Farmakologisk Induktion av epidermal melanin och skydd mot solbränna i en humaniserad musmodell

Published 9/07/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

Epidermal melanin induceras genom lokal applicering av forskolin i en musmodell av ljushyade UV-känslig människa. Farmakologisk manipulation av cAMP-nivåer i huden och epidermal mörknar kraftigt skyddar mot UV-medierad inflammation (solbränna), mätt med den minsta erytematösa dosen (MED)-analys.

Cite this Article

Copy Citation

Amaro-Ortiz, A., Vanover, J. C., Scott, T. L., D'Orazio, J. A. Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model. J. Vis. Exp. (79), e50670, doi:10.3791/50670 (2013).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Rimlighets av hud, UV-känslighet och risk hudcancer alla korrelera med den fysiologiska funktionen av melanokortin en receptor, en G s-kopplad signalering protein som finns på ytan av melanocyter. Mc1r stimulerar adenylylcyklas och cAMP produktionen som i sin tur, uppreglerar melanocytisk produktionen av melanin i huden. För att studera de mekanismer genom vilka Mc1r signalering skyddar huden mot UV-skador, bygger denna studie på en musmodell med "humaniserad hud" baserad på epidermal uttryck för stamcellsfaktor (SCF). K14-SCF-transgena möss behåller melanocyter i epidermis och därför har förmågan att sätta in melanin i överhuden. I denna djurmodell, vild typ Mc1r status ger robust nedfall av svart eumelanin pigment och en UV-skyddad fenotyp. Däremot K14-SCF-djur med defekt Mc1r signalering förmåga uppvisar en röd / blond pigmentering, mycket lite eumelanin i huden ochen UV-känslig fenotyp. Resonemang som eumelanin nedfallet skulle förstärkas av aktuella ämnen som efterliknar Mc1r signalering, fann vi att en direkt tillämpning av forskolin extrakt på huden hos Mc1r-defekt ljushyade möss resulterade i robust eumelanin induktion och UV-skydd 1. Här beskriver vi den metod för att framställa och använda en forskolin innehåller naturliga rotextrakt till K14-SCF ljushyade möss och redovisa en metod för att mäta UV-känslighet genom att bestämma minimal erytematös dos (MED). Med hjälp av denna djurmodell, är det möjligt att studera hur epidermal cAMP induktion och melanin i huden påverkar fysiologiska reaktioner på UV-exponering.

Introduction

Förekomsten av melanom, den mest dödliga formen av hudcancer, har ökat dramatiskt under de senaste decennierna i USA, särskilt bland ljushyade individer. Stark molekylär och epidemiologiska bevis blandar in UV-strålning som en viktig orsakande miljöfaktor 2-5. Ökad UV-exponering i form av solexponering och solarium användning kommer sannolikt att vara ansvarig för en stor del av ökningen av melanom incidensen 6-7. Melanom risk förefaller särskilt kopplat med solbränna 8, särskilt de tidigt i livet 9-10. Risk för solbränna är kopplad inte bara till dos och intensitet av UV-exponering, utan också av ärftliga faktorer som påverkar kutan reaktion på UV-strålning. Hud pigmentering är en av de viktigaste faktorerna för UV-känslighet, risken för solbränna och cancerrisk. Melanom uppträder ungefär tjugo gånger oftare hos ljushyade personer jämfört med mörkhyade individuals 11-13.

Melanin, ett pigment som produceras av melanocyter i epidermis, är den viktigaste faktorn för hudfärg. Melanin kommer i två stora sorter: (1) eumelanin, en mörkbrun / svart pigment effektiv på att absorbera energin från UV-strålning, och (2) pheomelanin en rödaktig / blond pigment mindre effektiv på att förhindra penetrering av UV-fotoner in i huden. Hudfärg, UV-känslighet och melanom risker till stor del bestäms av epidermal eumelanin halt 14-15. Ju mer eumelanin i epidermis, kan mindre UV-fotonerna tränger in i huden. På grund av låga medfödda nivåer av eumelanin, ljushyade människor är mycket mer benägna att akuta och kroniska effekter av UV-strålning 16-18.

Hudpigmentering, melanom risk och förmåga att "solbränna" efter UV-exponering alla korrelerar med signaleringsförmåga av melanokortin en receptor (Mc1r), ett Gs-coupled sju transmembrana surface receptor på melanocyter 19-22. När Mc1r binder dess besläktade hög affinitetsligand, α-melanocytstimulerande hormon (α-MSH), finns det aktivering av adenylylcyklas och produktion av den andra budbäraren cAMP 23. Den normal fysiologisk reaktion i huden efter UV-exponering inkluderar epidermal produktion av α-MSH av keratinocyter 24-29. Vi och andra hypotes är att keratinocythärledda α-MSH binder till Mc1r på epidermala melanocyter, initiera nedströms produktion av cAMP andra budbärare genom aktivering av adenylylcyklas 30. cAMP-nivåer kontrollerar många aspekter av melanocyte differentiering, inklusive överlevnad vägar, DNA-reparation och pigmentsyntes. Mc1r signalering och cAMP tydligt framkalla pigmentenzymnivåer och eumelanin produktion. När Mc1r signalering är intakt och melanocytiska cAMP-nivåer är robusta, är eumelanin produceras och huden mörknar. Men om Mc1r signalering är defekt ochcytoplasma cAMP-nivåerna fortfarande låga, är pheomelanin produceras istället 1. Eumelanin syntes kan stimuleras farmakologiskt av agenter som höjer cAMP-nivåer 1,14,31-35.

Eftersom Mc1r proteinet är en viktig regulator av melanom risken för människor från 36 till 46, är vi intresserade av mekanismer genom vilka Mc1r skyddar melanocyter mot UV-inducerad karcinogenes. Som grund för våra studier, vi genererat en transgen Mc1r-variant musmodell på en ren C57BL / 6 genetisk bakgrund 1. I denna modell, stamcellsfaktor (SCF) uttrycks konstitutivt i de basala epidermis och epidermala interfollikulära melanocyter hålls kvar i huden under hela livet 47, i motsats till den icke-transgena möss i vilka melanocyter lokalisera till dermis i hårsäckarna. Med K14-Scf transgen införlivas, blir epidermis pigmenterad med den speciella melaninpigment karakteristisk av pigmentetstam av djur 1. K14-SCF-möss på C57BL / 6 genetisk bakgrund med vildtyp Mc1r signalering har kolsvart hud kännetecknas av mycket höga nivåer av eumelanin pigment. Inte överraskande, dessa djur är mycket UV-resistent. Däremot genetiskt matchade K14-SCF-C57BL / 6 djur som hyser en mutant inaktiv Mc1r har nästan ingen eumelanin i epidermis. Istället dessa "förlängning" djur (Mc1r e / e) har en ljus hy hy orsakas av nedfall av pheomelanin pigment (Figur 1 A) och är mycket mer UV-känsliga 48-49.

Farmakologiska föreningar med kemiska egenskaper som möjliggör penetration in i huden har visats ge en potent inducera eumelanin i förlängningen (Mc1r e / e) K14-Scf djurmodell genom att direkt manipulera cAMP-nivåer i epidermala melanocyter i huden. Melanin uppreglering i denna modell har renoveeported av adenylylcyklas aktivering 1 samt fosfodiesteras 4-hämning 35. I den här artikeln visar vi att förbereda och lokal applicering av forskolin i förlängningen (Mc1r e / e) K14-SCF-djur som modell för ljushyade UV-känslig människa. Vi visar att två gånger dagligen tillämpning av läkemedlet främjar accelererad melanin, det mörkare hud beror på epidermal nedfallet av melanin pigment och som framkallade epidermal melanin skyddar mot UV-inducerad solbränna genom mätning av "minimal erytematös dos" (MED) 48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av forskolin för topisk administration från en Rå rotextrakt av Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Växt

  1. Protokoll för murina experiment följde riktlinjerna för etiskt uppförande i skötsel och användning av djur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Kentucky (protokoll # 00768M2004). Roten extraktet består vid 40% vikt / volym i en vanlig dermatologisk bas av 70% etanol, 30% propylenglykol.
  2. Väg upp 200 g rå forskolin rotextrakt och överföra den till en bägare. För att göra 500 ml av en 40% (vikt / volym) lösning, återsuspendera 200 g rå forskolin rot extrakt genom tillsats av de flesta men inte alla av volymen hos fordonet (70% etanol, 30% propylenglykol) och bringa lösningen till ca 450 ml.
  3. Rör om under en timme vid rumstemperatur. Lösningen blir något trögflytande och kan kräva manuell agitation till "lyft" extraktet i lösning föreomröraren är i stånd att ta över.
  4. Efter en timmes omrörning, häll blandningen i en graderad cylinder och bringa volymen till 500 ml med användning av fordon som har använts för att "spola ut" bägaren som användes för att röra om slammet (för att maximera återvinningen av forskolin från bägaren) .
  5. Överför uppslamning till 50 ml polypropen-centrifugrör. Centrifugera (1500 xg, rumstemperatur, 15 min) med användning av en bordscentrifug. Vid denna punkt, kommer det olösliga materialet vara relativt kompakterad, så att den överstående vätskan för att lätt kunna hällas av.
  6. Filtrera lösningen genom ett 0,22 | im cellulosaacetat-membran för att avlägsna eventuellt kvarvarande olösligt material från extraktet. Vi använder en flasktopp som är utformat för cellodling, tillsammans med användning av pre-filter som följer med enheten för att förhindra för tidig igensättning av membranet från olösliga komponenter i rot extrakt. Vid stora volymer av extraktet, filtrera ca 100 ml i taget, ändra förfiltret satsninglan varje tillsatt volym.
  7. Vid förvaring i rumstemperatur, extraktet bibehåller biologisk aktivitet upp i upp till ett år.

2. Beredning av C57BL / 6 K14-Scf möss för utvärtes behandlingar

  1. Ta rygg-päls från djuren genom elektrisk klippning. Kortfattat söva djuren med inhalational isofluran för att underlätta klippning av ryggpäls med elektriska saxar utrustade med en 0,25 mm kirurgisk förberedande huvud (Fisher Scientific). Helst bara använda en typ av anestesi (t.ex. ketamin / xylazin) för att minimera risken för bedövningsmedel överdos. Den mättade inhalationskammare bär yrkesrisk vid användning utanför ett dragskåp och levererar okända mängder bedövningsmedel för djur. Helst en precision Vaporizer ska användas.
  2. För att ta bort kvarvarande hår stubb, behandla djuren med en kemisk hårborttagningsprodukter. Administrera anestesi till djur med en ip-injektion av ketamin 40 mg / kg och xylazin 4 mg / kg När djuren är tillräckligt sövd (enligt bedömning med tå nypa), tillämpa en fingerstor mängd hårborttagningskräm till klippt rygg huden med en handske finger. Gnid in krämen i huden under 30-60 sekunder eller tills hårstrån kan tydligt ses i grädden när den flyttas runt. Lämna krämen på endast för den tid som krävs för hårborttagning såsom långvarig exponering leder till kemisk förbränning av huden, epidermal nedbrytning och död från förlust av epidermal integritet.
  3. Torka den dorsala huden med vattenindränkta gaskuddar upprepade gånger tills alla kräm har avlägsnats. Torra djur med hjälp av mjuka pappershanddukar, och ger dem möjlighet att återhämta sig i en varm avskilt läge (t.ex. rena burar placerade på en uppvärmning pad). Vaxning varar djuren en-för-en och noggrant övervaka hela förfarandet.

3. Topisk administrering av forskolin eller vehikelkontroll

  1. Djur ska behandlas en åt gången. Söva korthet med andasd isofluran genom att placera musen ovanpå en formanpassad nylonluftgenomsläppligt filter under vilken har placerats en isofluran mättad pappershandduk i en isofluran mättad lockförsedda klart glasburk i ett dragskåp. Exponera musen för att isofluran under en tillräcklig tid för att undertrycka frivilliga muskelrörelser utan att bevara spontanandning (typiskt 10-20 s). Att lämna djuret i isofluran för länge kommer att resultera i andnings förtryck och död. Det är bättre att fela på sidan av "gå lätt" och att behöva exponera musen kort till mer isofluran snarare än att överexponera djuret till drogen och risk död.
  2. Ta bort djuret från isofluran kammaren och placera på en ren, absorberande bänkdyna.
  3. Med användning av en 1000 | il mikropipett utrustade med en engångs polypropylen spets, upprätta 400 pl av 40% råforskolinextrakt (vehikel kontrolldjur erhåller 70% etanol, 30% propylen ensamt glykol).
  4. För över extraktet påbaksidan av djuret genom att droppa på den på huden och sedan, med hjälp av den sida av pipettspetsen, smeta extraktet över den dorsala huden tills alla huden är täckt. Det finns inget behov att torka på huden efter applicering.
  5. Återgå musen till sin bur, och noggrant observera tills den återhämtar sig från anestesi.
  6. För att icke-pigment cAMP effekter inte ska förväxla UV känslighetsexperiment, avbryta alla utvärtes behandlingar 2 dagar före UV-exponering (pigment effekten varar flera dagar längre än förra lokal behandling).

4. Hudfärg Mätning av Reflective Kolorimetri

  1. Söva kort på musen med inhalerade isofluran (se ovan).
  2. Kalibrera en Minolta kolorimeter genom att placera den bärbara huvudet på den standardiserade vita ytan försedd med kolorimeter.
  3. Placera den portabla mäthuvudet av kolorimetern i jämnhöjd med den dorsala huden hos djuret att säkerställa att en cm 2 runda aperture är fullständigt pressas mot huden. Ta minst tre separata mätningar i olika delar av rygghuden.
  4. Beräkna medelvärdet L * poäng ± SD per djur och per behandlingsgrupp. Reflekterande kolorimetri kan göras när som helst i experimentet.

5. Fastställande av UV-känslighet genom Beräkning av "Minimal Erytematöst Dos" (MED)

  1. Använd djur som har förbehandlats med antingen bil eller forskolin som beskrivits ovan. Söva djuren med en intraperitoneal injektion av en standardblandning av ketamin och xylazin (se ovan).
  2. Förbered en bit UV-ocklusiv tejp för MED-testning. För att generera hål i tejpen, använd en kraftig hålslag med en 1 cm 2 cirkulär utskärning (fig. 2A och B). Att ha hål i en definierad storlek och symmetriska arrangemang i bandet underlättar erkännandet av hudförändringar efter bestrålning. Under varje hål i tejpen, applicera en liten men lätt löstagbar pjäs av band som kan tas bort vid fastställda tidpunkter under UV-exponering för att möjliggöra administration av olika UV-doser.
  3. När djuren är tillräckligt sövd, placera tejpen på rygg ytan. Ögon smörjmedel ska alltid användas under narkos.
  4. Sätt på UV-källan bestående av två Westinghouse F15T8UV-B-lampor med en toppeffekt på 313 nm och ett intervall av 280-370 nm. Låt lampan till jämvikt till en konstant UV-utgång mätt med en UV-fotometer med en UVB-sensor (i regel tar några minuter för lamporna att värma upp).
  5. Baserat på UV-transmissionshastighet, mätt med UV-fotometer, beräkna UV exponeringstid för varje önskad dos. Till exempel, vår lampa är UVB åtgärder utgångs 2,4 mW / cm 2. Därför, för att administrera 5 kJ / m 2, skulle huden behöva utsättas för 208 sek (vilket är 3 min och 28 sek) av UVB-strålning, beräknat enligt nedan:
    upload/50670/50670eq1.jpg "/>
  6. Placera sederade djur (var och en med ocklusiv tejp på plats) ventrala ytan ner för att se till och med UV-exponering. För att administrera de valda doser av UV-strålning, i tur och ordning ta bort de små ocklusiva band som täcker hålen för att exponera 1 cm 2 hudområden till rätt doser av strålning. Därför, med hjälp av ovanstående exempel, om 40 kJ / m 2 är den största dosen i experimentet, då djuret skulle vara under lampan för 27 min och 47 sek totalt och huden i 40 kJ / m 2 skick skulle ha någon liggande band hela tiden. Dock skulle tejpa ligger över 5 kJ / m 2 tillstånd tas bort när det finns 208 sek kvar i exponeringen. Tidpunkt för band avlägsnande bör göras så att varje villkor slutar samtidigt.
  7. Efter UV-exponering, dra av tejpen från den dorsala huden noga, noga med att inte slita huden med plötsliga eller alltför kraftfulla rörelser. Placera djur i en varm lugn plats för att låtaåterhämtning från anestesi.
  8. Övervaka möss för 24 till 48 timmar för att leta efter diskreta områden av erytem (hudrodnad) eller ödem (svullnad), som motsvarar de anatomiska platser som utsätts för den specifika dosen av UV-bestrålning. Dokumentera hud fynd fotografiskt.
  9. MED-värdet motsvarar den lägsta dosen av UV som orsakar inflammation enligt definitionen erytem och / eller ödem av hela den exponerade cirkeln av hud. Observera att pigmentering av huden kan utmana bestämning av MED dock erytem och ödem kan fortfarande generellt uppskattas exakt, delvis tack vare den definierad form av öppningarna i bandet under UV-exponering.

6. Statistisk analys

Analysera data mellan grupper av möss med en ANOVA med Bonferroni post test (Graph Pad PRISM). P-värden <0,05 anses statistiskt signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

C57BL / 6 möss alstrades på eumelanotic, pheomelanotic eller amelanotiska bakgrunder som innehåller den K14-Scf transgenen såsom beskrivits (Figur 1A). Kohorter av ljushyad förlängning (Mc1r e / e, Tyr + / +) möss behandlades lokalt med två gånger dagligen med antingen fordon (70% etanol, 30% propylenglykol) eller 40% rå Coleus forskohlii rotextrakt (80 ^ M per dos) under 5 dagar (Figur 2B). Effekter av utvärtes behandlingar på epidermal pigmente bestämdes både visuellt och genom reflekterande kolorimetri (Figur 1B). Tillämpning av rot extrakt var förknippad med robust epidermal mörkn i K14-Scf transgen bakgrund men inte i genetiskt matchade icke-transgena djur. Vi tolkar dessa resultat tyda på att interfollikulära epidermala melanocyter måste vara närvarande för att farmakologiskt inducerad melanin som skall deponeras i den epidermis. Though rotextrakt är djupt färgade på grund av närvaron av växt fytokemikalier förutom forskolin kan mörkare hud inte enbart på grund av en färgning verkan från läkemedlet, som icke-transgena djur som misslyckas att uppvisa mörkare hud med roten extrakt (Figur 1B). När den appliceras på en två gånger dagligen sätt, melanizing effekter av lokalt applicerade forskolin kan noteras i så lite som två dagar, även om maximal mörkn realiseras efter flera dagar (Figur 1C). Grad av melanin är dosberoende, såsom visas av Fontana-Masson melanin färgning av rygghuden sektioner som behandlats med olika koncentrationer av läkemedlet (figur 1D).

Därefter undersöktes effekten av lokalt applicerade forskolin på UV-känslighet bestäms av MED-testning i förlängnings möss (Mc1r e / e, Tyr + / +) enligt ovan (figur 2 A och B). Med beslutsamhet jämfördes mellan aniMals behandlas med en accelererad läkemedelsbehandling (två gånger om dagen administration för 5 dagar, 10 totalt doser) jämfört med en standardmetod (en gång dagligen administration i 15 dagar, 15 totalt doser). Icke-transgena möss med för att kontrollera för icke-melanin läkemedelseffekter. Båda behandlingarna resulterade i liknande mängder mörkare hud i forskolin-behandlad K14-SCF-djur. Specifikt L * (reflekterande kolorimetri vit-svart skala) värden för forskolin-exponerade djur var 31,9 ± 1,8 och 31,1 ± 1,6 för accelererad tillämpning kontra standard ansökan, respektive. Det fanns inga uppenbara toxiska effekter från forskolin exponering i alla behandlingsgrupper, därför drog vi slutsatsen att accelererad forskolin administrering (två gånger om dagen för 10 totaldosen, 80 ^ M per dos) främjade säkert melanin av rygghuden så effektivt som det tidigare använda (en gång om dagen i 15 totalt doser, 80 ^ M per dos).

Forskolin-inducerad epidermal melanin gavdjupa UV-skydd som bedöms av MED (figur 2C-D). Således, medan detta MED, K14-SCF-förlängnings möss behandlade för två gånger i 5 dagar med fordonet var 5,0 ± 0,0 kJ / m 2, i snitt MED, cohorts behandlade med topisk forskolin var> 30,0 ± 0,0 kJ / m 2 (fig. 2 A och C). Faktum är att en dos av 30,0 kJ / m 2 var otillräcklig för att generera erytem i detta experiment. Använda standardforskolin dosering (en gång om dagen i 15 totalt doser, 80 ^ M per dos), fann vi att i genomsnitt MED för K14-SCF-förlängnings möss som behandlats med forskolin var 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (Figur 2 B, D). Viktigt gjorde forskolin förbehandling inte påverka MED djur som inte kan melanin, antingen på grund av brist på K14-Scf-medierade epidermala melanocyter (figur 2C, D) eller på grund av tyrosinas brist (Figur 2E). Eftersom forskolin applikationer var disfortsatte 2 dagar före UV-exponering och har inte fortsatt efter UV-exponering, drar vi slutsatsen att icke-pigment cAMP effekter inte spelade en roll i MED-resultat. Snarare tyder data på att epidermal melanin var den mekanism genom vilken forskolin inducerad UV-skydd i denna modell.

Figur 1
Figur 1. Lokal behandling av forskolin främjar mörkare hud i ljushyad förlängning (Mc1r e / e) möss. (A) Fotografier av C57BL / 6 djur som användes i denna studie. Djur är genetiskt matchade utom vid melanocortin 1 receptorn (Mc1r) och tyrosinas (Tyr) loci. Observera att pigmentering är eumelanotic (svart) när Mc1r är funktionell men pheomelanotic (blondish) när Mc1r är defekt, vilket är fallet medförlängning (Mc1r e / e) mutant. Epidermal pigmentering beror på bevarande av interfollikulära epidermala melanocyter i huden av K14-Scf transgenen, och kan lätt ses i öronen. (B) Fotografier av förlängningen (Mc1r e / e) K14-Scf eller icke-transgena djur som behandlats med 400 ^ il vehikelkontroll (70% etanol 30% propyl-glykol) eller 40% vikt / volym (80 ^ M) forskolin appliceras två gånger dagligen på den rakade rygghuden för 5 dagar, totalt 10 applikationer. Hudfärg mätningar av reflekterande kolorimetri utfördes för varje grupp. Reflekterande kolorimetri Resultaten redovisas som medelvärde (± SD) reflektometri enheter på L * (svart-vit) färg axel. Observera att lokal administrering av forskolin orsakade kraftig hud mörkare i K14-SCF-transgena djur, men inte i icke-transgena möss. (C) Tidsförlopp experiment visar mörkfärgning av forskolin behandlade öra K14-Scfförlängnings möss för de angivna tiderna (forskolin-behandlade öron anges med de blå trianglar). Fordons applicerades på det högra örat för jämförelse. (D) Fontana-Masson färgade hud sektioner från djur som behandlats med de angivna doserna av forskolin som beskrivs. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Forskolininducerad melanin skyddar mot UV-medierad inflammation bestämt med minimal erytematös dos (MED) testning. (A, B) Placering av UV-ocklusiv tejp och UVB doser av djur som behandlats två gånger dagligen i 5 dagar (A, C) eller en gång dagligen i 15 dagar (B, D, E) med antingen bil eller forskolin. Th e sista topisk behandling anbringades 48 h före bestrålning. Dorsal hud exponerades för olika doser av UVB genom användning av UV-ocklusiv tejp med utstansade 1 cm två cirkulära öppningar, och varierande exponeringstider för att ge den rätta dosen. Efter bestrålning, var cirklar av exponerad hud märkt med en penna i vissa experiment. MEDs, definierad av erytem och / eller ödem av hela kretsen av exponerad hud till en viss dos, bestämdes 48 timmar efter exponering. Den MED ± SD resultat rapporteras som kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0,001. (E) Hudfärg reflectometry och MED värden för tyrosin-brist K14-SCF-albino förlängnings möss som behandlats i 10 dagar med fordon eller forskolin. Klicka här för att visa en större bild .

70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Figur 3. Övergripande schema av experimentet. Kohorter av förlängningen (Mc1r e / e) K14-SCF-eller icke-transgena djur framställdes genom avlägsnande av den dorsala fur av elektrisk skjuvning och / eller kemisk depilation. Djur behandlades sedan med aktuella tillämpningar av antingen vehikel (70% etanol, 30% propylenglykol) eller med 40% råforskolinextrakt av doseringsscheman angivna. Effekter på huden pigmentering dokumenterades fotografiskt, kolorimetriskt och Fontana-Masson melanin färgning. UV-känslighet bestämdes genom minimal erytematös dos (MED) testning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med hjälp av en djurmodell av den ljushyade människor, finner vi att lokal applicering av en forskolin rika rå rotextrakt mörknar kraftigt överhuden genom att stimulera melaninproduktionen i huden. Epidermal melanin är beroende av expression av stamcellfaktor i de basala epidermis, vilket förekommer i human hud, men inte i genetiskt omodifierade mushud. Den dorsala huden av genetiskt omodifierade möss saknar tillräckligt antal interfollikulära melanocyter för att ge pigment på huden. Endast i inställningen av konstitutivt uttryck av en melanocytstimulerande tillväxtfaktor såsom stamcellsfaktor (kit-ligand) eller hepatocyttillväxtfaktör (HGF) kan melanocyter hållas kvar i basalskiktet av epidermis under hela livslängden för det djur 50-51. Vår djurmodell av den ljushyade människa är baserad på införlivandet av K14-Scf transgen i förlängningen pigment variant av C57BL / 6 mus linje. Även djur i alla åldrar kan varaanvänds våra experiment innebär vanligen unga vuxna (4-12 veckor gamla) möss. På grund av en stympad melanocortin 1 receptor (Mc1r) som leder till förlust av cAMP-signalerings-, förlängnings möss uttrycker pheomelanin preferentiellt i pälsen och huden (i K14-SCF-eller HGF-Met transgenic stater) snarare än eumelanin 52-54. Som ett resultat av förändrad melaninuttryck, K14-SCF-förlängnings möss är mycket mer UV-känsliga än sina mc1r-vildtyp motsvarigheter, som har kolsvart huden på grund av rikligt förekommande avsättning av epidermal eumelanin pigment 1. Vi resonerade att eftersom eumelanin produktionen kraftigt minskat i inställningen av en mutant Mc1r, att farmakologiska stimulantia som efterliknar Mc1r signalering kan rädda eumelanin produktion. Mc1r är en G s-kopplade transmembranreceptor som, vid bindning av sin hög-affinitetsligand α-melanocytstimulerande hormon (α-MSH), sänder pro-differentieringssignaler till melanocyte cytoplasman via adenylylcyklas aktivering och produktionen av den andra budbäraren cAMP. Sålunda antog vi att topisk applicering av forskolin, en cell-permeabel diterpenoid som är en potent direkt aktivator av adenylylcyklas, skulle kunna främja eumelanin produktionen i Mc1r defekta, pheomelanotic tillstånd.

Att använda renat forskolin för dessa studier, men visade sig vara kostsamt. Tidiga försök avseende den minsta mängd av forskolin krävs för epidermal förmörkning i K14-Scf förlängning modell föreslog att maximal mörkn uppstått med användningen av en 40% vikt per volym lösning med användning av råextrakt, som innehöll 20% (vikt per vikt) av forskolin. Vi beräknar att applicering av 400 pl av en 8% slutlig forskolin (vikt per volym, 40% x 20%) lösning skulle resultera i avgivning av ungefär 80 pM forskolin att rygghuden varje applikation. Naturligtvis mycket av avgiven dosinte absorberas av huden, i stället bli blöt upp av omgivande päls eller falla av djur vid tidpunkten för ansökan. Därför är det svårt att redovisa exakt insåg dosen som djuren får med varje tillämpning av läkemedlet. Ändå, när det tillämpas på detta sätt, forskolin ger robust induktion av pigment enzymer i huden och produktion av eumelanin. Faktum K14-SCF-transgena förlängnings djur visade tydligt mörkfärgning av huden efter den andra ansökan (Figur 1C).

Även om vi tidigare har publicerat mörkare hud med daglig applicering av läkemedlet 1,48-49, här visar vi att två gånger dagligen ansökan är förknippad med robust epidermal förmörkning och signifikant UV-skydd, vilket tyder på att farmakologisk-inducerad melanin kan optimeras genom administrering av drogen oftare än en gång om dagen. Mörkare hud, vilket beror på att eumelanin induktion i epidermis, varar sålänge som utvärtes forskolin behandlingar fortsätter. Även kronisk ansökan (via tre månader) verkade väl tolererat av mössen 49. Ökningen av mörkare hud beror på melaninsyntes snarare än spridning av melanocyter i epidermis. 49. När lokal behandling upphört, huden gradvis bleknar tillbaka till sitt ursprungliga ljus hy (mer än 2-3 veckor) som epidermal melanin förloras med normal förnyelse keratinocyte. Mörkfärgning av huden lätt kan bestämmas genom enkel visuell inspektion av mössen, men hudfärg kan kvantifieras objektivt med hjälp av reflekterande kolorimetri 55-56. Denna metod är en icke-invasiv snabbt och smärtfritt förfarande för mätning av hudfärgen. Färg kan vara korrekt beskrivna med hjälp av L * a * b * (LAB) färgrymd modell 57-58.

För dessa experiment vi förlitat sig på en rå rot extraktet av Coleus forskolii växt, den naturliga källan för forskolin. Denna beredninganvändes på grund av den höga kostnaden för att utföra dessa experiment med renade forskolin. Detta experiment, till exempel, krävs ungefär 2 g av forskolin totalt för två gånger dagligen ansökan till sex djur i fem dagar. 2 g av kommersiellt tillgänglig HPLC-renat forskolin skulle kosta mer än $ 20.000, jämfört med mindre än $ 5 för råextraktet. Även renat forskolin inducerad epidermal melanin i vår djurmodell 1, kan vi inte utesluta eventuella effekter av andra vegetabiliska ämnen i rå rotextrakt inklusive alkaloider, fenoler och tanniner. Faktum är att tidigare arbete med marsvin eller mänsklig hud explants föreslog att föreningar i rå rot extrakt kan främja kutan absorption av forskolin 59. Detta har dock, identiteten och mekanismen för dessa föreningar är fortfarande okända. Vi kan alltså inte utesluta att modifiera effekterna av andra föreningar som finns naturligt i rå rot extrakt.

Den kompounderade forskolin blandningen ären mörkbrun vätska med en attraktiv krydda liknande arom som lätt kan appliceras på huden efter topisk applicering. Eftersom de olösliga material har tagits bort, daglig ansökan lämnar ingen skorpbildning eller insättningar gång absorberas av huden. Även om den råa rotextrakt är mörkbrun, om den framställs på detta sätt, är mörkare hud som induceras av läkemedlet inte bara en dye effekt, vilket framgår av att topisk applicering av föreningen på djur är oförmögna att hudens melanin (t.ex. Mc1r e / e tyrosinas -brist albinodjur eller icke-transgena möss som saknar epidermala melanocyter) hade ingen effekt på huden mörkare (figur 1B och 2E). Vi ser dessa experiment som proof-of-concept demonstrationer som manipulation av cAMP i huden kan framkalla UV-skyddande mörk hudpigmentering. Det är dock osannolikt att lokal administrering av forskolin är ett möjligt eller praktiskt behandlingsalternativ på grund av den icke-specifika karaktären av drogen. Jagndiscriminate och icke öron aktivering av adenylyl cyclases och induktion av cAMP kan förväntas orsaka oacceptabla toxicitet. Huvudsakligen har andra visat att lokal administrering av en fosfodiesteras 4-hämmare (Rolipram), potent uppreglerat melanin i K14-Scf förlängning djurmodell, som bevisar att kutan cAMP induktion och melanin kan uppnås genom alternativa farmakologiska inriktning 35. Helt klart före aktuell manipulation av cAMP-nivåer i huden skulle kunna översättas för humant bruk, kommer dess säkerhet måste utvärderas noggrant. Trots våra data tyder starkt på att farmakologiskt inducerad melanin är UV-skyddande bestämt med minimal erytematös dos (MED) testning.

Sammanfattningsvis lokal administrering av forskolin, en adenylylcyklas aktivator, resulterade i en kraftig melanin av epidermis i en musmodell för ljushyade människor på grundval defekt cAMP signalering nerström av en defekt melanokortin en receptor (Mc1r). Epidermal melanin var UV-skyddande, mätt med minimal erytematös dos (MED) testning. Vår hypotes är att farmakologisk cAMP manipulation kan inte bara rädda UV-skyddande eumelanization av överhuden, men andra Mc1r-beroende UV-skyddande svar också.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Malinda Spry för tekniskt stöd. Vi erkänner också nuvarande och tidigare finansieringskällor: National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), den Wendy Will Fall Cancer Research Fund, den Markey Cancer Foundation, Barnens Miracle Network och Jennifer och David Dickens Melanoma Research Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Coleus Forskoli extract 20% Buckton Scott USA Inc. n/a Princeton, NJ
Isothesia, Isoflurane , USP Butler Schein NCD 11695-6776-1 Dublin, OH, USA
Xylazine Anased Injection LA04612 Shenandoah, Iowa, USA
Ketamine HCl, USP Putney NDC 26637-411-01 St. Joseph, MO, USA
Ethanol Decon Labs. 2705
Propylene glycol Adesco 05751L Solon, OH, USA
Depilatory cream, Nair Church Dwight JF-11 4381322 Priceton, NJ
EQUIPMENT
Germicidal Hg Lamp UV-B Westinghouse F15T8UV-B
Radiometer photometer International light 1LT400A Peabody, MA,USA
Chromameter Konica Minolta CR-400 Ramsey, NJ, USA
Data Processor for Chromameter CR-400 Konica Monilta DR-400 Ramsey, NJ, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
  2. Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. 126-770 (1990).
  3. Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
  4. Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
  5. Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
  6. Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
  7. Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
  8. Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
  9. Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
  10. Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
  11. Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
  12. Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
  13. Tucker, M. A. Melanoma epidemiology. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 23, 383-395 (2009).
  14. Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
  15. Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
  16. Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
  17. Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
  18. Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
  19. Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
  20. Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
  21. Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
  22. Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
  23. Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
  24. Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35, 193-199 (2009).
  25. Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
  26. Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
  27. Slominski, A., Wortsman, J. Neuroendocrinology of the skin. Endocr. Rev. 21, 457-487 (2000).
  28. Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
  29. Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
  30. Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
  31. Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
  32. Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
  33. Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
  34. Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U. Melanocortins in human melanocytes. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52, 75-78 (2006).
  35. Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
  36. Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. (2012).
  37. Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
  38. Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
  39. Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. (2009).
  40. Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
  41. Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
  42. Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
  43. Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
  44. Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
  45. Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
  46. Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
  47. Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
  48. Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
  49. Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
  50. Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
  51. Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. 187-1565 (1998).
  52. Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
  53. Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
  54. Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
  55. Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
  56. Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
  57. Anderson, R. R., Parrish, J. A. The optics of human skin. J. Invest. Dermatol. 77, 13-19 (1981).
  58. Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
  59. Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats