurs eksperiment som viser mørkere forskolin behandlet øret av K14-Scfskjøte mus for de angitte tider (Forskolin-behandlet ører er indikert med blå trekanter). Kjøretøyet ble brukt på høyre øre for sammenligning. (D) Fontana-Masson farget hud seksjoner tatt fra dyr behandlet med de angitte doser av forskolin som beskrevet. Klikk her for å se større figur .

Fig. 2
Figur 2. Forskolin-indusert melanization beskytter mot UV-formidlet inflammasjon, bestemt ved minimal erytematøs dose (MED) testing. (A, B) Plassering av UV-okklusiv båndet og UVB doser av dyrene behandlet to ganger daglig i 5 dager (A, C) og en gang daglig i 15 dager (B, D, E) med enten vehikkel eller forskolin. Th e siste aktuell behandling ble brukt 48 timer før bestråling. Rygghuden ble utsatt for forskjellige doser av UVB ved hjelp av UV-okklusiv tape med utstanset 1 cm 2 sirkulære åpninger, og varierende eksponeringstider for å gi den riktige dose. Etter bestråling ble de sirkler av hud som er merket med en penn i noen eksperimenter. MED er definert ved erytem og / eller ødem av hele sirkelen av hud til en bestemt dose, ble bestemt 48 timer etter eksponering. Den MED ± SD resultatene rapporteres som kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0.001. (E) Hudfarge reflectometry og MED verdier for tyrosin-mangel K14-SCF albino forlengelse mus behandlet i 10 dager med kjøretøy eller forskolin. Klikk her for å se større figur .

70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Figur 3. Generelt skjema av forsøket. Kohorter av forlengelsen (MC1R e / e) K14-Scf eller ikke-transgene dyr ble fremstilt ved å fjerne den dorsale fur av elektrisk skjæring og / eller kjemisk hårfjerning. Dyrene ble deretter behandlet med topiske anvendelser av enten kjøretøy (70% etanol, 30% propylenglykol) eller med 40% råolje forskolin ekstrakten ved de doseringsregimene angitt. Effekter på huden pigmentering ble dokumentert fotografisk, kolo og ved Fontana-Masson melanin flekker. UV sensitivitet ble bestemt ved minimal erytematøs dose (MED) testing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ved hjelp av en dyremodell av lyshudet menneske, finner vi at lokal applikasjon av en forskolin-rik olje rot ekstrakt robust mørkner overhuden ved å stimulere produksjonen av melanin i huden. Epidermal melanization er avhengig av ekspresjonen av stamcellefaktor i basal epidermis, som forekommer i human hud, men ikke i genetisk modifiserte muse hud. Den dorsale hud på genetisk-modifiserte mus mangler tilstrekkelig antall interfollicular melanocytter å bibringe pigment i huden. Bare i innstillingen av konstitutiv ekspresjon av et melanocyte vekstfaktor slik som stamcellefaktor (kit ligand) eller hepatocytt-vekstfaktor (HGF) kan melanocytter bli beholdt i basallaget av epidermis gjennom hele livet av dyret 50-51. Vår dyremodell av virkelig human hud er basert på inkorporering av den K14-Scf transgenet til skjøte pigment variant av C57BL / 6 murine linje. Selv om dyr i alle aldre kan værebrukt, våre eksperimenter involverer typisk ung voksen (4-12 ukers alder) mus. På grunn av en avkortet melanocortin en reseptor (MC1R) som fører til tap av cAMP signalering, forlengelse mus uttrykke pheomelanin fortrinnsvis i pelsen og huden (i K14-SCF eller HGF-Met transgene stater) snarere enn eumelanin 52-54. Som følge av endret ekspresjon melanin, K14-SCF forlengelse mus er mye mer UV-sensitive enn deres MC1R-villtype motstykker, som har sort huden på grunn av tallrike avsetning av epidermal eumelanin pigment 1.. Vi tenkte at siden eumelanin produksjonen er sterkt redusert i innstillingen av en mutant MC1R, at farmakologiske stoffer som etterligner MC1R signale kan redde eumelanin produksjon. MC1R er en G s-koblet transmembrane reseptor som, etter binding av sin høye affinitet ligand α-melanocyte stimulerende hormon (α-MSH), sender pro-differensieringssignaler til melanocyte cytoplasma via adenylyl cyclase aktivering og produksjon av andre messenger cAMP. Dermed har vi en hypotese om at lokal applikasjon av forskolin, en celle-gjennomtrengelig diterpenoid som er en potent direkte aktivator av adenylyl cyclase, kan være i stand til å fremme eumelanin produksjon i MC1R-defekt, pheomelanotic tilstand.

Ved hjelp av renset forskolin for disse studier, viste seg imidlertid kost-prohibitive. Tidlige eksperimenter bestemme den minste mengde som kreves for forskolin epidermal mørkere i K14-Scf forlengelse modell foreslått at maksimal mørkere oppstått ved bruk av en 40% vekt pr volum løsning ved hjelp av rå ekstrakt som inneholdt 20% (vekt per vekt) av forskolin. Vi regner med at påføring av 400 pl av en 8% endelig forskolin (vekt pr volum, 40% x 20%) oppløsning ville resultere i levering av ca 80 uM av forskolin til den dorsale hud hver applikasjon. Selvfølgelig, mye av avgitt doseikke er absorbert av huden, istedenfor å være fuktet opp av omliggende pels eller falle av dyret på tidspunktet for anvendelse. Således er det vanskelig å rapportere den eksakte dose innsett at dyrene mottar med hver applikasjon av legemidlet. Ikke desto mindre, når den anvendes på denne måte, forskolin resulterer i robust induksjon av pigment-enzymer i huden og produksjon av eumelanin. Faktisk, K14-SCF transgene dyr demonstrert forlengelse klart mørkere i huden etter den andre applikasjon (figur 1C).

Selv om vi har tidligere publisert av hudfarge med en daglig påføring av medikamentet 1,48-49, her viser vi at to ganger daglig applikasjon er forbundet med robust epidermal mørkere og signifikant UV-beskyttelse, noe som tyder på at farmakologisk induserte melanization kan bli optimalisert ved administrering av medikament oftere enn en gang om dagen. Skin mørkfarging, noe som skyldes eumelanin induksjon i epidermis, varer sålenge aktuelle forskolin behandlinger videreføres. Selv kronisk applikasjon (gjennom tre måneder) virket godt tolerert av mus 49. Økningen i huden mørkere skyldes melanin-syntese snarere enn spredning av melanocytter i epidermis. 49.. Når aktuelle behandlinger er avviklet, huden gradvis fades tilbake til sin opprinnelige fair hudfarge (mer enn 2-3 uker) som epidermal melanin er tapt med normal fornyelse keratinocyte. Mørkere hud kan lett bestemmes av enkel visuell inspeksjon av mus, men hudfarge kan kvantifiseres objektivt ved hjelp av reflekterende kolorimetri 55-56. Denne metoden er en ikke-invasiv rask og smertefri fremgangsmåte for måling av hudfarge. Farge kan være nøyaktig beskrevet ved hjelp av L * a * b * (LAB) fargerom modell 57-58.

For disse eksperimentene vi er avhengige av en rå rot ekstrakt av Coleus forskolii anlegget, den naturlige kilden til forskolin. Dette preparatetble anvendt på grunn av de høye kostnadene ved å utføre disse eksperimenter med renset forskolin. Dette eksperimentet, for eksempel, kreves omtrent 2 g av forskolin totalt for to ganger daglig applikasjon til seks dyrene i fem dager. 2 g av kommersielt tilgjengelig HPLC-rensede forskolin ville koste mer enn $ 20.000, sammenlignet med mindre enn $ 5 for den rå ekstrakt. Selv renset forskolin indusert epidermal melanin i vår dyremodell 1, kan vi ikke utelukke mulige effekter av andre plante-avledet forbindelser i råoljen rot ekstrakt inkludert alkaloider, fenoler og tanniner. Faktisk, tidligere arbeid ved hjelp av marsvin eller menneskelige hud eksplantater antydet at forbindelsene i råoljen rot ekstrakt kan fremme kutan absorpsjon av forskolin 59. Som enda imidlertid identiteten og mekanismen til disse forbindelsene er imidlertid ukjent. Dermed kan vi ikke utelukke endre effekten av andre forbindelser til stede naturlig i råolje rot ekstrakt.

Den forsterket forskolin blandingen eren mørkebrun væske med et attraktivt krydder-aktig aroma som er lett å påføre på huden for topisk påføring. Fordi det uløselige materiale er blitt fjernet, går daglig applikasjon uten skorpedannelse eller avleiringer når absorbert av huden. Selv om råoljen rot ekstrakt er mørkebrun når den er fremstilt på denne måte, er huden mørkfarging forårsaket av medikamentet ikke bare et fargestoff virkning, som vist ved det faktum at lokal påføring av forbindelsen på dyr ute av stand til huden melanization (f.eks MC1R e / e tyrosinase -mangel albino dyr eller ikke-transgene mus som mangler epidermal melanocytter) hadde ingen effekt på huden mørkere (Tall 1B og 2E). Vi ser på disse eksperimentene som proof-of-concept demonstrasjoner som manipulering av cAMP i huden kan indusere UV-beskyttende mørk hud pigmentering. Imidlertid er det usannsynlig at topisk administrering av forskolin er en mulig eller praktisk terapeutisk alternativ på grunn av ikke-spesifikk natur av medikamentet. Jegndiscriminate og ikke-målrettet aktivering av adenylyl cyclases og induksjon av cAMP kan forventes å forårsake uakseptable toksisitet. Viktigere, andre har vist at lokal administrasjon av en fosfodiesterase 4-hemmer (Rolipram), potent oppregulert melanin i K14-Scf forlengelse dyremodell, som beviser at cutaneous cAMP induksjon og melanization kan oppnås ved alternative farmakologisk målretting 35. Åpenbart før aktuell manipulering av cAMP-nivåer i huden kan bli oversatt for menneskelig bruk, vil sikkerheten må vurderes nøye. Likevel, våre data tyder sterkt på at farmakologisk indusert melanization er UV-beskyttende som bestemmes av minimal erytematøst dose (MED) testing.

I sammendraget, lokal administrasjon av forskolin, en adenylyl cyclase aktivator, resulterte i en sterk melanization av epidermis av en murine modell av lyshudet menneske basert på defekte cAMP signale nedstrøm av en defekt melanocortin-reseptor 1 (MC1R). Epidermal melanization var UV-beskyttende, målt ved minimal erytematøs dose (MED) testing. Vi hypotese at farmakologisk cAMP manipulasjon kan ikke bare redde UV-beskyttende eumelanization av epidermis, men andre MC1R-avhengige UV-beskyttende tiltak i tillegg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke Malinda Spry for teknisk assistanse. Vi erkjenner også nåværende og tidligere finansieringskilder: National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will sak Cancer Research Fund, Markey Cancer Foundation, Barnas Miracle Network og Jennifer og David Dickens Melanoma Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20% Buckton Scott USA Inc. n/a Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP Butler Schein NCD 11695-6776-1 Dublin, OH, USA
Xylazine Anased Injection LA04612 Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP Putney NDC 26637-411-01 St. Joseph, MO, USA
Ethanol Decon Labs. 2705
Propylene glycol Adesco 05751L Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair Church Dwight JF-11 4381322 Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B Westinghouse F15T8UV-B
Radiometer photometer International light 1LT400A Peabody, MA,USA
Chromameter Konica Minolta CR-400 Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400 Konica Monilta DR-400 Ramsey, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
  2. Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. 126-770 (1990).
  3. Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
  4. Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
  5. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
  6. Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
  7. Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
  8. Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
  9. Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
  10. Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
  11. Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
  12. Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
  13. Tucker, M. A. Melanoma epidemiology. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 23, 383-395 (2009).
  14. Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
  15. Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
  16. Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
  17. Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
  18. Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
  19. Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
  20. Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
  21. Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
  22. Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
  23. Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
  24. Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35, 193-199 (2009).
  25. Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
  26. Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
  27. Slominski, A., Wortsman, J. Neuroendocrinology of the skin. Endocr. Rev. 21, 457-487 (2000).
  28. Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
  29. Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
  30. Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
  31. Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
  32. Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
  33. Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
  34. Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U. Melanocortins in human melanocytes. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52, 75-78 (2006).
  35. Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
  36. Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. (2012).
  37. Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
  38. Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
  39. Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. (2009).
  40. Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
  41. Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
  42. Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
  43. Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
  44. Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
  45. Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
  46. Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
  47. Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
  48. Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
  49. Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
  50. Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
  51. Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. 187-1565 (1998).
  52. Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
  53. Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
  54. Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
  55. Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
  56. Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
  57. Anderson, R. R., Parrish, J. A. The optics of human skin. J. Invest. Dermatol. 77, 13-19 (1981).
  58. Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
  59. Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats